材料和试剂

1.棉尖涂抹器（AMG Medical Inc.，目录号：018-450）

2.无纺布海绵（Covidien，目录号：9022）

3.医用胶带（3M，目录号：1527-1）

4. 70% 异丙醇垫（Alliance，目录号：211-MM-05507）

5.循环水暖垫（Stryker，目录号：TP700）

6. 26 G血管导管（Venisystems Abbocath -T，目录号：G944-A01）

7.导管注射帽（SAI Infusion Technologies，目录号：IC）

8. 1 ml胰岛素注射器（BD Bioscie nces ，目录号：BD329654）

9. 27 G 针（BD Bioscie nces ，目录号：BD305109）

10. 18 G 钝针（BD Bioscie nces ，目录号：BD305180）

11.波长Ç利尔ù ltrasound克EL（国家治疗产品公司，目录号：NTPC502X）

12.盐水袋浸入 37 °C 水浴加热

13.成年小鼠，20-50 克

14.感兴趣的治疗剂

15.无菌生理盐水（Baxter，目录号：2B1307）

16.无菌肝素盐水（Baxter，目录号：AHB0953U）

17.脱毛霜（例如，威特或奈尔）

18.润滑剂眼膏（刷新Lacri -大号UBE ，眼力，目录号：00210889）

19. Definity微泡（Lantheus Medical Imaging，目录号：DE4）。储存：4°C

20. Gadovist （拜耳，目录号：02241089）。储存：室温

21.异氟醚（Fresenius Kabi ，目录号：M60303）

设备

1.剪刀（Fine Science Tools，目录号：14088-10）

2.小动物电动修剪器（Wahl Clipper，目录号：58112）

3.带毯子的强制空气加温装置（Medtronic，目录号：WT 6000）

4.小动物体重秤

5. Vialmix机械振动装置（Lantheus Medical Imaging，目录号：VMIX）

6.连接感应室和鼻锥的小动物麻醉机

7.将麻醉机连接到位于 FUS 系统和 MR 扫描仪上的动物的塑料管

8.尾静脉置管用IIA2级生物安全柜

9.小动物 7T MRI（布鲁克，7T 水平孔Avance BioSpec 70/30 USR 扫描仪）

10. MRI 体线圈（Bruker，型号：86 mm Quad SN37）

11. MRI 表面线圈（布鲁克，型号：86 mm Quad Receive）

12. LP100 聚焦超声系统（FUS Instruments, Inc.）包括：

1.68 MHz 球面弯曲换能器（0.8 焦数，75 毫米外径，20 毫米内径）
聚偏二氟乙烯或锆钛酸铅水听器
函数发生器
14 位示波器卡
50 W 射频功率放大器
射频功率计
外部匹配电路
所有三个正交轴的电动定位系统
脱气和去离子水箱
MR I兼容雪橇配备麻醉鼻锥和固定装置，固定装置由两个含有脱气和去离子水的 Kapton 聚酰亚胺膜组成
兼容 MR 的寻焦标记
13.氧气供应

14.医用空气供应

软件

ParaVision 5.0 (布鲁克)
控制软件玲和监控FUS曝光（FUS仪器公司）

程序

从附属机构获得动物使用协议的批准
动物实验必须遵循设施动物护理委员会根据相关政府立法制定的指导方针和政策。

MRI 和 FUS 系统的实验设置和联合配准
1.将FUS系统的实验设置在图1A中被示出为1 D.

2.安装超声换能器到机动定位系统的臂和沉浸它进入脱气和去离子水缸。

3.在 FUS 系统的组件之间建立连接（见图 1A）。

4.将与 MR 兼容的雪橇放置在水浴上方的板上进行空间注册。

5.将换能器放置在聚酰亚胺薄膜固定装置下方。超声处理采用连续模式在0.5 W和位置在换能器焦点水表面罐中以产生少量的水锥形喷泉。

6.在换能器焦点处贴上寻焦标记。关闭函数发生器的输出。

7.将滑橇放入 MRI 扫描仪中，并对寻焦标记执行三轴定位器扫描。使用 FUS Instruments 软件, 输入标记的 MRI 空间坐标, 以将换能器定位系统与成像系统进行配准。在Xhima等人。（2020），一个FLASH tripilot用TE / TR = 3序列毫秒/ 200毫秒，切片厚度= 1毫米，并且在-平面内分辨率= 0.23 × 0.23毫米的执行以采集MR图像。

图 1. FUS 曝光的 LP100 设置。(A) FUS 介导的 BBB 通透性增强系统组件示意图。来自Xhima等人。(2020)。© 作者，保留部分权利，独家被许可人 AAAS。在 CC BY-NC 4.0 许可下分发。（B）侧视和的（CD）的顶视图的实验装置。

小鼠准备
1.辖0.5毫升的生理盐水皮下注射前一天实验和大约45分钟的预超声处理以确保对尾静脉导管放置充分水化。

2.小鼠必须加热以扩张尾静脉以成功插入导管。在麻醉前在 38 ° C的强制空气加温毯下预热家笼约 30 分钟，并在导管插入期间麻醉时将鼠标保持在温水垫上。

3.在IIA2级生物安全柜中使用无菌技术进行尾静脉置管。

将鼠标放在感应室中, 并使用异氟醚 (5%) 和氧气载气 (流速 = 1 升/分钟) 进行麻醉。
当动物被麻醉时，将其从感应室中取出并轻轻安装鼻锥。将异氟醚蒸发器设置为 2%（或有效剂量）。
涂抹润滑眼膏，防止眼睛过度干燥。重-根据需要申请。
用酒精准备垫清洁尾部。
用肝素盐水灌注 26 G血管导管，然后将其插入尾静脉。从导管中取出引导针并固定导管注射帽。
通过导管冲洗肝素盐水, 以确认尾静脉内的正确放置。背压表明放置不当。
通过沿尾部的长轴固定的刚性结构到导管增加结构支撑件（例如，一个狭窄的木制销钉棉-涂药器）用医用胶带。
4.用电动理发器和脱毛膏去除头部背面（从眼线到颈部）的毛发。

5.用温和的清洁剂和温水清洗脱毛膏。用纱布和酒精棉签擦拭皮肤。

6.确定小鼠的体重以计算注射量。

MRIgFUS介导的基底前脑 BBB 通透性
该过程的实验时间表如图 2A 所示。
将超声凝胶应用于 MR 兼容雪橇上的 Kapton 聚酰亚胺窗口，并将麻醉鼠标置于雪橇上的仰卧位置。确保存在用于无阻碍路径的超声波从换能器传播，通过所述聚酰亚胺卡普顿窗口，与鼠脑。使用异氟醚 (1-1.5% 或剂量效应) 将鼻锥连接到连接到麻醉机的塑料管上, 使用医用空气载气 (流速 = 1 L/min)。用医用胶带将头部固定到 MR 兼容的雪橇上，以尽量减少手术过程中的移动。在手术过程中头部的移动会降低 FUS 瞄准的准确性。
覆盖用加热的生理盐水袋鼠标的主体到MAINT AIN在手术期间核心温度（参见图1D）。
将固定在雪橇上的鼠标放入 MRI 扫描仪中，并获取用于目标规划的大脑图像（tripilot 、轴向 T1 加权和轴向 T2 加权序列；参见图2 B 和2 C）。在Xhima等人。（2020），RARE T1加权IM用TE / TR = 10获得年龄毫秒/ 500毫秒，RARE因子= 2，平均值= 3，切片厚度= 1.5mm时，片的数目= 5 ，一个d在-平面内分辨率= 0.25 × 0.25 毫米。用TE得到RARE T2加权图像/ TR = 75毫秒/ 4000毫秒，RARE因子= 10，平均= 4，切片厚度= 1.5mm时，片= 5的数，和在-平面内分辨率= 0.25 × 0.25毫米。
在 FUS 仪器软件中，从 T2 加权扫描中选择基底前脑中的目标点（图 2B）。Broca 的内侧隔膜/垂直对角带 (MS/VDB) 以一个焦点为目标。Broca 基底核/水平带 (NBM/HDB) 的目标是两个焦点。侧脑室用作 MRI 可见的解剖标志，以在适当的轴向 MR 图像上定位内侧焦斑。根据来自小鼠神经解剖图谱的立体坐标定位侧向焦点（Paxinos和 Franklin，2012）。
将雪橇放在 FUS 系统上。使用以下 FUS 参数执行超声处理：1.68 MHz 频率、10毫秒突发长度、1 Hz 脉冲重复频率、120 秒持续时间和1% 占空比。所述p为无源空化检测arameters是20MHz的采样率和800毫伏的输入范围。一种类似于 O'Reilly 和Hynynen (2012)描述的声反馈控制算法，用于根据体内微泡响应校准峰值负压 (PNP) 。简而言之，起始 PNP 设置为 250 kPa（在没有颅骨衰减的水中测量）并每秒递增25 kPa。在超声处理开始后 10 秒内传送 Definity 微泡以收集基线声发射。一旦 0.5ƒ 处的声发射幅度超过每个目标的基线水平的 3.5 倍，超声处理压力将下降 75%，并在超声处理的剩余时间内保持在该水平。
要制备 Definity 微泡，请在激活前让小瓶达到室温。摇动Vialmix设备中的 Definity 小瓶45 秒。使用带有 1 ml注射器的钝填充 18 G 针头从小瓶中缓慢抽取 0.5 ml 微泡。在超声处理之前，将 0.02 毫升微泡加入 1 毫升注射器中的 0.98 毫升生理盐水中，轻轻混合直至混合均匀。超声开始 10 秒后，使用钝填充 18 G 针头通过尾静脉导管缓慢注入 1 ml/kg 的微泡稀释液，然后注入 0.15 ml 生理盐水冲洗。
注入所需的治疗剂，然后通过导管0.15毫升生理盐水冲洗突发之后立即触发分谐波的排放，使得第一通的药物进入以下BBB通透性增强聚焦体积。
在 1 毫升注射器中用0.9 毫升生理盐水中的0.1 毫升Gadovist制备Gadovist的稀释液。注射 1ml/kg 稀释溶液，然后用 0.15ml 生理盐水冲洗。
将雪橇放入 MRI 扫描仪中，并使用 T1 加权序列获取图像（图 2D）。
将鼠标返回手术室以取出尾静脉导管。用纱布按压穿刺部位直至出血停止。根据实验时间表，小鼠应立即处死或从麻醉中恢复。

图 2.针对基底前脑的MRIgFUS实验装置。（甲）的时间轴的实验程序，包括MRI，FUS曝光，和相关的注射剂。( B ) FUS 目标点是从 T2 加权 (T2w) MR 图像 (红点) 的基底前脑中选择的。( C )在 FUS 曝光之前收集的 T1 加权 (T1w) MR 图像。( D )在对比增强 T1w (CE-T1w) MRI 上可视化为信号强度增加的区域（红色圆圈）的FUS 靶向区域的 BBB 渗透性增强。比例尺 (BD)，5 毫米。

数据分析

可以进行几种分析来评估MRIgFUS诱导的 BBB 通透性增强和基底前脑中的药物递送。对跨实验条件的 BBB 渗透性分布和程度的考虑代表了对药物递送的重要控制；也就是说，FUS 介导的 BBB 调节本身允许内源性因素从血液中渗透，这会引起生物效应，这可能会影响对与药物安全性和有效性相关的结果测量的解释。我们在本节中总结了MRIgFUS后BBB 通透性的常见分析方法。

1.对比增强 MRI 对 BBB 调制的体内评估。FUS 靶向病灶中的 BBB 通透性可以通过对比度的体素强度变化进行评估-在静脉注射基于钆的 MRI 造影剂后获得的增强的 T1 加权 MR 图像。FUS 治疗后 MRI 对比度增强的基于区域的分析可以揭示 FUS 靶向结构和相邻非靶向大脑区域中 BBB 通透性增加的程度。在图 3 中，我们使用计算管道对样本数据集中的增强进行了基于区域的自动分析，该计算管道对 Allen Mou se 脑参考图谱 (ARA) ( https://miracl )执行基于强度和多尺度的图像配准.readthedocs.io；Goubran等人，2019 年）。由于在MRI扫描的Z尺寸切片的有限数量，我们在整个代替的执行条带级登记-脑3D映射（图3A）。需要手动初始化步骤，从而选择来自 ARA 的相应部分来限制注册算法的目标搜索（图 3B）。预处理步骤包括使用N4算法（以消除不均匀性），视场的裁剪偏置场校正，和颅骨汽提以提取前的登记大脑。ARA 50 μm分辨率模板用于配准。为了应对MRI扫描的相对较低的分辨率，艾伦的较低深度版地图集标签由分组基于地图集标签分析创建本体和层次，打造“盛大-父”标签（图3B）。登记步骤包括基于强度的b样条，三阶段登记的与增加其变换的自由度，包含刚性，仿射，以及非刚性（变形的）对称归一化级小号，每个由一个多分辨率的有接近4倍的水平。我们采用互信息相似度度量。注册的净产物是一种变换图像和从MRI机的空间进行双向翘曲和向和从所述ARA模板和标签（图3C）。我们使用原始 MRI 空间中的扭曲 ARA 标签按最高体素最大强度（T1 加权信号）对区域进行排序（图 3D）。该分析定量地证实了基底前脑结构中的 FUS 靶向和增强，以及我们的单晶换能器设置在背侧纹状体中的一些脱靶效应。

图 3. MRIgFUS靶向基底前脑中BBB 通透性增强的区域分析。( A )前后 FUS T1 加权 MR 扫描的轴向切片。( B )左：用于配准的ARA 50 μm模板的相应轴向切片；右：ARA标签与左半球展示了原标签和右半球突出分组“盛大-父母在用于MRI分析较低深度标签。( C ) ARA 标签注册到 FUS 后 MRI 扫描并扭曲到本地 MRI 空间。（d ）平均MRI脑部区域内的对比度增强，包括基底前脑结构，背侧纹状体强度，和isocortex 。比例尺（A和B），5 毫米。

2.给药与对比增强MRI之间的相关性。在Xhima等人。(2020)，FUS 后对比增强 T1 加权图像上信号强度的增加与递送至基底前脑的小分子药物 (~600 Da) 的浓度呈线性相关。然而，特定的药物特性（例如，分子量、亲水性、电荷和血浆半衰期）可能会影响药物外渗的程度（Marty等，2012）；因此，必须针对每种治疗方法估计造影剂浓度和药物浓度之间的相关性。动态对比增强（DCE）成像，与药动学建模相结合，已也被应用到捕获的BBB渗透性的动力学，并且表示用于估计药物递送以下FUS另一个预测工具（公园等人，2017）。

3. BBB 通透性增强的生化和/或组织学评价。在BBB渗透性变化可以通过检查血液中的蛋白质（外渗进行评估，即，白蛋白，纤维蛋白原，IgM抗体，和IgG）或外源的示踪剂引入FUS靶向脑组织血流。在Xhima等人。(2 020)，与血清白蛋白 (66.5 kDa )结合的伊文思蓝染料静脉内给药，随后通过免疫组织化学评估大脑中的标记（图 4）。请参考Xhima等人。（2020）用于组织处理，免疫组化，并与在图的组织学分析的图像采集程序4的Evans蓝染料外渗也可以与光学成像测定来测量（杨等人，2012）。d是与一对血清蛋白低结合亲和力（例如，耦合到生物素或荧光团葡聚糖胺）比内源性示踪剂小，可以揭示BBB通透性更微妙的变化（马丁等人，2012）。

图 4. MRIgFUS诱导的 BBB 通透性增强的组织学评估位于基底前脑。(A -E ) 在 FUS 靶向 MS/VDB (A)和 NBM/HDB (B) 的脑实质中检测到 Evans 蓝结合白蛋白（红色）的外渗，但在 FUS 治疗的小鼠的相邻脑区中不存在，包括海马（C），皮质（d），和纹状体（E）其中，伊文思蓝-白蛋白结合物的血管（白色）内的限制。(F -G ) 类似地，在静脉内接受伊文思蓝（无 FUS）的小鼠中，伊文思蓝结合白蛋白被限制在 MS/VDB (F)和 NBM/HDB (G)的脉管系统中。CG 中的黄色箭头表示在血管内共定位的Evans 蓝结合白蛋白的例子。胆碱乙酰转移酶（ChAT ，绿色）用于显示胆碱能细胞体。比例尺（A、B、F、G），20 μm和（C 到 E），100 μm 。

4. FUS 期间获得的声发射数据分析。FUS 期间O振荡微泡对血管壁施加直接力，导致 BBB 通透性的变化。从振荡微泡的声发射始发的频谱内容在体内可由此提供的洞察FUS诱导BBB通透性的性质。甲超声处理期间coustic排放可以进行评估，以确保整个测试对象，并用于与FUS诱导BBB调制可能影响药物安全性和有效性相关联的结果的措施相关联的生物效应对照一致BBB通透性增强。在图 5 中，我们展示了与MRIgFUS介导的小分子 D3 传递到基底前脑相关的声发射的典型分析。的0的峰值大小.5ƒ，ƒ，1.5ƒ，2ƒ ，和宽带排放从超声处理过程中的单个脉冲串在声学的曝光-平均幅度的图5.分析呈现排放也可以是信息性。如前所述对水听器信号进行分析（McMahon等，2020）。此外，在 FUS 暴露期间收集的次谐波发射构成了用于在超声期间校准PNP的声反馈控制策略的基础。我们将读者引向 Xhima等人。（2020 年）关于与FUS 介导的化合物 D3 向基底前脑递送相关的压力分析示例。

图 5. FUS 暴露期间获得的声发射分析。(A) 对于小鼠，声发射反馈控制算法设置为 250 kPa 的起始压力，并在每次后续爆发时递增 25 kPa，直到检测到次谐波发射。然后将施加的压力降低到检测到次谐波发射时的压力的 25%，并在超声处理的其余部分设置为该水平。（B - F）在FUS处理的对照的平均声发射的光谱分析（即，静脉内盐水，MRIgFUS到基底前脑）和D3 / FUS处理的小鼠（即，静脉内D3，MRIgFUS到基底前脑）。D3 是指与Xhima等人中的FUS 一起递送的小分子TrkA激动剂。, 2020. (G)超声处理目标的 2ƒ 0排放的峰值幅度与基底前脑中的药物递送表现出很强的线性相关性。

5. FUS 介导的药物递送后中枢和外周炎症和/或组织损伤的评估。人们一直关注由振荡微泡引起的 BBB 通透性增强引发的神经炎症反应和潜在组织损伤（Kovacs等人，2017 年；McMahon 和Hynynen 2017 年；McMahon等人，2020 年），尤其是在疾病状态下。在 FUS 介导的药物递送后，需要对坏死、细胞凋亡、出血和炎症进行组织学分析。与静脉给药相关的其他潜在外周副作用应作为整体药物安全性的一部分进行调查。

笔记

1.对于FUS介导的药物递送经过长期的实验端点，请按照机构动物使用协议，指导，并从麻醉动物复苏法规。

2. FUS，与静脉内注射的微泡的组合，可以被用来提供广泛的治疗剂，包括抗体，蛋白质，纳米颗粒，病毒载体，以及细胞，有针对性的脑区域（孟等人，2020）。生物制剂可以与微泡一起注入血流中，也可以将其封装成薄薄的或与微泡壳相连以增强递送（Meng等人，2020 年）。当治疗剂与 FUS 联合给药时，可能会发生相互作用，协同或拮抗地改变给定药物的作用。Ť ħ我们，对于需要重复给药化合物，初步药理实验被鼓励，包括具有至少三个剂量水平和用FUS递送药代动力学性质的测定的剂量-响应研究。

3.所有静脉内注射的最大体积（即，的Definity ，的Gadovist ，盐水，和治疗剂）不应在超声处理过程中超过25毫升/公斤的体重。为了最大限度地减少通过导管接头注射导致的剂量变化，要给药的体积应为20 μl或更大。此外，在确定静脉内给药的体积时，还应考虑治疗剂的溶液特性（例如，张力和pH）。

4.最合适的 FUS 参数和声空化机制，根据给定治疗剂的特性进行调整，需要个性化研究。本协议中描述的 FUS 参数和声反馈控制算法导致大血清蛋白外渗，包括埃文斯蓝结合白蛋白 (66.5 kDa ) 和内源性 IgG (150 kDa ) 和 IgM (970 kDa )，尽管在周围分布不同透化血管（Xhima等人，2020 年）。

5.监测系统以提高安全性并最大限度地减少测试对象内部和之间 BBB 开放的生物效应和治疗功效的变异性，代表了临床转化的重大进步。在这里，我们基于由振荡微泡产生的次谐波发射实施声反馈控制策略（O'Reilly 和Hynynen ，2012）。使用 FUS 进行空化监测和实时控制 BBB 调制的替代策略也在研究中（Sun等人，2017 年；Jones等人，2018 年）。

6.在之前的临床试验中，AAV2-NGF 载体双侧递送至 NBM 是通过六次单独注射实现的，单个注射部位的治疗分布有限（Tuszynski等人，2005 年和2015 年；Castle等人，2020 年） . 使用 FUS 定位 NBM 将是一个明显更快的过程，所有焦点都在一次超声处理中渗透。此外，相对于颅内注射，使用 FUS 可以通过在相同的超声处理方案中瞄准多个焦点来增加覆盖整个基底前脑的药物分布。

7.我们在本协议中使用 LP100（FUS Instruments, Inc.），如Xhima等人所述。(2020)。LP100 可以在 MR I房间外操作，就像我们在这里所做的那样，或者安装在临床 MRI 扫描仪中。RK300 (FUS Instruments, Inc.) 设计用于在小口径 MR 系统内执行超声处理。RK50 (FUS Instruments, Inc.) 使用立体定向引导而非 MR 成像进行目标选择。

8.对于FUS-有关药物递送应用安全和有效的临床平移，但是控制重要对于FUS诱导的BBB通透性增强的在不存在药物递送的影响作为整体的实验设计的一部分。与 FUS 诱导的 BBB 通透性相关的二次生物效应仍有待充分了解并正在积极调查中。例如，短暂神经炎症，Aβ的d tau蛋白的间隙，在神经元活性的改变，和升高的神经营养因子的水平都有报道以下FUS介导的BBB调制（Jordão酒店等人，2013;伯吉斯等人，2014; Leinenga和格茨， 2015；Kovacs等人，2017 年；McMahon 和Hynynen 2017 年；McMahon等人，2020 年；Meng等人，2020 年；Xhima等人，2020 年）。因此，我们建议inclu丁接收具有相同FUS曝光的药物载体溶液对照组。

9. BBB功能障碍可以发生以下一个在阿尔茨海默氏病和相关的痴呆，肌萎缩性侧索硬化，和抑郁症的情况下，行程。先前的证据也支持衰老过程中血脑转运机制的改变（Yang等，2020）。此外，中枢和外周炎症程度升高是许多脑部疾病的特征，这可能会进一步加剧 BBB 功能障碍（Menard等，2017；Abdullahi等，2018；Sweeney等，2018）。在BBB 完整性和炎症发生病理变化的情况下，重要的是要考虑由 FUS 介导的 BBB 调节本身引发的炎症和免疫反应的解决；这将确保的耐受性和安全性的FUS治疗，尤其是在R的情况下epeated计量范例。

10.实验组小鼠应平衡性别和体重。重要的是要考虑在病理和药物反应方面是否存在性别依赖性差异。例如，在 AD 的临床前模型中报告了 NBM 中胆碱能神经元数量的性别差异，而不是 MS/VDB 和相关行为（Kelley等，2014）。在人类中，基底前脑胆碱能系统的性别特异性差异和胆碱能靶向药物的益处已得到证实（Giacobini和Pepeu ，2018 年）。对 FUS 诱导的 BBB 渗透性反应的潜在性别差异仍有待彻底研究。男性和女性的 BBB 调节动力学可能不同，特别是在疾病状态下，因此可能需要重新考虑使用 FUS 给药的给药方案。

11.虽然由于我们当前 MRI 协议的平面外分辨率有限，图集配准是在切片级别上进行的，但可以使用更新的成像采集来实现 3D 全脑配准和后续分析。我们的 MRI-ARA 配准管道针对 3D 全脑配准进行了优化，并已在 Z 维更高分辨率的扫描中得到验证（Goubran等人，2019 年）。

致谢

该协议是适于从Xhima等。（2020 年）。我们感谢克里斯蒂娜Mikloska为MRIgFUS的专业知识和对获取的照片MRIgFUS设置。这项工作是由健康研究加拿大学院的支持（授予FRN 137064 ，166184，168906 ，以IA，FRN 154272授予KH），加拿大研究主席小号计划（IA一级加拿大研究主席在大脑修复和再生）时，美国国立卫生研究院国家生物医学成像和生物工程研究所（RO1-EB003268 授予 KH），以及Sunnybrook 健康科学中心 (KH) 聚焦超声研究的Temerty主席。FDC 基金会、WB 家庭基金会、Gerald 和 Carla Connor 以及韦斯顿脑研究所（TR130117 至 IA）提供了额外资金。KX 获得了 Frederick Banting 和 Charles Best Canada 研究生奖学金 (GSD 152271)。

利益争夺

KH是FUS仪器，临床前聚焦超声设备制造商，从他接受非研究的创始人之一-相关财务小号upport。他还是多项与使用超声波调制 BBB 相关的待批和已发布专利的发明者。其他作者声明没有竞争利益。

伦理

所有的动物程序经森尼布鲁克研究所动物保护委员会的批准，并按照进行的加拿大动物保护协会政策规定和安大略省的研究行动的动物。

参考

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