材料和试剂

动物
成人（男性和女性，8 - 10周龄）C57BL / 6J小鼠从JAX实验室（巴港，ME，USA）购买。允许小鼠在动物设施中适应一周。小鼠分组饲养并保持在12个小时与房间反向光/暗周期一个受控的温度（22±2℃）和湿度（50％）。老鼠可以在自己的笼子里免费享用水和食物。在黑暗周期中进行训练，并且每周至少记录一次体重。

柠檬酸芬太尼（NIDA药物供应计划，美国马里兰州贝塞斯达）
蔬菜甘油（基本ê lements，博尔德，CO，USA，可用甲MAZON; UPC代码：703610139756）
丙二醇（MP Biochemicals，目录号：151957）
辣椒素（AK Scientific，目录号：N735-5g）
乙醇200证明（Pharmco-Aaper，目录号：111000200）
Narcan套件（在药房有售）

设备

钱伯斯
甲irtight室被定制，以顺序和从透明有机玻璃（由图URE 1 ）（拉霍亚酒精研究，拉霍亚，CA，USA）。这些可以是鼻腔或杠杆压力腔。

Nosepoke房间
两个鼻孔（直径1厘米）彼此相对安装在侧壁上，离地面1.5厘米。白色的灯泡安装在鼻孔内。所述蒸汽输送口被安装在壁中的一个或在腔室的门，从腔室地板7厘米。排气（吸气）端口安装在其中一壁上，最好与蒸气传输端口相对，距腔室底部12厘米。

注意：您可以用鼻腔代替杠杆腔：内部和外部尺寸相同。操纵杆和提示灯分别安装在左右墙壁上。操纵杆距地板1.5厘米，提示灯距地板6.5厘米。蒸汽输送口和排气口s的位置与鼻腔相似。

箱体围栏
Ť他室被放置在黑色有机玻璃外壳以噪声和光最小化。外壳可以容纳四个或八个单独的腔室，具体取决于外壳的大小。

蒸发器：SVS250蒸发器（美国俄勒冈州科学蒸气公司）
药液罐：TFV8 X-婴儿SMOK罐，4米升（深圳IVPS技术，目录号：TC005301000 ）
储罐线圈：V8 X-Baby Q2，0.4Ω双线圈（深圳IVPS技术，目录号：TA104301000 ）
排气系统
Ť该系统的他的目标是产生在操作性室，该驱动器蒸气进入室负压力，然后将其清除出：一个空气压缩泵（75 DG模型HK-25L ;发酵，目录号：E307612 ），其产生真空吸气的一端连接到腔室，另一端连接到在线式一次性HEPA-Cap过滤器（Whatman 6702-3600 hepa-Cap 36，Cole Parmer ，目录号：EW-29700-92）上（图1B ）。然后将来自HEPA过滤器的管道连接到设施的排气系统。

图1 。蒸汽Ç hamber设置。一。d ifferent蒸汽室装置的组成部分：（1），其中芬太尼溶液负载罐; （2）汽化器；（3）流量计；（4）相对壁上的鼻孔；和（5）的排气口连接到真空抽吸泵。图片来源：NIDA的Maria Ortiz。乙。画出蒸汽室设置，包括气流动力学，抽吸泵的，和HEPA过滤器。在乙对应于第号码OSE在A.内蒙古d蒸汽室中厘米被指示的imensions; 所述腔室的内部体积为〜5大号。泵产生负压，该负压确定腔室内的空气流速。由泵产生的总负压由连接泵之间的流量计测量所述红色棒的（〜16升/分钟） -从所有的室管。我们通过在排气口和泵的管路之间连接一个流量计-红条b（4 L / min）来测量每个腔室中的总气流。要检查是否该室是气密性，我们测量所述进气口之间的气流的从蒸发器管道-红色条℃; 如果这与在排气口附近（红色条b处）测得的来自腔室的总气流不匹配，则表明该腔室不是气密的，必须解决泄漏问题。转载自/改编自Moussawi等。（2020）。©作者，保留部分权利；独家被许可人，美国科学促进会。根据知识共享署名No nCommercial License 4.0（CC BY-NC）分发，网址为http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/。

空气流量控制器（Dwyer，型号：VFA-23-SSV ）
Med关联硬件（Med Associates，美国佛蒙特州费尔法克斯）：
DIG-700G（解码卡– PCI）

DIG-704PCI-2（接口卡– PCI）

SG-6080D（sm所有桌面柜+电源（120 V / 60 Hz））

SG-210CB（DB-25智能控制电缆，M / F，25'（7.6 m）

DIG-716（SmartCtrl TM接口模块，4进/ 8出）

SG-716（SmartCtrl TM连接面板，4 in / 8 out）

软件

MedPC （Med Associates，美国佛蒙特州费尔法克斯）
的GraphPad Prism（V版为8，格拉夫派得软件，圣地亚哥，CA，USA）

程序

开始实验之前
准备和处理的芬太尼解决方案
处理任何形式的芬太尼（粉剂，溶液或蒸气）时，请穿戴个人防护设备（PPE），包括手套，隔离衣，口罩和护目镜，因为芬太尼具有很高的亲脂性，并且容易被皮肤和粘膜吸收。张贴在哪里芬太尼处理的房间门上的纸条，表明需求的全面PPE和提醒不来接触任何物体在房间里不戴手套，以避免意外曝光。进行蒸气自我管理的实验室的门应关闭。我们建议员工在不太可能发生的意外暴露和芬太尼毒性的情况下，使用Narcan试剂盒。
芬太尼储备溶液（20 mg / ml ）：制备80％植物甘油（VG，400毫升）和20％丙二醇（PG，200毫升）的储备溶液。6米添加升无菌水至1g芬太尼。涡旋该溶液，然后加入44米升VG / PG库存。声处理的温浴中，在50℃持续1个小时或直到该芬太尼完全溶解。车辆控制解决方案是VG / PG（80/20）。
芬太尼自用实验溶液（5 mg / ml）：用VG / PG稀释储备溶液至所需浓度。对于5毫克/ m的溶液升，混合5米升贮备液用15米升（以5mg / ml总20毫升芬太尼）VG / PG。
辣椒素掺假芬太尼：P repare辣椒素溶解在100％乙醇中10毫克/毫升（10毫克在1ml）的储备液。辣椒素是一种强刺激性物质。我们建议对其进行称重，并使用完整的PPE在通风橱中准备储备溶液。将0.04 ml辣椒素储备溶液添加到20 ml预先准备的5 mg / ml芬太尼溶液（0.2％辣椒素）中。根据不同的实验装置和流动的动力学的腔室中的蒸汽，一个M AY需要调整辣椒素浓度（0.1 - 0.3％），以确保它不高，足以使所述主动杆的完全避免，但强大到足以显着抑制药物自我管理。辣椒素的用于给定实验的最佳浓度可以在1个FR1下中训练的小鼠的导频队列来确定- ħ会话（短的访问），直到它们到达一个respon稳定本身连续3个会话。允许小鼠自我施用芬太尼-染的辣椒素，持续两个1小时。该目标是有一个50 -蒸气交付减少75％，在第二会话（穆萨维等人。，2020）。如果在第二阶段中蒸汽输送量降至零，则辣椒素浓度过高，需要降低。在这种情况下，一个持久的一个d可能出现的诗句效果，在小鼠没有恢复到基线自我管理水平以下暴露于辣椒素。
校准蒸气室
V aporizing具有或不具有在稠密白色蒸气云芬太尼结果VG / PG溶液。我们校准我们的系统以使蒸气在每次输送蒸气后在腔室内持续不超过1分钟。腔室的小尺寸和汽化设置允许蒸气均匀分布在整个腔室中，并在一分钟内去除。

在腔室的蒸气暴露的持续时间主要取决于3个可调因素的相互作用：1）气化时间：我们使用1.5 - 3秒; 2）蒸发器功率设置：我们通常将其设置在60 W（作为推荐用于特定类型的线圈的那我们使用）; 3）室内的气流。气流主要取决于抽吸泵的功率。泵可以被连接以同时多于一个的腔室，设置的是它产生足够的空气流。空气-流过每个腔室中，假设该腔室是气密，通过两个入口点进入系统：1）流量计; 2）储罐阀（我们将其保持在打开位置）（图1 ）。的总和的空气-流动通过这两个路径（通过连接在红色条流量计测量Ç ，在图1B）等效于通过所述腔室的总流量（通过在红色条连接流量计测量b ，在图1B；在我们的设置中约为4 L / min /腔。空气-流动在各两个路径（流量计和罐阀）不利地影响流过的其他路径的; 吨herefore，以增加或减少的蒸气流进入腔室，我们减少或增加的流过所述流量计，分别。我们喜欢的空气-流过罐为大约2升/分钟，所以我们流量计设定为2升/分钟（通过室= 4升/分钟的总流量）。

以确保该室气密是，在红色条测得的流量b必须等于在在红色条流Ç （图1B ）; ø therwise，这表明该腔室没有气密和所述蒸气流被损害。这可能是由于连接松动，腔室门密封条损坏，螺钉松动或P型有机玻璃破裂引起的。我们建议每周执行一次校准，以最大程度减少整个疗程中药物暴露的差异。

准备操作程序
一个LL操作性程序是通过程序性的MedPC软件。设置实验所需的适当参数：提示，超时，汽化持续时间和加固时间表（FR 1、3、5等）。在我们的实验中，我们主要使用FR1计划，其中每个主动的鼻戳或杠杆压力触发蒸发器持续1.5 s（设置为60 W），从而产生蒸汽（图2）。有关较高FR时间表下的自我管理数据，请参阅原始手稿（Moussawi等人，2020年）。每次蒸气输送后都有60 s的超时时间，在此期间提示灯被打开。记录超时期间的按下次数，但没有任何后果。超时时间取决于芬太尼蒸气从腔室中清除的时间。记录了无效的压杆操作或爆震动作，但没有程序性后果。

对于第一行为人会话中，我们设置限制为蒸气交付的最大数量（〜5），以避免过度曝光芬太尼，由于将小鼠随机探索室，而不必学习实验意外事件。

对于第三个长-访问会话，我们也限制蒸气交付（〜一十二分之三十零H）的最大数目，因为小鼠倾向于芬太尼蒸气狂欢在第一对长的-访问训练课（穆萨维等人。，2020）。

可选：在开始采集会话之前，只需将它们放在手术室中30-60分钟，即可将它们栖息在手术室中。在习惯性锻炼过程中，主动按下杠杆或放气不会引起程序性后果。

芬太尼蒸气自给药方案
打开该MedPC接口柜和电脑。
向罐中注入芬太尼或车辆用溶液。对车辆，芬太尼和辣椒素掺入的芬太尼使用单独的储罐。
将水箱拧到蒸发器上。
关闭所有腔室的门。
所有测试室，以确保该芬太尼/车辆正常蒸发，空气-流是整个室与室之间均匀。这可以执行或者通过按压在蒸发器的红色“火”按钮约1秒或通过预编程MedPC程序。
如果没有蒸汽流动：Ç alibrate再次腔室，以确定是否有空气-流相关的问题，例如，泄漏在一个腔室（见上文潜在原因步骤A2校正部分），罐盖子未闭合，连接松动，管堵塞与冷凝蒸汽，或者一个饱和的HEPA过滤器。解决的相应问题来解决问题。
其他可能性：牛逼他坦克线圈被烧坏导致故障蒸发解决方案，该罐停止药物，或将蒸发器不能识别的自动线圈。
注：热板不应该被打开，直到所有的蒸汽已被清除。

加载MedPC自我管理程序。
线室地板š用棉片（阿尔法垫;动物专业和规定，克敦，PA，USA），以吸收尿液。
称量动物和P花边他们在相应室。
对芬太尼和媒介物小鼠使用单独的隔室（推荐）。
为雄性和雌性小鼠使用单独的隔室（推荐）。
如果需要更长的时间，请使用地板上的食物杯和吸管在腔室内提供食物和水。
关闭所有闩锁。
关闭腔室外壳。
启动自我管理会话。
如果小鼠不容易获取自身给药行为后2个采集会话，特别是在与杠杆按压代替鼻子触碰室，花生酱的小涂片可加入到所述活性探鼻端口或杆（塔等人，2019），以鼓励操作员回应。停止使用的花生酱，一旦小鼠已回应上的活动operandum。

在会议结束时，将小鼠从手术室中取出，然后放回他们的家笼中。丢弃棉垫并彻底清洁腔室。
请使用与有机玻璃兼容的水基清洁剂。
每次使用辣椒素后，请彻底清洁管路（除尘器罐或空气压缩机）和腔室，因为微量的辣椒素可能足以破坏其性能。
丢弃任何污染芬太尼（即，手套，纸巾，化妆棉，等在医学病理废物（MPW）框）。

数据分析

我们分析d和情节特德用GraphPad（第8版，格拉夫派得软件，圣地亚哥，CA，USA）的数据。我们使用d吨-tests（成对或不成）和方差（ANOVA;单向或双向的，具有或不具有重复测量）的分析，以不同的组和操作性respon比较SES到活性与无活性的手法。适当吨-tests和方差分析我们重新雇用使用测试，诸如普通的数据分发和方差齐性的确认后编的夏皮罗-威尔克和列文均匀性试验。我们使用ð Sidak的或邦费罗尼的测试进行事后比较，磨片再恰当。我们还使用线性回归模型对逐步升级数据进行了分析，以说明时间的单向影响。为了确保该模型WA小号适用于数据和有WA期从线性没有出发，我们使用ð的重复测试。统计意义WA S设定在P ≤ 0.05。所有的数据表示为在均值的平均值和标准差。回归模型被表示为的平均值和95％置信区间（图2）。

图2 。实例数据显示芬太尼蒸气自我给药逐步升级。小鼠逐渐增强芬太尼蒸汽自我管理期间长-访问会话（LGA芬）。线性回归分析显示荷兰国际集团正斜率为LGA芬组（A = 4.04，CI：2.46-5.62），其是大于0（F显著更大（1，158）= 25.53，R 2 = 0.14，P <0.0001 ）。斜率小号为所述短访问芬太尼（SHA-芬）和长访问车辆（LGA-VEH）组没有差异从0（A = -0.058，CI：-0.33至0.22和α= -0.64，CI： -1.92至0.63 ，分别地），这表明在这些基团中不存在升级。d ATA表示为的平均± SEM ，* P ＜0.05。虚线表示95％的置信区间。转载/改编自Moussawi等。（2020）。©作者，保留部分权利；独家被许可人，美国科学促进会。根据知识共享署名非商业许可4.0（CC BY-NC）分发，网址为http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/。

致谢

这个工作是由院内研究计划在全国学院支持的药物滥用，DA048085（KM）和DA048530（BJT），并通过该中心为通过强迫行为，国家卫生研究院的NIH主任挑战奖（RCNM）。该协议我S的基于手稿“在小鼠中芬太尼蒸气自给药模型来研究阿片成瘾的” （穆萨维等人，2020）。

利益争夺

作者宣称没有冲突小号的兴趣。

伦理

该协议被执行主编符合健康指南的照顾和国家机构的指导方针ü实验动物的本身，而被批准由国家研究所动物护理和使用委员会对药物滥用（协议＃17 CNRB -133）。

参考

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