材料和试剂

材料
1.5 ml Eppendorf 管（VWR，目录号：89000-028）
4-w Nunclon TM Delta MultiDishes （Thermo Scientific，目录号：62407-068）
6孔培养板小号（热˚F isher，目录号：140675）
96孔培养板小号（康宁，隼® ，目录号：353072）
小号TANDARD 60 × 15毫米菜瓦特/通气孔（Fisher Scientific公司，目录号：12-565-95）
15毫升Ç entrifuge吨ubes（VWR，目录号：21008-216）
2毫升ç ryogenic v IALS与Ç losures，p聚环氧（康宁® ，目录号：89089-764）
10微升ř ACKED尖端，升流-r etention小号terile（VWR，目录号：10017-062）
200微升- [R ACKED尖端，升流-r etenti ö Ñ小号terile（VWR，目录号：76322-150）
1 ，000微升升流-r etention吨IPS（VWR，目录号：10017-090）
的BioDot 96 -w ELL Ñ上-s kirted PCR p晚小号（打点科学，目录号：650-PCR）

试剂
mTeSR1（STEMCELL，目录号：85850）
mFreSR冷冻保存培养基（STEMCELL，目录号：05855）
ReLeSR （STEMCELL，目录号：05872）
Matrigel ® hESC -Qualified Matrix（Corning ® ，目录号：354277）
FuGENE ® HD 转染试剂（Promega，目录号：E2311）
Accutase （STEMCELL，目录号：07920）
Primocin （Invitrogen，ant-pm-1）
Y-27632二盐酸盐（R&D Systems，目录号：1254/1）
QIAprep Spin Miniprep Kit（250）（Qiagen，目录号：27106）
Qiaprep EndoFree Plasmid Maxi Kit（10）（Qiagen，目录号：12362）
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Thermo Fisher Scientific，目录号：4337455）
DyeEx 2.0 试剂盒（Qiagen，目录号：63204）
HotStarTaq DNA聚合酶（250 U）（Qiagen，目录号：203203）
PlasmidSafe核酸外切酶（Lucigen ，目录号码：E3101K）
QuickExtract TM DNA 提取液（VWR，目录号：76081-768）
FastDigest BbsI （Thermo Fisher Scientific，目录号：ER1101）
T7连接酶（NEB，目录号：M0318S）
ATP 溶液，100 mM（NEB，目录号：N0451）
dNTP 溶液混合物，10 mM（NEB，目录号：N0447S）
Opti-MEM I，100 ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985062）
虾碱性磷酸酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：783901000UN）
PCR X Enhancer System（Thermo Fisher，目录号：11495017）
异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：190764）
无核酸酶水，PCR 级（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9937）
Teknova DNA / RNA ř esuspension乙uffer（TE缓冲液）（VWR，目录号：100216-886）
Invitrogen One Shot ® Stbl3 TM化学感受态大肠杆菌细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：C737303）
1 kb DNA梯（Promega，目录号：G5711）

设备

C1000 Touch Thermo Cycler（Bio-Rad，型号：1851197 ）
Sorvall Legend XTR Centrifuge（Thermo Scientific，目录号：75217420 ）
台式冷冻离心机 5430R（Eppendorf，目录号：022620601）
Heracell 150i 组织培养培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：51026283）
ABI 3730 DNA 分析仪（Thermo Fisher Scientific，型号：3730S）
Nalgene Mr. Frosty 冷冻容器（Sigma-Aldrich，目录号：C1562）

软件

ApE——质粒编辑器（M Wayne Davis，https: //jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ ）

程序

实验人计划
细胞系选择
通常，如果起始细胞系在要编辑的所需 SNP 位点是杂合的，则实验将是最方便的。这样，我们就可以合成两条单链DNA寡核苷酸（ssODNs ），每条携带不同的基因型，同时进行两个单独的SNP编辑实验，从而在实验结束时获得两个等位基因方向的编辑纯合细胞系（图） 1A)。另外，也可以以得到的纯合细胞系的通过从纯合细胞系开始相对基因型时的情况小号不允许自由度高的，例如，使用从临床DIAGN衍生的细胞系osed例（图1B）。在这种情况下，这将是有益的，以增加挑选的克隆的数目在第E和F到maximi ž Ë一种检测阳性一个机会。虽然在第一轮 CRISPR/Cas9 编辑中可能不会出现其中一个基因型（相反基因型的杂合或纯合），但获得相反基因型的纯合细胞系通常足以满足以下目的：该实验。或者，从第一轮编辑中获得的杂合系可以用于具有相同ssODN 的另一轮 CRISPR/Cas9 编辑，以获得相反基因型的纯合系。在所有情况下，的基因型的在期望的SNP位点起始细胞系需要进行到部分B之前确认要确认在该特定SNP位点基因型，使用30纳克来自起始细胞系提取基因组DNA，并通过执行Sanger测序与步骤继续小号E4 - E5。可选地，在线数据库小号，下一代测序结果，或细胞系相关的患者的元数据还可以提供在SNP位点的基因型信息进行编辑。

图1 。以 SNP 位点 rs2027349 为例的 SNP 编辑策略。A.从杂合细胞系开始的 SNP 编辑。两个ssODNs携带荷兰国际集团在SNP位点（A / T）的两个等位基因的用于编辑的杂合线（顶部）到相反的方向，并且产生不同的基因型（中）两种纯合细胞系。具有CRISPR / Cas9介导的DNA cleav细胞年龄事件，但不ssODN集成显示INDEL的中的两个重叠峰集的形式存在近端到目标部位（底部）。B. 从纯合细胞系开始的 SNP 编辑。只有一个ssODN卡尔ÿ我纳克替代等位基因（T）是必需的，以产生两个杂合（中间左）和纯合（中间偏右）细胞的相对的基因型线。请注意，获得编辑过的纯合细胞克隆的机会明显低于杂合细胞克隆。

技术要求。整个实验包括三个主要部分：质粒克隆和制备；iPSC集维护，转染，和亚克隆; 和桑格测序。虽然它是渴望Desir可以是一个运营商，所有相识本身的技能，该协议已被设计为工作与几名成员合作项目，每个都有自己的SPECIALI ž通货膨胀。

gRNA 设计和载体制备
使用dbSNP ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/ ) 或任何基因组浏览器获取靠近目标 SNP 的 DNA 序列以进行 gRNA 设计。通常，该序列将在目标 SNP 的上游和下游延伸 65 bp，总共 131 bp。保存序列，因为它将用于合成ssODN ，其同源臂位于目标 SNP 位点两侧。该序列也将在一个gRNA设计工具使用诸如Benchling （https://www.benchling.com）以产生gRNA序列（20碱基对）的introduc一个和灰双链断裂（DSB）。选择具有最高效率分数的 gRNA，同时保持合理的特异性分数。它也发现，gRNA与序列一个切割位点接近所述靶SNP位置可具有更好的重组效率（参见图2的示意图中，以及从输出示例Benchling为gRNA和ssODN用于编辑SNP rs2027349）。在该MEA n时间，设计一对PCR引物覆盖目标SNP美国ING引物3（http://primer3.ut.ee/）或类似的在线工具。PCR 产物的大小应为 400 - 600 bp，并且 SNP 距离产物的任一端至少为 150 bp。

图2 。HDR 介导的 SNP 编辑示意图。A. gRNA 引入的双链断裂事件。的单个引导RNA（因组）结合于特定的基因组DNA序列，并引入一个在DSB的基因组DNA的双链。所述ssODN我示出在平行于突出突变位点S; B. 使用ssODN作为模板的HDR 介导的 DNA 修复事件。穿心莲后荷兰国际集团的DSB（虚线）时，HDR介导的DNA修复的开始和期间在一些细胞中这个过程中，ssODN携带突变型等位基因作为模板的最终修复产物; C. 以ssODN为模板修复后的最终产品，突出显示突变点；从D.样品gRNA候选输出列表Benchling 150,067,554-150,067,687：使用人类GRCh38基因组序列CHR1。此处，突出显示的项目包含 SNP rs2027349 作为 …AATA[A]CGCC…；E.样品ssODN从输出窗口Benchling使用上述相同的基因组序列，示出的转换的SNP本身从A到G（红色）。

从供应商（例如 IDT 或 Sigma-Aldrich）订购以下寡核苷酸：
ssODN ，131个核苷酸的长度，单-链版用的靶SNP的编辑等位基因定位d在基部位置66不要为了互补链。如果从杂合细胞系开始，则需要两个携带两个等位基因的ssODN ，而如果从纯合细胞系开始，则需要一个携带相反等位基因的ssODN 。如果从 IDT订购带有标准脱盐的4 nmol Ultramer Oligo 干燥格式。
sgRNA-top: 5 ' -[ Phos ]- CACCgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN ;
sgRNA-bottom: 5 ' -[ Phos ]- AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc ;

i n 其中 N 代表 gRNA 序列。注意sgRNA-bottom oligo 末端的尾部c 。不要在 sgRNA 寡核苷酸中包含 PAM 序列。

两种寡核苷酸都可以以5'-磷酸化形式（推荐）订购，以避免内部 PNK 磷酸化步骤（其效率各不相同）。在25顺序纳摩尔干燥与标准脱盐DNA寡格式，如果从IDT，重悬至100 μM用TE缓冲液后arriv人对于长期储存在-20 ℃下。

测序引物，如上所述。如果 SNP 离任一端都不太近/太远，则 PCR 引物可用作测序引物。在25顺序纳摩尔干燥标准脱盐，重悬至100的DNA寡格式μM用TE缓冲液后arriv人对于长期储存在-20 ℃下。
U6-正向引物 (5'- GAGGGCCTATTTCCCATGATT ) 用于对最终质粒构建体的 gRNA 插入进行测序。在25顺序纳摩尔干燥标准脱盐，重悬至100的DNA寡格式μM用TE缓冲液后arriv人对于长期储存在-20 ℃下。
组装pSpCas9（BB）-2A-迪普罗（PX459）V2.0（Addgene公司，62988）构建体与customi Ž编gRNA插入件。
混合以及在室温下的盖在PCR管中的下列组分。不使用d我Ë THYL p YRO Ç arbonate （DEPC）处理的水在整个实验中，因为它可能抑制反应。
成分

量（微升）

sgRNA 顶部 (100 μM )

1

sgRNA 底部 (100 μM )

1

T4 连接缓冲液，10 × (NEB)

1

水，PCR 级

7

全部的

10

使用带有加热盖的热循环仪并设置以下参数s以对寡核苷酸进行退火。以最小斜率下降（例如0.1°C/s）。贯穿本协议，用加热的盖的热循环应当使用（与盖加热功能接通），除非另有说明。
步＃

温度

时间

笔记

1

95℃

5分钟

最小斜坡率

2

25 ℃

2 分钟

向 199 μl PCR 级水中加入 1 μl稀释退火寡核苷酸，混合均匀。
执行由混合切口连接反应以及在PCR管帽以下组件。我们建议通过用水代替稀释的寡核苷酸来设置阴性对照实验，其功能将在后面介绍。
成分

量（微升）

pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0，100 ng/ μl

1

来自步骤 A3c 的稀释退火寡核苷酸

2

探戈缓冲器，10 ×

2

DTT，10 毫米

1

ATP，10 毫米

1

FastDigest Bbs I

1

T7连接酶

0.5

水，PCR 级

11.5

全部的

20

然后设置了热循环参数小号如下：

步＃

温度

时间

笔记

1

37℃

5分钟

2

21 ℃

5分钟

3

/

/

返回第 1 步，6 个循环

治疗用连接产物和阴性对照PlasmidSafe核酸外切酶消化的任何残余lineari ž通过组装与帽PCR管下列分量ed DNA并混合荷兰国际集团良好。如果不能立即使用，这种热灭活的反应可以在-20 °C下保存至少 1 周或在 -80°C 下无限期保存。
成分

量（微升）

来自S 步骤A3d 的结扎产品

11

PlasmidSafe缓冲液，10 ×

1.5

ATP，10 毫米

1.5

质粒安全外切酶

1

全部的

15

然后设置了热循环，如下所示：

步＃

温度

时间

笔记

1

37℃

30分钟

2

70°C

30分钟

3

4 ℃

抓住

转化感受态t细胞。我们建议使用RecA -大肠杆菌菌株，例如 Invitrogen Stbl3 ( recA13 ) 或 NEB Stable ( recA1 ) ，因为插入的 gRNA 及其相关的 gRNA 支架可能包含不稳定的序列。作为指导原则，使用2微升从产品小号TEP A3E每转化（包括一个阴性对照），按照供应商的说明。热激后，有必要添加回收Ý介质（例如SOC或NEB 10-β/稳定向外生长培养基）在32 ℃下1小时，用扩频之前振摇上琼脂平板LB / AMP + ，因为初始的DNA的量输入低。
在32 °C 下孵育16 小时，并在第二天检查菌落。阴性对照板上的大量菌落通常表明BbsI消化不起作用。选择4 -从板6个菌落与加入退火的寡聚和接种4毫升LB / AMP +媒体与各菌落。使用新的 LB/Amp+ 琼脂平板记录所有接种的菌落及其相应的管号。在 37 °C 下孵育过夜。
使用离心柱（例如来自Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit 的离心柱）分离质粒 DNA，然后使用U6- F正向引物进行测序以鉴定阳性克隆。在此期间，保持从记录板小号TEP A3G在4 ℃下，直到所有的阳性克隆已经鉴定通过测序。
用记录板中的阳性克隆菌落接种250 ml LB/Amp+以制备转染级质粒。文化与提取质粒我们荷兰国际集团一Qiagen公司EndoFree质粒Maxi试剂盒，以确保完全去除内毒素根据制造商的说明。将纯化的质粒稀释至 1 μg / μl或适当的无内源 TE缓冲液（在 maxi-prep 试剂盒中提供）作为 50 - μl 等分试样，并在-20 °C 下储存直至使用。

维护人类 iPSC以进行编辑
在涂有 Matrigel 的 6 孔板中培养健康的未分化人类 iPS Cs 。通常，对于 6 孔板的每个孔，使用 2 ml mTeSR1 培养基并每 24 小时更换一次。观察菌落形态，每天和观赏标志小号分化。
通过将培养的iPS细胞汇合时达到60-70％（约4 - 7 d）。通过用1ml处理每个孔从旧板解离的菌落ReLeSR和incubat荷兰国际集团为3 - 5分钟的上根据技术手册板盖。稀释离解的细胞凝集块小号和转让1/10 - 1/20的细胞到新的井预先涂有基质胶在2ml mTeSR1。有关详细信息，请重新FER以小号挠度3的技术手册：人多能性干细胞在维护的mTeSR TM 1 ，干细胞技术TM （https://www.stemcell.com/maintenance-of-人类多能干，干- cell-in-mtesr1.html）。

使用集成了gRNA 的Cas9 载体和ssODN转染人类 iPSC，以进行精确的基因编辑。
种子的iPSC小号在60 -毫米培养皿ES用于转染。
作为指导原则，每个孔在6 6孔板的0 - 70％confluenc ë具有大约1 × 10 6的iPSC。另一方面，每个 60 - mm 培养皿需要 4 × 10 5 -5 × 10 5 iPSC 进行播种。将用于播种的 iPSC 井总数乘以 1.2，以补偿收集和计数过程中的损失。
准备足够的 60 - mm 细胞培养级培养皿，涂有 Matrigel，用于 iPSC 接种。通常，为将要生成的每个克隆准备一个培养皿，再加上一个用于评估转染效率的培养皿。
当在6孔平板中的iPSC达到一个confluenc Ë的60-70％，计算转染所需的iPSC的数目。检查细胞形态和手动刮除下的任何区别殖民地一解离前体视显微镜。不要使用超过 20%的菌落有分化迹象的培养物。从除去培养基的板和加入1ml的Accutase每孔。P花边板放回培养箱并等待10分钟以解离细胞。
10 分钟后，将 1 ml 室温mTeSR添加到 6 孔板的每个孔中。将盘子靠在手掌上，轻轻地从底部取出任何剩余的细胞，而不会溢出培养基。从所有孔中收集介质插入15 -毫升无菌˚F爱尔康管，轻轻吸管上下5 - 7倍我们荷兰国际集团一个规则1 -毫升尖或玻璃吸管拌匀分手的团块。
确定细胞密度我们荷兰国际集团无论是血细胞计数器或自动细胞计数器如一个赛默飞伯爵夫人3.在这个阶段的细胞密度应为约3 × 10 5 - 6 × 10 5细胞/ ml。在此期间，保持˚F爱尔康管含有在室温下的细胞; d o 不要将细胞放在冰上。计算收集的细胞总数。
离心机在200 Falcon管×克在室温下5分钟，以沉淀所述细胞。小心地取出所有介质并添加等量的新鲜 mTeSR1。重悬的细胞沉淀我们荷兰国际集团大口径1 -毫升尖或玻璃吸管。在室温下再次以 200 × g离心细胞悬浮液5 分钟。
计算mTeSR1的最终体积需要用于接种的iPSC小号成60 -毫米培养皿ES ，加上一个菜一个转染对照。每道菜将需要 4-5 × 10 5细胞悬浮在 4 ml mTeSR1。将ROCK 抑制剂 Y27632添加到培养基中 5 μM的终浓度，以提高重新接种后的生存能力。如果多个菜（比方说，转染）是必需的，它中号AY更方便的是部分地重悬浮的细胞转移到一大50 -毫升˚F爱尔康管和转印后添加更多mTeSR1。卸下所有媒体小号TEP D1F与mTeSR1替代含Y27632。稀释的细胞至所需浓度和填充每个60 -毫米培养皿用4ml充分再悬浮的iPSC小号作为单细胞。在 37 °C、5% CO 2下孵育至少 12 小时。
转染的iPSC š与所述gRNA集成Cas9矢量和ssODN 。
转染前 1 小时，检查细胞生长并用 4 ml 新鲜无抗生素 mTeSR1 替换培养基。
对于每个60 -毫米培养皿，制备在1.5以下的混合物-毫升管。上下吸管混合均匀。对于对照培养皿，更换pSpCas9（BB）-2A-迪普罗构建体与所述的pEGFP-N2质粒。
成分

量（微升）

pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 与 gRNA 插入，

1微克/微升

3

ssODN ，1微克/微升

3

Opti-MEM I 减血清培养基

473

全部的

479

将 21 μl FuGene HD 转染试剂（DNA：试剂比例为 1:3.5，总共 500 μl ）添加到步骤 D2b 的混合物中，并短暂涡旋（2 - 3 秒）管以混合。在室温下孵育最终混合物 6 分钟。
加入DNA：的FuGENE ：的Opti-MEM我混合到了60 -毫米菜，轻轻摇动混合。不要吸管向上和向下，因为这会干扰与转染过程。在 37 °C、5% CO 2下孵育24 小时。

使用嘌呤霉素选择阳性克隆和评估的转染效率。
使用嘌呤霉素选择阳性克隆
注：一个LSO阅读小号TEP D2 。

对于转染的所有菜肴的pSpCas9（BB）-2A-迪普罗构建体，添加4毫升mTeSR1补充有0.5微克/微升每个培养皿嘌呤霉素选择性富集的与转染的细胞的pSpCas9（BB）-2A-迪普罗构建体，它带有一个嘌呤霉素resistan CE盒。使用可能需要优化解嘌呤霉素的浓度ž细胞上通货膨胀系特异性的基础，因为细胞系可能具有非常不同的嘌呤霉素耐受性水平（范围从0.3至0.7微克/微升）。在 37 °C、5% CO 2下孵育菜肴24 小时。
小心地取出媒体和任何死细胞小号的或细胞碎片的菜肴。每道菜添加 4 ml mTeSR1，并辅以 0.3 μg / μl （或由先前的测定确定）嘌呤霉素。在 37 °C、5% CO 2下孵育菜肴24 小时。
小心地取出媒体和任何死细胞小号的或细胞碎片的菜肴。从此时间（转染后 72 小时）撤回嘌呤霉素选择。加入4毫升的mTeSR并更换了日常培养基。孵育在37碗碟℃，5％CO 2 5-10 d直到所述iPSC集落达到了适当的大小以便克隆选择（1.5 - 2毫米的直径，图3）。

图3 。用于克隆选择的 iPSC 集落示例

评估的通过EGFP表达转染效率。该步骤应与并行地执行小号TEP D1。
用于与所述的pEGFP-N2质粒转染的菜，小心地更换的用4ml新鲜培养基的mTeSR不含嘌呤霉素。在 37 °C、5% CO 2下孵育这道菜24 小时。
用另外 4 ml不含嘌呤霉素的新鲜mTeSR替换培养基。在 37 °C、5% CO 2下再培养 24 小时。
计算几个视野以评估EGFP+ 细胞的百分比。转染效率，如由EGFP +细胞的百分比计算的，应至少为40 - 50％。
分离单个iPSC集落的genotyp Ë阳性克隆鉴定。
菌落采摘的当天，制备一个平底ED 96孔板涂布有基质胶（简称到作为板A）。添加80微升mTeSR1含有10 μM ROCK抑制剂Y27632到每个孔板A.制备另一未经涂覆的96孔板（简称到作为板B，平底编孔）。
在60更换介质-毫米培养皿以新鲜ROCK抑制剂成分的mTeSR1。
将 P100 或 P200 移液器设置为 50 μl 。附上P200尖端和使用尖端刮去一个单菌落。吸出刮落的集落或它的片段（如果该过程期间，菌落中断）我们荷兰国际集团的移液管和转移其所有内容（50微升）与一个的孔板A.轻轻吸管上下3次打破细胞团. 不更换移液器吸头，将 50 μl从板 A转移到板 B 的相应孔中（例如，A1 孔到 A1 孔等）重复此步骤直到60 - mm 培养皿上的所有感兴趣的菌落都被挑取向上。
降速在200两个板×克为在室温下用5分钟的上盖子。
保持板甲在37 ℃，5％CO 2中24小时，以允许iPSC集小号重新连接到孔中。继续到孵育板和（100每日更换介质微升每孔mTeSR1）。板 A 将用于基因分型后的进一步克隆扩增。
使用板 B 进行 DNA 提取。
从小心地取出盘B的离心无晃动，并置于冰上。使用移液管或多通道移液管（设置为 200 μl ）小心地从孔中取出培养基，而不会干扰细胞沉淀。不要使用真空抽吸作为该细胞沉淀不牢固地附着在底部。重复此步骤以从板上的所有孔中取出介质。
添加16微升快速DNA提取缓冲液（Lucigen / VWR）加入每个孔含有的细胞沉淀。将 P10 或 P50 多通道移液器设置为 10 μl 。小心地上下吸管 5 次混合；米尼米ž ë气泡形成。此步骤重悬细胞并进行细胞裂解以供后续使用。
传输所有（16微升）的混合细胞悬液到96孔PCR板和密封使用任一š条纹帽或薄膜。将板标记为“提取的 DNA”，并带有名称和日期。如果不立即使用（1-2 周）或 -80 °C 以延长储存时间，则此步骤的产品应储存在 -20 °C 。设置了如下的热循环和丢弃盘B 。
步＃

温度

时间

笔记

1

65°C

15分钟

2

68°C

15分钟

3

98 ℃

10分钟

4

4 ℃

抓住

在 Sanger 测序仪上进行 DNA 测序的样品制备。
使用上一步中快速分离的 DNA 作为模板准备 PCR 反应混合物。根据以下图表装配在冰上的反应中，含多处ÿ通过为每个组件并进一步含多处的样本数ÿ 1.1以补偿试剂转移期间潜在损失。
成分

量（微升）

10 × PCR 缓冲液

1

10 × PCR 增强剂

1

50 mM 硫酸镁4

0.3

10 mM dNTP

0.2

正向引物 (10 μM )

0.2

反向引物 (10 μM )

0.2

Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶

0.1

水，PCR 级

5.5

全部的

8.5

混合所有成分而无需在1.5 DNA模板-在冰上毫升管。使用一个新的96孔PCR板和分配8.5微升，直到所有的反应混合物加入每个孔中的期望的孔被填充。随后，将 1.5 μl提取的 DNA添加到每个孔中（总共 10 μl ）。使用设置为 5 μl的 P10 移液管上下移液以充分混合，同时避免气泡形成。如果使用多道移液器进行此操作会更方便。
使用带条纹的盖子或薄膜密封 PCR 板的顶部，并将板标记为“PCR 产品” 。设置了热循环如下。退火温度（3）和延伸时间（4）可能需要优化解Ž通货膨胀，当操作者认为合适的。
步＃

温度

时间

笔记

1

95℃

10分钟

Taq激活

2

95℃

30 秒

3

53°C

90 秒

或视情况而定

4

72 ℃

60 秒

或视情况而定

5

/

/

转至 2, 40 个循环

6

72 ℃

10分钟

最终延期

7

4 ℃

抓住

WH ILE PCR反应运行时，设置一个或更多1.25％TAE / TBE琼脂糖凝胶小号具有一个足够数量的井š为保持至少20个样品进行PCR效率检查。
组装该小号hrimp一个lkaline p hosphatase（SAP）的反应混合物在冰上以除去单链编DNA和dNTP从根据下面的图表的PCR产物。乘法由每个组件和进一步的样本数含多处ÿ 1.1以补偿试剂转移期间潜在损失。
成分

量（微升）

10 × SAP 缓冲区

0.5

虾碱性磷酸酶 (SAP)

0.5

核酸外切酶 I

0.1

水，PCR 级

3.9

全部的

5

PCR反应结束后，使用一个新的96孔PCR板和分配5微升SAP混合到每个孔中，直到所有的期望的孔被填充。随后，转印5微升从板的产物（总体积的1/2）标记为相应的井“PCR产物”中的96孔板中保持的SAP混合物（共计10微升）。上下吸管混合均匀，同时避免气泡形成。纪念板作为“SAP的产品”，并设置了热循环如下。
步＃

温度

时间

笔记

1

37℃

50 分钟

2

95℃

15分钟

3

4 ℃

抓住

在 SAP 反应运行时，将 1 .5 μl 6 ×加载染料添加到“PCR 产物”板的选定孔中，并将其内容物加载到步骤 E4g 中制备的 TAE/TBE 凝胶上。使用适当的分子梯在 100 V 下运行凝胶至少 25 分钟。检查的形状，数量和清晰的条带在每个通道。拍摄图像，并保持其备案小号。

图4 。PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果样本。泳道 3 的 DNA 太少，无法接受。泳道 2 尽管亮度降低，但 DNA 含量仍然可以接受。M：分子标记，1 kb，Promega G5711。

拍摄PCR 反应的凝胶图像后，计算“良好”反应的数量（具有正确分子大小和足够 DNA 量的单个条带，根据条带的亮度进行评估，参见图 4）并准备用于 Sanger 测序的混合物。根据下表在冰上组装 Sanger 反应混合物。乘法各组分的体积通过的“好”的反应只计数和由1.1进一步乘法结果自的BigDye终止子试剂是昂贵的。
成分

量（微升）

BigDye终结者V3.1

1

测序引物 (10 μM )

1

水，PCR 级

3

全部的

5

所述SAP反应结束后，使用一个新的96孔PCR板和分配5微升桑格测序混合物到每个孔中，直到所有的期望的孔被填充。随后，将 5 μl （总体积的 1/2）产品从标有“SAP 产品”的板转移到装有 Sanger 测序混合物（共 10 μl ）的 96 孔板的相应孔中。上下吸管混合均匀，同时避免气泡形成。标记板作为“序列PCR产物”，并设置了热循环如下。退火温度（3）可能需要优化解Ž通货膨胀，当操作者认为合适的。
步＃

温度

时间

笔记

1

96℃

10 秒

2

55℃

5 秒

或视情况而定

3

60℃

4 分钟

4

/

/

转至 2, 25 个循环

5

4°C

抓住

纯化使用测序PCR产物一Qiagen公司DyeE X 2.0 Spin试剂盒（最好≤16个样本）。如果染料实施例2.0 ķ它不可用或有16个以上的样品，跳过步骤E5J并在恢复步骤E5K。
松开ñ顶盖和折断离心柱的底部封闭。将离心柱插入收集管并以 750 × g离心3 分钟。
所述旋转柱转移至新的1.5 -毫升管标记的与所述样品名称。抽吸从相应井并缓慢测序PCR产物直接应用的反应产物到CENTE ř倾斜凝胶床的表面。再次以 750 × g离心3 分钟。
丢弃所述旋转柱并放置1.5 -毫升管中的离心式真空装置（如一个SpeedVac中）30-60分钟，直至所有的液体具有蒸发d 。在真空过程中不要打开加热。干燥后，加入15微升测序级甲酰胺向管和吸管上下10次，以溶解该DNA。继续执行步骤 E5kvii。
通过异丙醇沉淀纯化测序 PCR 产物。
注：（！）d enotes，这一步是关键和一个应该谨慎行事。

每孔加入 40 μl 75% 异丙醇，轻轻上下吹打5 次混合。如果使用多道移液器进行此操作会更方便。
在室温下孵育 20 分钟，然后在摆斗式离心机中在室温 (20°C) 下以 3,000 × g离心30 分钟。如果有离心机的冷却功能，请打开离心机的冷却功能，因为离心机内的空气可能会很快变热。
小心地从离心机中取出板，不要摇晃。倒置板到3 -纸的4层毛巾轻轻倾析的异丙醇。重复该过程一次与另一种新鲜3 - 4层纸毛巾，并保持倒10秒的板以除去尽可能多的异丙醇越好。不要用移液或者一个真空并移除任何剩余的异丙醇从井。
翻转96孔板背面缓慢LY，并小心地添加150微升75％的异丙醇到每个孔中，以洗涤沉淀。
重要提示：不要混合！如果使用多通道移液器进行此操作会更方便。将板再次以 3 , 000 × g离心10 分钟。

小心倒置纸在板上巾堆叠如步骤E5kiii倾析的异丙醇。保持反转的板（！），小心地将其转移到一个新的纸毛巾叠，再次离心以300 ×克（！），持续1分钟，以消除该残留的异丙醇。
小心地从离心机中取出 96 孔板并将其翻转回来。向每个孔中加入 15 μl测序级甲酰胺，并上下移液 5 次以混合。避免在井内形成气泡。
密封带粘接膜的板和变性的在95℃下的DNA热循环仪上2分钟。立即将板置于冰上并孵育 2 分钟。
将板以 2000 × g离心1 分钟。该板现在准备Sanger测序注射上的ABI3730分之310/ 3730XL / 3500序器。

扩大与阳性克隆的期望的基因型。
检查测序光谱文件我们荷兰国际集团猿或ABI的GeneMapper识别用于扩展阳性候选克隆（小号EE部分A，图1和图5）。扩增后的 iPSC 将用于进一步的单细胞亚克隆，以获得纯克隆。

图5 。质量好坏的样本测序光谱。A. 良好的结果，显示出清晰的离散峰。B. A B广告结果，显示出多发性overlapp荷兰国际集团峰组，暗示的多个PCR产物在测序输入的存在。C.一个糟糕的结果，显示出非常微弱的峰值信号。

当该菌落到达的适当大小（1.5 -直径2mm或60 - 70％confluenc Ë中的孔）在板A（来自步骤E3A），解离的通过首先祛瘀iPSC集落荷兰国际集团从所有介质的孔中。轻轻加入50微升ReLeSR到每个孔中，迅速吸出，并放置在室温下5分钟。
加入100微升mTeSR1到每个孔中并小心地移去的从细胞团块的底部的井通过轻敲板和使用常规刮P 200吸管尖。传送的内容小号各孔成一个孔的一个基质胶包被的4孔或24孔平板，并添加mTeSR1含有5 μM ROCK抑制剂至500的最终体积微升。继续在37培养℃，5％CO 2中与mTeSR1的每日清爽的培养箱，直到所述细胞达到60 - 70％confluenc Ë在孔中。
单细胞亚克隆获得纯等基因系。
小心地从取出介质的孔中，并随后添加400微升的Accutase每孔10分钟以解离的从底部的细胞。轻轻吸管上下使用P1000尖端，使5倍一个单细胞悬浮液，并然后添加另外400微升mTeSR1到neutrali Ž Ë所述的Accutase 。取 10 μl悬液，用台盼蓝法计算细胞密度，250 × g离心剩余细胞5 分钟。
去除上清液并将细胞重悬在含有5 μM ROCK 抑制剂 Y-27632 的1 ml mTeSR1中。隔离的体积相当于2000活细胞（如在先前步骤中所确定的）和replate成60 -毫米基质胶涂覆的培养皿在4毫升mTeSR1含有5 μM ROCK抑制剂Y27632。继续在 4/24 孔板中培养任何剩余的细胞作为备份。在 37 °C、5% CO 2下继续培养。
一半的介质在60取代-毫米培养皿与ROCK抑制剂成分的mTeSR1 48小时后重新铺板。在37继续培养℃，5％CO 2中与mTeSR1的每日清爽直到菌落大小培养箱达到1.5 -在直径为2毫米。重复步骤 E3 中所述的菌落挑选程序。从每 60 个菌落中挑选大约 30 个菌落—— 毫米菜。对选定的菌落重复基因分型程序，如步骤s E4 - E 5 所述。
一旦纯克隆已经鉴定了由Sanger测序，重复步骤F1至各菌落从转移的（！）96孔板2的孔中的直到Matrigel包被24分之4孔板的confluenc ë达到60 - 70％。继续监测细胞生长，因为在这个阶段不同的克隆可能有不同的生长速度。
从孔中取出培养基，并在每个孔中加入 400 μl ReLeSR 。除去ReLeSR从所述孔中，并孵育在室温下5分钟。
用 Matrigel 涂覆足够的 6 孔板，每孔加入 2 ml mTeSR1。添加300微升mTeSR1到二十四分之四孔板用处理的每个孔ReLeSR并轻轻吸管上下使用宽孔移液管尖端以解离5倍的细胞团块。将 100 μl细胞团悬液分装到 6 孔板的每个孔中（共 3 个孔），轻轻摇晃混合。准备4 - 6口井，每个克隆。继续孵化，直到该confluenc ë达到60 - 70％。
冷冻细胞系用于冷冻保存。
密切观察6孔板中的细胞生长，直到所述confluenc ë达到60 - 70％。建议是在同一块板上所有孔进行加工于一体的运行。
在 6孔板的每孔中加入 1 ml ReLeSR 。除去ReLeSR从所述孔中，并孵育3 -在37℃，5％CO 5分钟2的培养箱中。
加入1ml室温mTeSR1每孔处理的6孔板的ReLeSR和移出所述通过牢固地轻敲板细胞。转移撞出的细胞悬浮到无菌1.5 -毫升Eppendorf管中并离心分离机，在200 ×克为在室温下5分钟。
小心地去除尽可能多的上清液，不要接触底部的细胞沉淀。加入1ml室温mFreSR到Eppendorf管中，并使用大口径吸管尖用移液管小心地重悬细胞沉淀婷上下5次。传送管内容小号到预标记的冷冻管筒。确认试管已牢固密封并将其放入 Mr Frosty 冷冻容器中。通常，为每个克隆准备尽可能多的管（通常为步骤s F2d - F2 f 中确定的4 - 6 管）。重复此步骤，直到所有的细胞已被转移到冷冻管。
放置雾先生冷冻容器含有冷冻管在-80℃冰箱中至少24小时（但没有再高于72小时），以冻结的内容。将所有小瓶移至液态 N 2以进行长期储存。保留详细记录。

数据分析

Sanger测序结果的光谱分析
精确编辑的纯同基因克隆的成功鉴定和分离在很大程度上依赖于对 Sanger 测序结果的正确分析。作为指导方针，首先除去样品具有低信号强度，异常模式（例如，当相同类型的核苷酸碱基在连续出现“合并”大的峰而不是单个峰一个序列，参见图5）。随后，通过检查所需 SNP 位点的基因型来鉴定阳性克隆。

gRNA 和ssODN效率的评估
由于ssODN整合和随后的精确 SNP 编辑需要 CRISPR/Cas9 介导的 DNA 切割优先，因此 CRISPR/Cas9 介导的 DNA 切割和ssODN整合的效率需要独立评估。通常，由于大多数 CRISPR/Cas9 介导的 DNA 断裂没有得到适当修复并产生 indel，因此生成的含 indel 克隆（见图 1）的百分比可以作为实验中使用的gRNA 序列效率的指标。含有插入缺失的克隆的百分比为约60 -对于一个成功gRNA序列设计的80％。ssODN的整合在大约 5% 的 CRISPR/Cas9 介导的 DNA 切割事件中相对稳定。如果阳性克隆的数目是低的，从桑格测序结果分别计算这两个事件的可能性，以确定哪些寡聚序列m AY是原因，需要重新设计。

致谢

资金：R01MH106575、R01MH116281、R01AG063175。我们承认由 Ran等人提出的起源概念。(2013)和Zhang等人的进一步方法论证。(2020) ( D oi: 10.1126/ science.aay 3983) 。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

北岸大学卫生系统机构审查委员会 (IRB) 批准了这项研究。

参考

Forrest, MP, Zhang, H., Moy, W., McGowan, H., Leites , C., Dionisio, LE, Xu, Z., Shi, J., Sanders, AR, Greenleaf, WJ, Cowan, CA,庞，ZP，Gejman ，PV，彭泽斯，P。和段，J。（2017）。hiPSC 衍生神经元中的开放染色质分析优先考虑功能性非编码精神病风险变异并突出神经发育位点。细胞干细胞21(3)：305-318 e308。
Forsyth, NR, Musio , A., Vezzoni , P., Simpson, AH, Noble, BS 和McWhir , J. (2006)。生理氧可增强人类胚胎干细胞克隆恢复并减少染色体异常。克隆干细胞8(1): 16-23。
Hendel, A., Kildebeck , EJ, Fine, EJ, Clark, J., Punjya , N., Sebastiano, V., Bao, G. 和Porteus , MH (2014)。使用 SMRT 测序量化内源基因座的基因组编辑结果。细胞代表7(1)：293-305。
Howden , SE, Maufort , JP, Duffin, BM, Elefanty , AG, Stanley, EG 和 Thomson, JA (2015)。患者成纤维细胞的同时重编程和基因校正。干细胞报告5(6)：1109-1118。
Miyaoka, Y., Chan, AH, Judge, LM, Yoo , J., Huang, M., Nguyen, TD, Lizarraga, PP, So, PL 和 Conklin, BR (2014)。无需抗生素选择即可分离单碱基基因组编辑的人类 iPS 细胞。Nat 方法11(3): 291-293。
Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala , V., Scott, DA 和 Zhang, F. (2013)。使用 CRISPR-Cas9 系统进行基因组工程。纳特Protoc 8（11）：2281至2308年。
Tidball, AM, Swaminathan, P., Dang, LT 和 Parent, JM (2018)。结合 CRISPR Indel 形成和人成纤维细胞重编程生成功能丧失的 iPSC 系。生物协议8(7)。
Zhang, S., Moy, W., Zhang, H., Leites , C., McGowan, H., Shi, J., Sanders, AR, Pang, ZP, Gejman , PV 和 Duan, J. (2018)。开放染色质动力学揭示了基于 hiPSC 的神经发育模型中的阶段特异性转录网络。干细胞研究29：88-98。
Zhang, S., Zhang, H., Zhou, Y., Qiao , M., Zhao, S., Kozlova , A., Shi, J., Sanders, AR, Wang, G., Luo, K., Sengupta , S., West, S., Qian, S., Streit , M., Avramopoulos, D., Cowan, CA, Chen, M., Pang, ZP, Gejman , PV, He, X. 和 Duan, J. (2020)。人类 iPSC 神经元中的等位基因特异性开放染色质阐明了功能性疾病变异。科学369（6503）：561-565。