材料和试剂

任何品牌的校准移液器和移液器吸头
10 cm细胞组织培养皿es，Falcon（Fisher Scientific，目录号：353003）
15米升Falcon管小号（Dutscher ，目录号：352097）
50米升Falcon管小号（Dutscher ，目录号：352070）
细胞刮刀s，Falcon（Fisher Scientific，目录号：353085 ）
离心管小号（薄壁，超清除TM ，14 ml的，14 × 95毫米）（Beckman Coulter公司，目录号：344060）
冷冻管（的Nalgene，Dutscher ，目录号：028001）
RAW264.7 细胞（ATCC，目录号：TIB-71）
RPMI- G lutamax培养基（Gibco ，目录号：61870-044 ）
胎b绵羊小号erum（FBS）（Gibco公司，目录号：16030-074 ）
DMSO（Fisher Scientific，目录号：BP231-100）
胰蛋白酶/EDTA（Gibco，目录号：25300-054）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378-500G）
青霉素/小号treptomycin小号olution 100 × （青霉素/链霉素）（Sigma，目录号：P4458-100米升）
考马斯亮蓝 G-250（Thermo Fisher Scientific，目录号：100-25）
Novex 4 - 12% Bis-Tris SDS-PAGE 凝胶（Invitrogen，目录号：NP0322BOX）
多克隆兔抗 BSA IgG（Thermo Scientific，目录号：A11133）
多克隆绵羊抗 BSA IgG（Euromedex ，目录号：GTX77113）
氯仿（HPLC 级，Sigma，目录号：C2432）
甲醇（HPLC 级，Sigma，目录号：34860）
一次性培养管和它们的酚醛树脂盖小号，PTFE制的内衬小号（康宁，目录号：99447-13和9998-13）
内标17：0/17：0 PA可以注意到34：0_17：0 ，与第一数量反映了总碳数在两个脂肪酸和所述第二数目对应于数目碳小号在脂肪酸在SN1位置（Avanti Polar Lipids ，目录号：830856）
甲酸，98%（Sigma ，目录号：33015）
氢氧化铵溶液（Sigma ，目录号：221228）
甘油（默克，目录号：104093）
SDS（Sigma ，目录号：L4509）
Tris-HCl（Sigma ，目录号：25285-9）
β -巯基乙醇（Sigma公司，目录号：M3148）
HEPES游离酸（Sigma ，目录号：H4034）
EGTA（Sigma ，目录号：E4378）
MgCl 2 （Sigma ，目录号：M9272）
OptiPrep溶液（Sigma ，目录号：D1556）
异丙醇（Sigma ，目录号：I9516）
注射用小瓶s和c aps（安捷伦，目录号：5183-2067 和 5190-1599）
组织培养冷冻培养基（见食谱）
2 × Laem ml i缓冲液（见配方）
隔离介质（见配方）
梯度媒体（见食谱）
LC小号olvent （见食谱）
溶剂 A 和溶剂 B

设备

37°C 培养箱，含 5% CO 2
离心机（Eppendorf ，型号：5810）
超速离心机（贝克曼库尔特，型号：CO-LE80K）
预冷摆斗转子（贝克曼库尔特，型号：SW41）
的NuPage的Novex p rotein电泳装置（Invitrogen）的
Western印迹婷设备涡轮电转印（生物- [R广告）
超声波浴式超声波仪(Liebisch)
N 2流下的蒸发器（Organomation ）
超高性能 LC 1290 Infinity II 液相色谱系统（安捷伦）
Qtrap 6500 质谱仪 ( Sciex )
Luna C8 150 × 1 mm 色谱柱，100 Å 孔径，5 μm颗粒（Phenomenex ）
Dounce均质器和研杵（Sigma，目录号：P0735-1EA）

软件

Analyst 软件，版本 1.7.1 ( Sciex ) 和 Analyst Device Driver for Agilent 1.3 ( Sciex )
Multiquant软件版本 3.0.3 ( Sciex )

程序

RAW264.7 细胞培养
维持小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞在RPMI- Glutamax的培养基补充有10％热灭活的FBS，100U /米升青霉素，和100μg/米升链霉素在培养箱中在37℃5％CO在C 2 。使用最多 15 次传代的细胞。
对于每个通道，冲洗细胞2米升胰蛋白酶-EDTA，并随后孵育5分钟，在37℃。细胞悬浮在8米升RPMI- Glutamax的在800离心前补充有10％热灭活的FCS的培养基×克。
恢复在500细胞沉淀μ升组织培养冷冻培养基（见ř ecipes）和转让给ç在液氮ryovials进行存储，或在10米升用于在10厘米板调度用于进一步的培养或受抑吞噬培养基。

RAW264.7 细胞吞噬功能受挫
预涂层10 cm培养皿用BSA（3％）和任一兔抗BSA的IgG（0.04毫克/米升）或羊抗BSA的IgG（0.04毫克/米升）。
从汇合板收集的RAW264.7细胞，并确定每米的细胞数升用血细胞计数器。每 10 厘米细胞培养皿应接近 2 × 10 7个。暂停2 × 10 7细胞在冷的无血清培养基中孵育上的预涂覆的表面在4℃下进行1 ħ 。
加热至 37°C 30 分钟以开始细胞铺展。作为对照，在预先涂有免疫复合物并保持在 4°C 的表面上培养巨噬细胞，或在单独用 BSA 预先涂层的表面上培养。在这些条件下，巨噬细胞保持圆形并且不会散布在平板上（参见Kassas等，2017）。

亚细胞分离
刮RAW264.7从十个不同的10-cm培养皿中的巨噬细胞40米升PBS为每个条件（4℃或37℃）（图1）。
沉淀细胞，在200 ×克在40 7分钟，重悬米升隔离介质（见ř ecipe小号）。
重复该操作CE除去盐。
暂停的在40粒料米升有效均质含有100隔离介质毫蔗糖（稍微低渗培养基），在200和丸粒细胞×克（图1）。下低渗条件S，水流入细胞和诸CAU上课它们膨胀，有利于质膜破裂。
将沉淀物转移到玻璃 Dounce 匀浆器中，最后加入 10 ml l上清液以悬浮沉淀物。
用紧身杵通过 40 次均质化。
将所得混合物与剩余的上清液混合。
添加3.5米升含1.78蔗糖隔离介质（高渗介质）以使匀浆回至等渗状态，限制细胞器的进一步破裂。
补充 2 mM MgCl 2以在后续步骤中保留细胞核。
以 200 × g离心10 分钟以沉淀细胞核/未破碎的细胞（将沉淀保存为粗核沉淀）。
将上清液以 5,000 × g离心10 分钟以沉淀线粒体（将沉淀另存为线粒体）。
离心机以100,000上清液×克1个小时以沉淀ER，微粒，和质膜片段（微粒体沉淀物）。
将核后上清液以 300 × g离心10 分钟以去除残留的细胞核（图1）。
将线粒体后上清液以 5,000 × g离心10 分钟，以去除残留的线粒体（图1）。
在含MgCl 2的介质中清洗并重新沉淀粗核颗粒。在不含 MgCl 2 的培养基中清洗并重新沉淀线粒体。
保留 100,000 × g旋转的上清液作为细胞质部分。
如上述制备梯度介质的每个分数ř ecipes 。
将细胞核梯度培养基在 SW-41 转子中以 10,000 × g离心20 分钟，将线粒体l和微粒体梯度培养基以 50,000 × g离心2 小时（图1）。
在 30/35% OptiPrep界面恢复细胞核；17.5/25% 界面处的线粒体；质膜和内质网（ER）在10 / 17.5％和17.5 / 25％接口，分别; 和微粒体在密集的 25/35% 界面。
将每个样品冷冻在液氮中并储存在 -80°C 。
测量由每个样品中蛋白质浓度的布拉德福德分析（表1）。
Ñ OTE ：我们注意到在蛋白质浓度没有显著差异之间从保持在4℃或37℃（表RAW264.7细胞中获得的不同级分1）。

表1 。在不同的级分的蛋白质的量从16分离× 10 7 RAW264.7巨噬细胞下控制条件小号（4℃）或同时接受沮丧吞噬作用（37℃）。数值代表从三个独立制剂中获得的平均值± SD

检查的通过使用用于如先前所描述的不同级分的特异性标志物的免疫印迹馏分纯度（Kassas等人，2017;唐基等人。，2020）。合适的标记是细胞核：组蛋白H3，内质网：钙联接蛋白，质膜：钠+ / K + ATP酶，所述微粒体：细胞色素P450，线粒体：HSP-60，以及胞质溶胶：GAPDH

图1 。的从亚细胞分离的不同步骤的示意性表示，以脂质组小号分析。内质网 (ER)、线粒体 (Mito)、质膜 (PM)。

磷脂酸提取
转移的含有200微克蛋白质亚细胞的膜级分的样品玻璃离心管小号含有1米升水。
加入2米升氯仿/甲醇2/1 v / v和100微升34：0_17：0 PA（17用作内部标准μM），因为它不存在于所述样品由于奇数个碳。
在室温下超声 30秒并剧烈混合。
离心机为在800 5分钟×克在室温下以分离的有机相和水相。
收集下面的有机相并转移到干净的玻璃管中。
加入2米升氯仿，以在上部的水相。
超声处理 30秒并剧烈混合。
离心机为在800 5分钟×克在室温下以分离的有机相和水相。
收集下部的有机相，并与结合的在收集的有机相小号TEP d 5 。
使用蒸发器干燥合并的有机相（图1）。

专用于磷脂酸的质谱分析
在重悬的样品50微升洗脱剂A（LC溶剂，见ř ecipe小号）。
转移样品玻璃小瓶š适于注射。
P花边在自动进样器小瓶在4℃下。
在配备 Luna C8 150 × 1 mm 色谱柱的 LC 1 , 200 Infinity II 系统上分离 PA 种类，梯度如下（图1）：
0分钟小号酸在70％洗脱液A，30％洗脱液B（参见ř ecipe小号）。
在 50% 淋洗液 A、50% 淋洗液 B 下进行0 到 5 分钟的梯度上升。
5至30分钟，坡道20％洗脱剂A，80％洗脱剂B 。
在 5% 洗脱液 A、95% 洗脱液 B 下保持 31 到 41 分钟。
42至52分钟保持70％洗脱剂A，30％洗脱剂B 。
注意：专用于磷脂酸的质谱分析改编自Buré等人。, (2014)。

受试者的HPLC洗出液，以在负电离模式和随后的串联质谱分析在耦合电喷雾电离一个QTRAP 6 ，与此设备优化以下设置500质谱仪具有片段化过程中更好的强度：
停留时间 30毫秒。
去簇电势（DP）- 172 V 。
入口电位 (EP) – 10V 。
碰撞能量 (CE) – 46V 。
碰撞单元出口电位 (CXP) – 15V 。
定量使用多反应监测（MRM）转变信息的不同种类PA中发现Ť能够2 （见附加文件）。甲的n个实例的MRM色谱示于图2。

表2 。PA 的 MRM 离子对列表。所有 MRM 均在负模式下进行。Q1对应于母离子的质量（PA被带负电）和Q3的片段（离子女儿），ID对应于特定的过渡的质量：例如，PA28：0_14：0对应于PA与28个碳原子和无不饱和度，失去含14个碳原子的脂肪酸，无不饱和度。IS 表示内标。

图2 。PA 的所有搜索离子对的 MRM 色谱图示例。各颜色对应于用于特定PA种类的过渡，用于例如：绿色具有最大在14.5分钟相当于PA36：1_18：1 ; mar o on 最大值为 15.2 min对应于 PA38:2_18:1 ；紫色，最大值为 16.7 分钟，对应于 PA38:1_18:1 ；和蓝Ë与在10.5分钟的最大对应于PA40：6_18：0。检测信号的强度以每秒计数s (cps) 表示。

数据分析

在Multiquant 中定义积分参数：
集成算法 MQ4 。
高斯平滑宽度 1.0 点。
噪音百分比：40.0% 。
整合所有的样品小号使用Multiquant方法和每个MRM的峰（下报告该区域图3）。

图3 。来自经历受阻吞噬作用的 RAW 264.7 巨噬细胞的亚细胞膜组分中的 PA 水平。对于每个样品，在PA级瓦特为测量由重复的分析（各含有200μg蛋白质）的从细胞中每个亚细胞的膜级分或者保持在4℃或转移到37℃30分钟，并归一化至1种mg蛋白质。结果表示为从独立实验获得的每个样品的总 PA 水平的平均值± SEM (n = 3)。

综上所述对应于相同种类PA的过渡，如例如，PA 32：0与PA32：0_14：0，PA32：0_16：0和PA32：0_18：0 。
将结果呈现为对应于的PA种类的面积的比率小号和34：0_17：0 PA用作一个内标。

笔记

分析表明，在 RAW264.7 细胞从 4°C 切换到 37°C 后，PM 部分中的PA 水平增加，而 ER 部分中的PA 水平下降（图3）。在检测到的 33 个 PA 亚种中，11 个在至少一种膜组分中达到了总 PA 的2.5% 。这些最丰富的PA的分析显示出特异性富集的在不同的膜级分各自PA物种，一个馏分为多不饱和的ω-3中更大的可变性PA（40：6）（图4）。

图4 。来自 RAW 264.7 巨噬细胞的亚细胞膜组分中11 个最丰富的PA 亚种。对于每个样品PA亚种，水平进行了检测由重复的分析（各含有200μg蛋白质）的每个亚细胞的膜级分从保持在4℃下的细胞，并且表示的超过2.5％的11的总PA被示出。结果表示为所述的百分比的各样品中总PA水平±SD

该协议可应用于其他细胞系。最后的分数之间的分布可能因细胞系而异。通用协议可以在优化后应用于大多数细胞系，因为它们都包含亚细胞器。例如，我们最近开发了这个协议来测量来自神经分泌 PC12 细胞的血浆、高尔基体和分泌颗粒膜组分中的 PA 种类（Carmon等人，2020 年；Tanguy等人，2020 年）。

食谱

组织培养冷冻培养基
50% RPMI- Glutamax培养基

40% 胎牛血清

10% 二甲基亚砜

2 × Laem ml i缓冲液
125 mM tris-HCl (pH 6.8)

20% 甘油

2.5% SDS

2.5毫克/ 100米升考马斯亮蓝G-250

使用前新鲜混合：950 µl 2 × Laem ml i缓冲液和 50 µl β-巯基乙醇

隔离介质
250 mM 蔗糖

10 mM HEPES-Tris，pH 7.4

1 mM EGTA-Tris

渐变媒体
对于原子核

小号补编第隔离介质至5mM的MgCl 2 ，悬浮在12粗核沉淀米升最终体积25％OptiPrep ，并形成三个OptiPrep通过从在三个14底部向上层叠梯度-米升薄壁管：4米升10 ％OptiPrep 4个升在25％细胞核OptiPrep ，2.5米升30％OptiPrep ，1.5米升35％OptiPrep

对于线粒体

小号uspend线粒体升6馏分米升最终体积的35％OptiPrep和形式3个14 -米升管：2米升10％OptiPrep 4米升17.5％OptiPrep 4米升25％OptiPrep ，和2米升线粒体升35% OptiPrep 中的颗粒

对于剩余的膜

小号uspend微粒沉淀级分6 ml的终体积35％OptiPrep和形式3个14 -米升管：2米升10％OptiPrep 4米升17.5％OptiPrep 4米升25％OptiPrep ，和2米升微粒粒料35% OptiPrep

液相色谱溶剂
洗脱液A：我sopropanol / CH 3 OH / H 2 O（5/1/4）+ 0.2％甲酸+ 0.028％NH 3

洗脱剂B：我sopropanol + 0.2％甲酸+ 0.028％NH 3

致谢

这项工作是从资金支持基金会倒拉RECHERCHE MEDICALE （DEI20151234424）和法新社国立倒拉RECHERCHE（ANR-19-CE44-0019）到NV代谢组波尔多设施被授予MetaboHUB-ANR-11支持INBS -0010。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的经济利益。

参考

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