材料和试剂

一次性手术刀，第22号（Swann Morton，目录号：508）
巴斯德吸管（ELKay ，目录号127-P503-STR ）
薄纱布（Winware食品级，目录号：E948）
30 µm细胞过滤器（Miltenyi biotec ，目录号：130-041-407）
70 µm细胞过滤器（BD Falcon，目录号：352350）
细胞过滤器100 µm（BD Falcon，目录号：352360）
细胞过滤器400 µm（Pluriselect ，目录号：43-50400-50）
140 mm培养皿（Sterilin ，目录号：SC269）
鹘50ml圆底聚丙烯试管小号（康宁，目录号：352070）
聚丙烯圆底FACS管5 ml（Falcon，目录号：352063）
解剖钳（科学实验室用品，目录号：SR04010）
手术直剪刀（SAMCO，目录号：E101 / 01）
250毫升杜兰玻璃瓶（科学实验室用品，目录号：F151164 ）
漏斗（科学实验室用品，目录号：FUN1260 ）
V型胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C9263）
DAPI（4'，6-二mid基-2-苯基吲哚）（Sigma-Aldrich，目录号：D8417）
DNase I（罗氏（Roche），目录号：10104159001）
乙二胺四乙酸EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
胎牛血清（热灭活的）（Biosera ，目录号：FB -1001）
流式细胞术抗体（见表1 ）

表1.流式细胞仪抗体

Pancoll （密度1.077 mg / ml）（Pan Biotech ，目录号：P04-601000）
青霉素/链霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P0781）
RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich，目录号：R7388）
胰蛋白酶250（Pan Biotech，目录号：P10-025100P）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D9434）
NaCl（MP Biomedicals，目录号：151944）
氯化钾（MP Biomedicals ，目录号：194738）
正磷酸氢二钠（Fisher Scientific，目录号：S / 4520/53）
正磷酸二氢钾（Fisher Scientific，目录号：P / 4800/53）
pH值osphate缓冲盐水（PBS）1×浓度
人血清（Sigma-Aldrich，目录号：H4522）
小鼠血清（Sigma-Aldrich，目录号：M5905）
大鼠血清（Sigma-Aldrich，目录号：R9759）
出色的污渍缓冲液（BD Horizon，目录号：563794）
胰蛋白酶/EDTA，0.2%溶液（请参阅食谱）
RF10介质（请参阅食谱）
FACS缓冲区（请参阅食谱）
阻塞缓冲区（请参见配方）

设备

BD FACSAria TM III细胞分选仪（或类似产品），4激光细胞分选仪，用于装有100 µm喷嘴的2级安全壳样品（BD Biosciences ，型号：FACSAria TM III ）
带桶盖的温控离心机（Eppendorf离心机5810R，目录号：F151380）
热板磁力搅拌器（DLAB，目录号：DL2255-380H）
水浴（VWR，目录号：462-0557）
血细胞计数器（VWR，目录号：BR718605）
光学显微镜（Leica，目录号：11964479）

软件

BD FACSDiva TM软件
一对流式细胞仪和应用程序的安装，数据采集工具，采集，分析。它运行微软®的Windows 10的64位操作系统。

的FlowJo TM （碧迪，和公司; 2019）软件
甲包用于分析流式细胞术数据。现代流式细胞仪产生的文件以流式细胞术标准格式写入，扩展名为.fcs。无论使用哪种流式细胞仪收集数据，FlowJo都会导入并分析细胞计数数据。Mac和PC均可使用。

程序

生物样本
至关重要的是，所有的工作使用人体组织接收来自事先批准的适当的机构和/或国家审查委员会; 捐助者必须始终提供知情同意。对于这项工作，在英格兰东部-剑桥中央研究伦理委员会（17 / EE / 0151）的伦理许可下，在所有参与者的书面知情同意下获得组织样本。

与未公开的人胎盘组织所有的工作都视为组3种血液潜在危险-源性致病菌，并应在开展遏制级别2的设施。

获得单-从第一细胞悬液-三个月胎盘组织
HBC是在绒毛基质内发现的胎儿巨噬细胞，它构成胎盘。一系列酶消化的确保了组织的击穿，以获得一个单一的-以高收率HBC和活力细胞悬浮液（见注2）。这种单-细胞悬浮液也含有其他细胞类型即弥补胎盘，包括滋养层细胞和成纤维细胞，以及胎盘相关的母体单核细胞/巨噬细胞（PAMM）（托马斯等人，2021。）。可以通过FACS（程序D中进一步详细描述的方法）从该消化物中获得HBC的纯化种群。

准备试剂和设备
同样的材料和设备所需要的程序小号B.媒体，试剂，和工具必须是无菌的（见注1）。

制备的胰蛋白酶/ EDTA溶液（见配方）
准备的RF10中（见食谱）
制备的Ç通过溶解ollagenase V原液（10毫克/毫升）它在RF10。将溶液分装成2.5毫升等分试样，并在-20°C下保存长达6个月。
制备的DNA酶I原液（10毫克/毫升）通过溶解它在无菌水中。在-20°C下将溶液以100 µl等分试样分配最多6个月。
通过将DNase I的等分试样（来自过程B1d）稀释在50 ml的1 × PBS中来制备含DNase I的PBS（20 µg / ml）。保持无菌于4°C并每次新鲜（见注3）。
之前开始胎盘组织处理，瓦特臂Ť rypsin / EDTA（0.2％溶液），胶原酶V，1 × PBS ，并Pancoll至37℃。设置一个加热摇床至37℃，用每分钟500转（RPM），并设置一个磁力搅拌器加热板，以37℃。
过程荷兰国际集团第一-三个月胎盘组织以获得单-细胞悬浮液
收到后立即处理胎盘。
冲洗的胎盘1×与在室温下（RT）10分钟磁力搅拌器轻轻PBS。
转移胎盘到P ETRI菜。
用镊子清除任何血块。
按住胎盘单元的一端，并且轻轻刮去从绒毛膜绒毛用手术刀（S EE图2A ）。
丢弃胎膜。
使用巴斯德吸管（与顶端切断），转移刮下绒毛到75mL的预热0.2％胰蛋白酶-EDTA在无菌250米升玻璃Duran瓶中。在地方的热板磁力搅拌器加热至37℃并轻轻搅拌7分钟。
加入2mL的FCS以停止胰蛋白酶消化的组织的。
过滤trypsined通过ST组织erile漏斗薄纱纱布。
在室温下用PBS冲洗。
将消化过的穿过纱布的组织和剩余的组织都保留在纱布上。
使用手术刀从纱布中取出未消化的组织，并将其放入50 ml F alcon管中。添加2.5毫升的胶原酶V和100微升DNA酶I的并添加PBS至25毫升的最终体积（终浓度为1mg / ml胶原酶V和40微克/毫升DNA酶I的）。
注意：DNase I的添加至关重要。米acrophage产量和活力都在无DNA酶I的大大降低

在500 RPM的加热振荡器上于37°C消化20-30分钟。
通过漏斗中的无菌细纱布过滤所得的细胞悬液。丢弃任何未消化的组织，并离心滤液5分钟，在120 ×克，RT ，以沉淀细胞。丢弃上清液。
合并来自步骤s i和n的细胞，并用DNase I在PBS中洗涤（请参见注释3）。
注意：来自S tep B2 i的细胞将主要包含母体和滋养细胞。我们发现，HBC有时也在此消化中发现，从汇集细胞的步骤B2 i和B2 ñ将有助于最大限度地提高产量HBC 。然而，由于来自S tep B2 i的细胞悬浮液中发现的HBC很少，因此合并来自步骤B2 i和B2 n的细胞不是必需的。

轻轻重悬细胞沉淀在20ml的PBS中的DNA酶I
通过400 µm过滤器过滤细胞悬液。
层中的细胞悬浮液到10毫升的Pancoll在50ml Falcon管中。
以600 × g离心20分钟，RT，加速度0，断裂1。
使用巴斯德移液器在界面处收集细胞。
用DNase I用PBS洗涤，并在120 × g室温下离心5分钟。丢弃上清液。
重复了前面的步骤。
用DNase I将细胞重悬于PBS中，并通过70 µm过滤器，用血球计数器计数细胞，然后将其置于冰上（参见注释2和5）。

图2.刮除胎盘绒毛。从胎盘绒毛（的图像，显示刮甲）第一-三个月和（乙）足月胎盘。

获得单-细胞悬浮液从足月胎盘组织
从足月妊娠收集胎盘的显着不同的在第一三个月。随着怀孕的进行，胎盘绒毛继续发芽，血管网络成熟，以增加器官的表面积和血管形成，并满足胎儿成长的需要。足月胎盘绒毛的纤维间质较致密，带有肌肉动脉，在孕早期不存在（Castellucci和Kaufmann，1982）。出于这个原因，足月胎盘组织的用于从在步骤B对首先描述的不同HBC的隔离消化-三个月胎盘和在下面详细所述。

准备试剂和设备
按照步骤B1所述准备试剂和设备。

处理足月胎盘组织以获得单-细胞悬浮液
收到后立即处理胎盘。
使用手术剪刀从整个胎盘切出一个小叶。
注意：为确保供体之间的一致性，请始终将叶与同一区域隔离开。

冲洗的在PBS中胎盘轻轻地用在10分钟磁力搅拌器RT 。
转移到一个P ETRI菜。
用镊子清除任何血块。
使用外科剪刀从基底侧（面对母亲的一侧）上去除并丢弃一薄层组织（约1毫米）。
注意：此步骤可确保从胎盘中清除所有蜕膜组织。

按住胎盘单元的一端，并且轻轻刮去从绒毛膜绒毛用手术刀（S EE图2B ）。
丢弃胎膜，结缔组织纤维和可见血管。
使用巴斯德吸管（与顶端切断），转移刮下绒毛到75mL的预热0.2％胰蛋白酶-EDTA在无菌玻璃Duran瓶中（250 ml的）。在地方的热板磁力搅拌器加热到37℃并轻轻搅拌15分钟（见注4）。
加入2mL的FCS以停止胰蛋白酶消化的组织的。
通过漏斗中的无菌薄纱布过滤经胰蛋白酶处理的组织。
在室温下用PBS冲洗纱布。
将消化过的穿过纱布的组织和剩余的组织都保留在纱布上。
从纱布中取出未消化的组织，放入50 ml F alcon管中。添加2.5毫升的胶原酶V和200μl的DNA酶I的并添加PBS至终体积25毫升（1毫克/毫升胶原酶V和80微克/毫升脱氧核糖核酸酶I的终浓度）。
注意：DNase的添加至关重要。米acrophage产量和活力都在无DNA酶I的大大降低

在37°C的加热的振荡器上以500 RPM的速度消化60分钟（请参见注释4）。
通过在漏斗中的无菌平纹细布纱布过滤消化的组织。丢弃任何未消化的组织，并离心滤液5分钟，在120 ×克，RT ，以沉淀细胞。丢弃上清液。
重复小号TEPS B2o-B2W。

Isolati NG霍夫鲍尔从第一单元-孕早期和足月胎盘摘要
在这个协议中，单-从过程获得的细胞消化小号乙和C被染色与HBC的通过FACS分离荧光缀合的抗体。该协议包括一个优化的面板和门控策略的是允许isolati纳克HBC的高度纯化的人口没有了在胎盘消化母体发现的单核细胞/巨噬细胞的污染。

准备试剂和设备（请参阅注1）
制备的FACS缓冲液（见ř ecipes）。保持无菌并在4°C下保存最多1个月。
制备封闭缓冲液（见ř ecipes）。通过过滤器一个在4℃下为至多0.2微米的无菌过滤器和存储1月份。
注意：将所有血清在56°C的水浴中加热30分钟即可使其热失活。

在无菌水中准备0.9 mM DAPI。无限期储存在-20°C下。
如步骤B1b中所述准备RF10 。

Isolat è通过FACS HBC
使细胞通过30 µm过滤器进入聚丙烯FACS管。
在120 × g，4°C下离心5分钟。丢弃上清液。
于150μl重悬细胞的人类阻挡每10个缓冲× 10 6细胞。
在每管50 µl的Brilliant染色缓冲液中制成抗体混合物（按照表1中的稀释比例，最终体积为200 µl）。同一抗体混合物用于孕中期和足月胎盘细胞。
添加的抗体鸡尾酒的细胞，并通过轻轻混合涡旋。
在冰上孵育20分钟。
加入2mL的冷FACS缓冲液，并离心5分钟，在120 ×克，4℃。丢弃上清液。
重复上一步。
重悬细胞于1ml的冷FACS缓冲液。
染色的细胞用DAPI（1：10,000）用于启动排序之前的10分钟ING 。
参见图3中用于鉴定早孕和足月胎盘消化物中HBC的门控策略的代表性图像（请参见注释6）。
将细胞在4°C下分选到合适的收集管和缓冲液中。

图3.荧光激活细胞分选门控策略以分离HBC。（A，B）使用BD FACSDiva和Flowjo软件使用常见HLA同种异型抗体和胎盘消化物中CD45 + CD14 + FOLR2 + HBC（红门）身份的抗体用于区分胎儿与母体细胞的门控策略的代表性图像。（A）首先-三个月胎盘样品; 胎儿细胞是HLA-A3 + ，和母体细胞是HLA-A3 - 。（B）全-术语的胎盘细胞; 胎儿细胞是HLA-B7 - ，和母体细胞是HLA-B7 + 。谱系毫安- [R KERS（LIN）包括CD3，CD19，CD20，CD66b ，和CD335在FITC。

数据分析

从胎盘组织中分离活细胞

我们的协议生成来自胎盘消化收率细胞单细胞悬浮液与〜从第一90％存活率-三个月胎盘组织和〜80％从足月胎盘组织生存力。通过细胞分选富集可行的HBC后，我们获得了〜95％的HBC，如通过血细胞计数器和显微镜进行细胞计数所确定的（参见注释5）。

流式细胞术门控策略以区分HBC和母体巨噬细胞

为了从胎儿CD14 + HBC中分离出污染性的母体CD14 +单核细胞和巨噬细胞，我们开发了一种流式细胞术门控策略，可以很容易地适应不同细胞分选仪的配置（表1 ）。我们证明，抗HLA分型抗体可用于区分更丰富的胎儿CD14 +从较不丰富的母体CD14 HBC +来自第一单核细胞和巨噬细胞-三个月和足月胎盘消化（图3 ）（见注6）。

笔记

有几个参数，关键在了成功的协议小号描述。

在整个方案中必须使用无菌试剂和设备，因为HBC对细菌产物有反应，这会改变细胞的特性（Thomas等，2021）。一旦已经获得单细胞悬浮液，它是必不可少的，以保持它在4℃下，以避免通过遵守塑料巨噬细胞损失和最小化细胞活化。
DNA酶I的过程中加入的消化和随后的PBS洗涤荷兰国际集团的步骤是，以确保高HBC生存能力的关键。
对于足月胎盘组织，用胰蛋白酶和胶原酶V进行更长的消化是确保完整消化组织和成功分离HBC所必需的。但是，过度消化和长时间暴露于消化酶会降低HBC的生存能力。
总细胞数小号从第一-三个月和足月胎盘组织消化变种ý样本之间。通常，从已经成功消化的胎盘组织中可以预期总共有20 × 10 6 -50 × 10 6个细胞。通过FACS分选的HBC的产量在样品之间也有所不同，但约占所有细胞的1-3％。
为确保通过高纯度FACS分离HBC ，我们在流式细胞仪中提供了三种HLA异型分型抗体。由于HBC是包含母体和母体遗传物质的胎儿细胞，因此在某些情况下，可以预期胎儿和母体之间的HLA同种异型不匹配。在这些情况下，我们可以确保排序HBC是胎儿来源的无母体细胞的污染，其通常存在于胎盘消化（图3 ）。在我们的染色面板中使用的抗HLA抗体的特异性已被证实从HLA分型献血者的血样通过DNA上的定量PCR（qPCR）。然而，这里描述的方案的一个缺点是，如果有没有对胎儿和母亲为HLA-B7，HLA-A3之间HLA同种异型错配，或HLA-A2，协议将无法从胎儿细胞分离母体。在这种情况下，有必要在流式细胞仪中包括由HBC特异性表达的其他标记。例如，我们先前已经表明，孕早期的HBC不表达HLA-DR，而母亲的巨噬细胞则表达HLA-DR 。因此，加入HLA-DR的，以流式细胞术面板将允许第一分离-三个月HBC从母体的巨噬细胞在不存在HLA同种异型的失配（托马斯等人，2021。）。HLA-DR不能用于区分足月胎盘HBC中的母体细胞，因为HBC通过足月表达HLA-DR （Sutton等人，1983）。

菜谱

胰蛋白酶/ EDTA [（0.2％溶液）；0.2％（w / v ）胰蛋白酶-250 / 0.02％（w / v ）EDTA / PBS溶液）]
0.3克葡萄糖

12克氯化钠

0.3克氯化钾

1.725 g正磷酸氢二钠

0.3克正磷酸二氢钾

2克胰蛋白酶

0.2克EDTA

将化学药品溶于1升水中
使用0.22 µm过滤器单元对溶液进行无菌过滤
分发储备溶液至75个在毫升分装并储存- 20℃下进行长达6个月
Ť他RF10媒体
罗斯威尔公园纪念学院（RPMI）1640中

10％热灭活胎牛血清

1×青霉素/链霉素溶液

100单位的青霉素和0.1 mg / ml链霉素

Ť他流式细胞仪缓冲
1％PBS中2％热灭活的胎儿血清和2 mM EDTA 。保持无菌并在4°C下保存最多1个月。

B锁定缓冲区
1×PBS中的5％人血清，1％大鼠血清，1％小鼠血清，5 ％FCS和2 mM EDTA

致谢

感谢您的协助：1 .病理学系的流式细胞仪核心设施；2.露西·加德纳（Lucy Gardner），伊莫金·邓肯（Imogen Duncan ）和里图·拉尼（Ritu Rani）帮助收集和处理胎盘样品；3 d onors谁参加了这项研究，并在医院的工作人员; 4.教授斯蒂芬·查诺克-琼斯和妇产科的欧文埃系博士妇科，剑桥大学，用于帮助收集足月胎盘样本。这项工作得到了英国剑桥大学皇家学会，滋养细胞研究中心和惠康基金会的支持。N.McG由惠康爵士亨利·戴尔爵士和皇家学会奖学金资助（授权号204464 / Z / 16 / Z）。JT由Wellcome Trust博士生资助（资助号215226 / Z / 19 / Z）。

该协议是根据其他人的先前工作（Tang等人，2011）和我们自己的发现（Thomas等人，2021）开发和修改的。

利益争夺

作者没有利益冲突要声明。

参考

Castellucci ，M。和Kaufmann，P。（1982）。正常人胎盘绒毛核心的三维研究：II。基质结构。胎盘3（3）：269-285。
Jauniaux ，E.，Watson，AL，Hempstock ，J.，Bao，YP，Skepper ，JN和Burton，GJ（2000）。孕妇动脉血流和胎盘氧化应激的发作。人类早期妊娠失败的可能因素。美国病理学杂志157（6）：2111-2122。
Kim，JS，Romero，R.，Kim，MR，Kim，YM，Friel，L.，Espinoza，J.和Kim，CJ（2008）。Hofbauer细胞和母体T细胞参与病因不明的绒毛炎。组织病理学52（4）：457-464。
Sutton，L.，Mason，DY和Redman，CW（1983）。人胎盘中的HLA-DR阳性细胞。免疫学49（1）：103-112。
Tang，Z.，Abrahams，VM，Mor ，G. and Guller ，S.（2011年）。胎盘霍夫鲍尔细胞与妊娠合并症。Ann NY Acad Sci 1221：103-108。
Thomas，JR，Appios ，A.，Zhao，X.，Dutkiewicz ，R.，Donde ，M.，Lee，CYC，Naidu，P.，Lee，C.，Cerveira ，J.，Liu，B.，Ginhoux ， F.，Burton，G.，Hamilton，RS，Moffett，A.，Sharkey，A. and McGovern，N.（2021）。孕早期人胎盘巨噬细胞霍夫鲍尔细胞的表型和功能表征。J Exp Med 218（1）。