材料和试剂

3M TM Micropore TM手术胶带（3M，目录号：1533）
用0.8硝酸纤维素膜微米孔径大小为25mm滤波器的直径（AAWG02500，Millipore公司，Gemany ）
水稻根毛突变体Osbhlh115种子（Ding等，2009 ）；水稻冼组（也称为县或籼）野生-类型Kathalath种子
次氯酸钠（BBI生命科学公司，中国）
70％乙醇（BBI生命科学公司，中国）
Murashige和Skoog基础培养基（Duchefa Biochemie ，目录号：M0221）
Phytagel（Sigma-Aldrich，目录号：P8169-250G）
富碳导电胶（Rave Scientific，目录号：RS-MN-15-001130）
金晶片（70-AU2408，24 × 0.2 mm，纯度99.99％。Au ，Labtech，UK）
氩气（99.99％的纯度，中国杭州金宫）
氮气（99.99％的纯度，中国杭州金宫）
液氮（中国杭州金宫）
设备

ħ orizontal摇床（碧云天，模型：TS-2000A）
生长室（宁波-江南，型号：GXM-1008）
扫描电子显微镜（日立，型号：S-3000N）
GATAN ALTO 2100（GATAN，型号：ALTO 2100）
HITACHI SEM配备有一个GATAN低温SEM制备系统
软件

ImageJ（版本1.53e，美国国立卫生研究院，https: //imagej.nih.gov/ij ）
Office 365（Microsoft，美国，https：//www.office.com/）
程序

水稻根毛生长
用70％的乙醇将去除了颖花的大米种子消毒2分钟，然后除去消毒剂酒精。然后，消毒用10％次氯酸钠的种子上30分钟一个水平振荡器。用无菌蒸馏水彻底冲洗种子5次。
将种子放在无菌吸水纸上干燥。
播种到0.8％phytagel半强度MS培养基（pH = 5.8）上。
注意：为避免过多的水分附着在根毛上，强烈建议使用3M Micropore外科手术胶带密封中板。

将培养基板垂直放置在温度为30°C / 22°C（白天/夜晚），湿度为50％或更低，光周期为12小时（15,000 lux）的生长室中。
注意：降低湿度是减少印版中水分的有效方法。

发芽后使用三天大的稻根进行后续样品处理。
低温SEM的准备
安装SEM载物台冷模块（图1；请参见视频1 ）。
图1. SEM台冷模块的安装。燕尾榫并在模块中安装温度计。将铜轴和铜轴套推到一起以形成过盈配合的连接。确保实时模块温度显示在键盘上。

视频1. SEM载物台冷模块的安装

检查Alto 2100键盘（或控制面板）（图2 ）。
图2.刚开始时的键盘。该键盘允许控制所述泵和所述系统的阀，溅射镀膜机，照明，和加热器。所有温度和压力读数均可立即获得，并且易于在键盘上观察。

准备室预冷（图3，请参见视频2 ）
图3.添加液氮之前的预燃室。红色圆圈表示液氮的入口和出口。红色的椭圆形表示压力指示器的LED显示屏。

视频2.倒入液氮中，以预备室入口

预冷SEM冷台模块
倾液氮到顶部开口杜瓦瓶，其中管道被浸没（小号EE视频3）。管道中充满了高纯氮气。管道中的冷却气体将SEM级冷模块冷却至-180 °C以下。

视频3.将液氮倒入开顶的杜瓦瓶中

注意：在运行cryo-SEM系统之前，请对低温管道通风至少5分钟。管道中氮气的均匀流速对于图像质量是必不可少的。

产生氮泥
将液氮倒入冲洗池中，然后关闭盖子（请参见视频4 ）。
注：耐磨防水CR ÿ ogloves ！

视频4 。溶解氮的制备

按下Alto控制面板上的SLUSH / VENT按钮以激活污泥室泵送（请参见视频4 ）。
让液氮沸腾直到固化。此步骤大约需要两分钟。
再次按下SLUSH / VENT按钮，以停止泵送并将空气排入腔室。
使用前请取下盖子。
根样本采集
切开1-2厘米长的野生型或突变的直生精根以供使用。
将一滴富含碳的导电胶添加到样品架的铝制短管中（请参见视频5 ）。
录像5 。将导电胶涂到铝棒上

将一张预先浸入蒸馏水中的潮湿硝化纤维素纸放在胶水上（请参见视频6 ）。
录像6 。将硝酸纤维素纸放在样品台上并涂上凝胶

轻轻夹住切-断根端与镊子和根转移到硝酸纤维素纸上。将根尽可能水平放置（图4 ）。
图4 。将米根夹在硝酸纤维素纸上。首先，将导电胶涂到铝桩上。然后，将硝酸纤维素纸放在凝胶上。之后，将导电胶涂抹到杆的近端。最后，将切好的根部末端粘在胶水上，然后将根部平放在硝酸纤维素纸上。

将修剪后的根端浸入胶中（图4 ）。
根样品准备
将带有根样品的样品支架和存根以及与真空传输设备（VTD）集成在一起的样品支架粘在一起（请参见视频7 ）。
将样品架（与VTD一起）扣紧到冲洗池上，直到VTD固定在冲洗池顶部凹槽中的O形圈上（请参见视频7 ）。
向下滑动VTD中的杆（请参见视频7 ）。
在氮气池上方的空气中将样品架夹住10秒钟，以快速冻结根毛（请参见视频7 ）。
将样品架浸入泥泞的氮气中，以快速冷却样品（请参见视频7 ）。
注意：确保当抗蚀只有样本保持器浸没在氮，Ó therwise冷杆冻结VTD的O形环。这对随后的推挽操作和/或气密性具有负面影响。

视频7 。样品浸入氮气中

按下SLUSH / VENT按钮，以启动污泥室泵送。
向上拉动VTD杆，将样品架完全缩回到VTD中，直到氮泥完全固化（请参见视频8 ）。
录像8 。等待样品到LEAV Ë的抗蚀站

推动活板门阀（见视频9 ）（样品现在在VTD保持下一个真空，并准备转移到预备室）。
视频9 。样品离开融泥台

再次按下SLUSH / VENT按钮以排空泥浆室。
转移VTD并将其放置在GATE VALVE气闸中（请参见视频10 ）。
录像10 。抽出Gate Value气闸真空

按下Alto控制面板上的“ LOAD PUMP”（加载泵）按钮以抽真空准备室（图2 ）。
等到指示器六个条光照射，这是由所指示的红色椭圆在图3 。
完全打开阀，推动杆，然后将试样保持器进入燕尾阶段的预备室（图5- 6 ;请参见视频11 ）。
图5.预备室中的燕尾榫阶段。燕尾阶段方便了样品容器的成角度的边，并配有一温度计和加热器。每个挡块都有一个挡块，可将样品架移至完全相同的位置。弹簧夹固定支架并防止振动。

图6.升华和溅射前的稻根样品。白色圆圈表示样品正在等待升华并溅射在平台上。

录像11 。将样品转移到制备室（VTD和制备室阀门同时打开）

将预燃室的升华温度设置为-95 °C（图7 ）。
图7.升华温度设置。通过按SET TEMPERATURE按钮，将升华温度设置为-95 °C 。

按下加热按钮，开始预热（见视频12 ）（对于水稻根毛，在-95℃下保持300秒是最佳的。升华时间主要取决于湿度的根培养环境）。
视频12 。升华温度持续上升

再次按HEAT（加热）按钮停止加热，并将温度恢复到≤- 140°C。
设置金溅射时间，并按下控制面板上的按钮SPUTTER（120秒是足以对根毛）（图8 ）。
注意：如果准备室未配备显微镜设备，则可以在溅射之前将样品转移到SEM室进行粗略观察。这一步对于获得良好的样本和高质量图像非常重要。

图8.溅射参数显示。溅射电流的默认设置为10 mA。在进行氩气溅射之前，应将工作台温度冷却至≤- 140 °C 。

的氩气入口螺线管关闭时，自动的时间到了（图9;参见视频13 ）。
图9.溅起的稻草根。溅射时，稻根样品应置于包衣头下方。

视频13 。样品被溅射

扫描电镜
当指示灯LED指示灯变为绿色时，打开制备室和SEM室之间的球阀（图10-11 ）。
图10.球阀LED为红色。在这种情况下，机械互锁无法打开。

图11.球阀LED为绿色。当在真空中预备室和SEM达到平衡时，LED变绿，并且机械互锁可以被打开。

将样品架移至SEM冷台模块（请参见视频14 ）。
视频14 。从转移样品的制备室的SEM

旋转杆，并将样品支架与杆分离。
将杆缩回到准备室并关闭球阀。SEM成像公顷š现在开始。
打开软件，点击HV按钮启动的预览和拍摄模式。
设置SEM加速电压（6 kV或15 kV）。
通过旋转SEM标准载物台的不同控制旋钮来调整SEM样品载物台的位置（图12 ）。
通过调节放大，对比度，亮度和聚焦来旋转HITACHI控制单元上的旋转功能旋钮（图13 ）。
图12. SEM的标准阶段。T控制旋钮使样品倾斜（-20至90°）；R控制旋钮旋转样品（±360°）; X控制旋钮可沿纵向移动样本；Y控制旋钮在横向方向上移动样本；Z控制旋钮可沿垂直方向移动样本。

图13. SEM显示单元的外观。旋钮单元以黄色矩形显示。设备上的控制按钮布局已嵌入到图像中。

单击鼠标以打开或关闭对话框窗口并运行设置。用键盘输入字符和注释。
通过移动鼠标滚轮切换到不同的样品部件。
单击“ HR捕获”按钮以扫描样品。扫描速度是可选的。
注意：扫描速度越慢，图像的分辨率越高。但是，较低的扫描速度有时会导致图像变形。

单击“保存”按钮以将获取的图像保存并命名为目标文件夹。
再次单击该按钮，HV关闭的，当成像完成SEM长丝。
打开球阀，然后从位于杆上的冷台模块上取下样品架。
向后拖拉杆，然后将固定器插入准备室的燕尾槽台中。
关闭球阀。
将杆向后拖到底，然后关闭气闸阀。
按下Alto控制面板上的LOAD PUMP按钮两次，并打开气闸以卸下VTD。
将VTD放在冲洗室上，然后将活板阀接合到控制杆上。
数据一nalysis

从cryo-SEM图像获得根毛参数（图14 ）。来自根尖2-3mm区域的根毛用于统计和分析根毛参数。根据该结果，Osbhlh115突变体的根毛长度比野生型的根毛长度短得多（表1 ）。的在差的野生型和突变体之间根毛直径不显着。尽管野生型和突变型的根毛与精根的夹角没有区别，但cryo-SEM为研究根毛夹角参数提供了重要的工具（表1 ）。

图14.通过冷冻-SEM分析的根毛表型。AB。Kathalath （野生型）根毛表型。A是40 ×放大倍率，B是400 ×放大倍率；光盘。Osbhlh115突变根毛表型。C为40 ×放大倍率，D为400 ×放大倍率。

表1.根毛的定量参数*

*所有数据均根据参考说明获得（Tajima和Kato，2013年）

除了对根毛进行成像之外，cryo-SEM还可以用于对根细胞内部结构进行成像（图15 ）。在表皮和皮层细胞的水被升华，除去的后交联网状结构和层状结构，分别，在2000 ×放大倍数示出（图15B ）。在红树莓（Rubus indaeus L.）的果核中果皮细胞中发现了类似的胞质层状和网状结构（Williamson and Duncan，1989）。常规石蜡和树脂切片无法显示细胞质的真实结构。当树脂或石蜡代替组织中的水时，它可能会带走细胞质中的某些蛋白质或其他成分。低温扫描电镜可以通过升华消除水分，最大程度地保留细胞质含量。它被报道了许多年前的那个电子显微镜冷冻固定比化学固定（瓦尔特和米勒，1999年）更好。

图15.通过cryo-SEM分析的细胞质含量。A. Kathalath根反节骨折细胞质结构在180 ×放大倍数。B. B中红色矩形区域的放大图，放大倍数为2,000 × 。B中的红色圆圈表示网状结构。B中的红色正方形表示层状结构。

根毛冻结过程中，氮泥可能会转化为氮固体。当标本支架从泥浆室缩回时，根发管状突起部分偶尔会断裂。在图16中，可见各种断裂的根毛孔（图16A）。根毛在突出部分表现出较大的液泡（Preuss等，2004）。升华完成后，将整个液泡蒸发至干，并留出空腔（图16B）。空腔中的一些残留颗粒很可能代表细胞骨架蛋白（Walther和Müller，1999）。总之，有理由相信，图15B中显示的网状和分层结构在细胞形态的形成，细胞器定位，信号转导和物质运输中具有不同的功能。请注意，只有一小部分通过cryo-SEM显示的信息被利用，并且需要进一步的探索。

图16.残破的根毛留有小孔。AB。Kathalath （野生型）根毛表型。A为400 ×放大倍率，B为7500 ×放大倍率。

致谢

该项目得到浙江省自然科学基金（LY19C020002），国家自然科学基金委员会（31200913），杭州市海外归国人员（或团队）创业与创新项目（4105C5062000611），中国国家留学基金委（201709645003）的资助以及国家本科生创新创业培训计划（1085C5212030510）。该协议改编自Yu et al。，（2013）。w ^ ê给予十分感谢先生汉民陈在浙江大学为他提供技术支持。我们衷心感谢浙江大学于志明博士已故的顾问吴萍教授。

补偿装置婷兴趣

该作者宣称没有竞争的经济利益。

[R eferences

Alto 2100操作员手册。（2005）。GATAN 。
Binder，K.（2014年）。模拟澄清了过冷水何时冻结成玻璃状结构。PROC国家科科学院科学111（26）：9374-9375。
Berger，F.，Linstead ，P.，Dolan，L。和Haseloff ，J。（1998）。拟南芥下胚轴上的气孔模式受根表皮模式控制基因的控制。Dev Biol 194（2）：226-234。
Brizzolara，S.，Minnocci ，A.，Yembaturova ，E.和Tonutti ，P.（2020）。四种葡萄采后浆果皮的超微结构分析及其与采后脱水的关系。OENO One 4：1121-1131。
Chen X.和Meyerowitz，E . M.（1999）。HUA1和HUA2是花同源AGAMOUS途径的两个成员。摩尔单元3（3）：349-360。
Cocozza ， C.，Minnocci ，A.，Tognetti ，R.，Iori ，V.，Zacchini ，M。和Mugnozza ，G.S 。（2008）。扫描电子显微镜和能量色散X射线微分析法测定白杨根组织中镉的分布和浓度。iForest 1（2）：96-103。
Czarnota ，M.A. ，Paul，RN，Weston，L.A .和Duke，S.O .（2003）。高粱醌的解剖-的分泌毛发根高粱物种。Int J Plant Sci 164（6）：861-866。
丁文华，于志成，童勇，黄文华，陈华和吴平（2009）。具有bHLH结构域的转录因子调节水稻根毛的发育。Cell Res 19（11）：1309-1311。
多兰，L.，达克特，C. M.，格威尔森，C.，林斯特德，P.，施耐德，K.，劳森，E.，迪安，C.，Poethig ，S.和Roberts ，K.（1994）。拟南芥根表皮的克隆关系和细胞模式研究。发展120：2465-2474。
Echlin，P.（1971年）。扫描电子显微镜在生物学研究中的应用。Philo TR Soc B 261：51-59。
Eveling D. W.和McCall R. D.（1983）。扫描电子显微镜制备植物易损坏表皮表面方法的评价。J Microsc 129：113-122。
Foreman，J.和Dolan，L.（2001）。根毛作为研究植物细胞生长的模型系统。Ann Bot 88：1-7。
Giri ，J.，Bhosale，R.，Huang，G.，Pandey，BK，Parker，H.，Zappala，S.，Yang，J.，Dievart ，A.，Bureau，C.，Ljung ，K。，价格，A.，Rose，T.，Larrieu ，A.，Mairhofer ，S.，Sturrock，CJ，White，P.，Dupuy，L.，Hawkesford ，M.，Perin ，C.，Liang，W.，Peret ， B.，Hodgman，CT，Lynch，J.，Wissuwa ，M.，Zhang，D.，Pridmore ，T.，Mooney，SJ，Guiderdoni ，E.，Swarup，R.和Bennett，MJ（2018）。水稻生长素流入载体OsAUX1响应低外部磷酸盐促进根毛的伸长。Nat Commun 9（1）：1408。
Huang，J.，Kim，CM，Xuan，YH，Liu，J.，Kim，TH，Kim，BK and Han，CD（2013）。Formin同源性1（OsFH1）调节水稻（Oryza sativa ）中的根发伸长率。Planta 237（5）：1227-1239。
石田（T.Ishida），仓田（T. Kurata ），冈田（K.Okada）和T.和田（Wada）（2008）。毛状体和根毛发育的遗传调控网络。Annu启植物生物学59：365-386。
Y.Kaneko，H.Matsushima，M.Wada和M.Yamada（1985）。生活在植物的研究标本低-温度扫描电子显微镜。Ĵ电子Microsc技术2：1-6。
Kim，C.M .和Dolan，L.（2016年）。根毛缺陷六类I类基因促进草短曲霉根毛的发育。PLoS Genet 12（8）：e1006211。
Larkin ，J . C.，Brown ，M. L.和Schiefelbein ，J.（2003）细胞长大后如何知道他们想要成为什么？从拟南芥表皮模式的教训。Annu Rev Plant Biol 54：403-430。
Lefebvre，D.D .（1985）。气孔的主根上豌豆大号。Ann Bot 55（3）：337-341。
Limmer ，D.T .和Chandler，D.（2014年）。无定形冰理论。PROC国家科科学院科学11（26）：9413-9418。
McMullan，D。（1995）。扫描电子显微镜1928–1965年。扫描17：175-185。
Mendrinna ，A.和Persson， S.（2015年）。根毛生长：这是一条单向的街道。F1000Prime Rep 7：23 。
Müller，M.和Schmidt，W.（2004）。环境诱导的拟南芥根毛发育的可塑性。植物生理学134（1）：409-419。
普罗伊斯，M. L.，塞尔纳，J.，Falbel ，T. G.，贝德纳雷克，S. Y.和Nielsen，E。（2004）。拟南芥Rab GTPase RabA4b定位于生长的根毛细胞的尖端。植物细胞16（6）：1589-1603。
阅读，N。D .和Jeffree， C. E.（1991）。生物学中的低温扫描电子显微镜。J Microsc 161：59-72。
Refshauge，S.，Watt，M.，McCully，M.和Huang，C.（2006）。及时冻结：一种使用冷冻扫描电子显微镜观察根真菌相互作用的新方法。新植物172（2）：369-374
雷伊，L 。R.（1960年）。冻结溶液中共晶的热分析。Ann NY Acad Sci第510-534页。
Ryan，E.，Grierson，C.S.，Cavell，A.，Sterer，M。和Dolan，L。（1998）。拟南芥的尖端生长和非尖端生长都需要TIP1。新植物志138：49-58。
Sargent，J.A 。（1983）。扫描电子显微镜叶片表面的制备：一项比较研究。J Microsc 129：103-110。
Sargent，J.A 。（1986）。冷冻保存的根，用于扫描电子显微镜。安bot 58：183-185。
Tajima，R.和Kato，Y.（2013年）。使用ImageJ估算每个直径类别中根长的快速方法。植物产品科学16：9-11。
Utsumi ，Y.，Sano，Y.，Fujikawa，S.，Funada ，R。和Ohtani ，J。（1998）。冷冻扫描电子显微镜对弥漫性多孔树中的冬季空化容器和春季的可视化容器的可视化。植物生理学117：1463-1471。
Vartanian ，N.，Wertheimer，D.S 。和Couderc ，H。（1983）。短块根的扫描电子显微镜研究，特别涉及干旱和水合作用下细胞根状茎的进化。植物细胞环境6：39-46。
Vega- GALVEZ ，A.，Lemus- Mondaca ，R.，Bilbao-赛恩斯，C.，费托，P。和Andrésc ，A。（2008）。空气干燥温度对再水化干燥的红柿子椒（var。Lamuyo）质量的影响。Ĵ食品主机85（1）：42-50。
Walther，P.和Muller，M.（1999）。冷冻切片后高分辨率冷冻切片显示的生物学超微结构。Ĵ Microsc 196：279-287。
Wang，C . X.，Qi，C. Y.，Luo，J.H.，Liu L.，He，Y. and Chen，L.Q .（2019）。表征LRL5是玉米根毛生长的关键调节因子。植物J 98（1）：71-82。
Webb，J。和Jackson，M.B 。（1986）。传输和通气组织（皮质充气空间）的水稻不定根的形成的超低温扫描电子显微镜研究（水稻）。实验植物学杂志37（6）：832 - 841。
Williamson B.和Duncan G. H.（1989）。利用冷冻技术和扫描电子显微镜研究灰葡萄孢对成熟红树莓果实的感染。新Phytol 111（1）：81-88。
Yan ，Y.（2010年）。金属生物材料的摩擦学和摩擦腐蚀测试与分析。Met Biomed Devic Ch.7：178-201。
Yi，K.，Menand，B.，Bell，E. and Dolan，L.（2010）。基本的螺旋-环-螺旋转录因子控制根毛中的细胞生长和大小。Nat Genet 42（3）：264-267。
Yu，L.，Shi，D.，Li，J.，Kong，Y.，Yu，Y.，Chai，G.，Hu，R.，Wang，J.，Hahn，M.G. and Zhou，G （2014）。纤维素合酶样A2，一种葡甘露聚糖合酶，参与维持拟南芥种子中黏附的黏液结构。植物生理学164（4）：1842-1856。
Yu，Z.，Chen，H.，Tong，Y.和Wu，P.（2013）。水稻根毛形态的冷冻扫描电子显微镜分析。方法分子生物学（Mol Biol）956：243-248。
志明，Y.，博时，K.，校尉，H.，绍雷，L.，YouHuang ，B.，WoNa ，D.，明，C.，亨Taeg ，C和平安，W.（2011）。根毛特异性扩张素调节水稻的根毛伸长率。植物J 66（5）：725-734。
Zenone ，A.，阿兰尼亚，A.，D'安娜，G.，科瓦列夫，A.，Kreitschitz ，A.，贝德拉曼堤，F.和Gorb ，S. N.（2020）。海草中的生物粘附：底物粗糙度在海洋波塞冬（L.）Delile幼苗中通过粘附根毛锚定的作用。Mar Environ Res 160：105012。
邹，H. Y.，雯雯Y. H.，臧G. C.，康Z. H.，张Z. Y.，黄J. L.王G. X.（2015）。OsEXPB2是一种β-扩展酶基因，参与水稻根系体系结构的构建。摩尔育种35：41 。