材料和试剂

材质小号
移液器吸头
玻璃-底部ED菜（如马蒂克，目录号：P35G-1.5-20-C; IBIDIμ-盘35毫米，高玻璃底，目录号：81158; Sarstedt的lumox盘35，目录号：94.6077.331; Nunc公司玻璃底盘，目录号：150680）
1.5 -毫升管
50 - ml 锥形离心管

试剂
HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2）
Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）-高葡萄糖（Sigma - Aldrich，目录号：D5796）
胎儿b羊小号erum，FBS（南美洲）（Biowest ，目录号：S1810）
青霉素/链霉素100 × （BioConcept-Amimed ，目录号：4 -01F00-H ）
胰蛋白酶- EDTA小号olution 10 × （西格玛- Aldrich公司，目录号：T4174-100ML）
OptiMEM -I（Gibco，目录号：51985026）
FuGENE HD（Promega，目录号：E2311）
HEPES（PanReac AppliChem，目录号：A1069）
氯化钙2· 2H 2 O（默克，目录号：1.02382.0500）
KCl （默克，目录号：1.04936.1000）
MgCl 2 · 6H 2 O（Fluka ，目录号：63064）
NaCl（PanReac AppliChem，目录号：A2942）
DTT（PanReac AppliChem，目录号：A1101）
H 2 O 2溶液（Sigma-Aldrich，目录号：95321）
pCMV / myc /ER/GFP HyPerER （Enyedi等人，2010 年）（来自匈牙利布达佩斯 Semmelweis 大学Miklos Geiszt博士的善意礼物）
兴奋剂和抑制剂（实验依赖型），例如，毒胡萝卜素（密理博，目录号：586005）
HEPES 成像缓冲液（1 L）（见配方）

设备

移液器
凯西Ç ELL计数器（全生命科学）或血球
热块50 -毫升锥形管中
倒置显微镜；我们使用奥林巴斯 Fluoview3000 激光扫描显微镜
60 ×物镜 UPLSAPO60XS2 Universal Plan Super Apochromat 硅胶浸没物镜 NA 1.3 (N5203000)
对于激发，我们使用一个（分别稍微低于在420nm和500nm，激发峰）奥林巴斯FVL-LAS405-LX50激光405nm和FVL-LAS488-LS20激光488nm的
注：中号onitoring的数据HyPer探头不需要共焦！带有用于激发和发射的合适滤光片组的荧光显微镜就足够了。
HyPer 的最大激发波长：500 nm
HyPer 的最大发射波长：516 nm
气候控制单元；我们使用适用于 IX83的Olympus CellVivo培养箱系统 (E0439957)
注意：活细胞实验应在最佳环境条件下进行；最低要求是温度控制器，以保持 37°C 的最佳温度；长-术语实验，例如，长超过30分钟，一个额外的CO 2 ，将需要供应。

软件

FV300（奥林巴斯）
Excel（微软）

程序

细胞培养和接种
细胞应在其相应的生长培养基中培养，直到它们达到约 70%的汇合。
洗的细胞用10ml 1 × PBS 。
用 2 ml 预热 (37°C) 1 ×胰蛋白酶 (0.5 g/L) 在室温下分离细胞4 分钟，然后重悬在 8 ml 完全生长培养基中。
使用Casy细胞计数器或血细胞计数器确定悬浮液中的细胞数。
种子30 ，000个细胞在400μl的完全生长介质的中心孔的Matek的玻璃-底部版盘。
细胞密度米AY取决于所使用的细胞类型和转染方法。
将培养皿置于加湿的细胞培养箱（37°C，5% CO 2 ）中并孵育过夜。

转染
用0.5μg混合25微升的Opti-MEM培养基HyPerER p lasmid和1.5微升Fugene转® （根据制造商的方案）HD溶液。
孵育该混合物在室温下15分钟，并逐滴添加至所述细胞。
转染后约 6 小时加入2.6 ml 完全培养基。
孵育细胞在37℃培养24 - 48小时。
注：最佳转染条件下，例如，细胞密度，DNA量，和DNA：Fugene转® HD比，将需要优化是否取决于荷兰国际集团上所选择的细胞系。

成像
成像在Olympus进行Fluoview共3000激光扫描显微镜一个温度-和CO 2 -控制单元。样品依次使用 405 nm 和 488 nm 激光s激发。发射被记录在窗口从500至600nm 。
注：牛逼这里只有两个激发波长一个发射窗口！
取出来的细胞培养皿用吸管培养箱和移除培养基。
用 1 ml 预热的 HEPES 成像缓冲液小心地将盘子洗两次冰。
加入1 ml HEPES成像缓冲器，并放置在显微镜载物台上的菜。
搜索包含几个健康的视野-寻找细胞足够的YFP荧光信号。
优化光电倍增管的电压，以获得良好的图像质量（信号-到-噪声）为两个通道。
每 20 秒测量一次细胞中HyPerER的基线氧化状态至少 5 分钟，然后小心地加入刺激性物质，如毒胡萝卜素（终浓度 1 µM），在 1 ml HEPES 成像缓冲液中以双倍工作浓度用移液管并记录直到信号稳定（或根据刺激方案）。确保完成20以内的加法-的两个图像采集之间的时间窗口。采集速度和总成像时间应进行优化，以实现适当的时间分辨率，但也避免光漂白。
通过添加单剂量的饱和 H 2 O 2 （100 µM 最终浓度在 1 ml HEPES 成像缓冲液中）作为阳性对照，用移液器小心地应用，结束每次测量。图 1 显示了 HeLa 细胞中的一个示例。

数据分析

使用FV3000 软件进行分析：
定义了你的样品中感兴趣区域（ROI），并选择合适的区域来放置背景的投资回报率。
测量这些 ROI 内的原始发射强度。
将软件中的原始强度值导出为 .csv文件。
打开该.csv文件小号在Microsoft Excel中。你将获得两个发射强度值，在516处确定的，为电子ACH为每个ROI，一个用于在488nm处激发和一个用于在405nm激发测量时间点。执行以下计算：
减去ROI在405获得的背景的强度值-从在405nm处测得的靶ROI nm激发。
减去ROI在488获得的背景的强度值-从在488nm处测得的靶ROI nm激发。

使用以下公式计算荧光比（例如参见图 1）：

图 1. ER 氧化还原变化的实时监测。使用Fugene ® HD用HyPerER传感器转染HeLa 细胞。在48小时后-转染，用于成像，制备细胞。随时间监测荧光比率变化。A. 每条轨迹对应一个单元格记录的数据。细胞用 1 µM毒胡萝卜素(TG) 处理，通过促进还原型谷胱甘肽的流入来减少ER 环境（Lizak等人，2020 年），然后应用 100 µM H 2 O 2 ，这导致重新氧化。B. 405 - nm 或 488 - nm 通道中的示例荧光图片和相应的比例图像。比例尺 = 10 µm。所述伪彩图像表示的比率R ，获得通过将在488nm测得的值- nm激发和516 -后通过在405测得的值减去背景nm发射- nm激发和516 -发射波长。甲d arker颜色表示一个更低的比率，并因此较少ħ 2 ö 2 ; 一个较浅的颜色表示较高的比率和因此多个H 2 ö 2 。

食谱

HEPES 成像缓冲液 (1 L)
的1M HEPES溶液（无菌- FILT ER ED ）20毫升; 终浓度 20 mM
的1M的KCl溶液（无菌- FILT ë红色）5毫升; 终浓度 5 mM
的1M的CaCl 2溶液（无菌- FILT ë红色）1.8毫升; 终浓度 1.8 mM
的1M的MgCl 2溶液（无菌- FILT ER ED ）1毫升; 终浓度 1 mM
的1M NaCl溶液（无菌- FILT ER ED ）130毫升; 终浓度 130 mM
用 ddH 2 O填充至 1 L并将 pH 值调节至 7.4

致谢

该协议改编自Lizak等人。（2020 年）。非常感谢瑞士国家科学基金会 (SNSF, 31003A-179400) 和巴塞尔大学的资助。

利益争夺

作者声明个是研究在没有可能被视为潜在的利益冲突的任何商业或财务关系进行的。

参考

Appenzeller-Herzog, C. (2011)。内质网中基于谷胱甘肽和非谷胱甘肽的氧化剂控制。J Cell Sci 124（第 6 篇）：847-855。
Belousov, VV, Fradkov, AF, Lukyanov, KA, Staroverov, DB, Shakhbazov, KS, Terskikh, AV 和 Lukyanov, S. (2006)。细胞内过氧化氢的基因编码荧光指示剂。Nat 方法3(4)：281-286。
Bock, KW 和 Kohle, C. (2009)。内质网膜中寡聚 UDP-葡萄糖醛酸转移酶的拓扑方面：进展和开放性问题。生化药理学77(9)：1458-1465。
Chen, X. 和 Cubillos-Ruiz, JR (2021)。肿瘤及其微环境中的内质网应激信号。Nat Rev Cancer 21（2）：71-88。
Enyedi ，B.，Varnai ，P。和Geiszt ，M。（2010）。内质网的氧化还原状态受 Ero1L-α 和腔内钙的控制。抗氧化氧化还原信号13(6)：721-729。
Erdbrugger , P. 和 Frohlich, F. (2020)。超长链脂肪酸在酵母生理学和人类疾病中的作用。生物化学402(1)：25-38。
Lizak, B., Birk, J., Zana, M., Kosztyi, G., Kratschmar, DV, Odermatt, A., Zimmermann, R., Geiszt, M., Appenzeller-Herzog, C. 和 Banhegyi, G. (2020)。Ca 2+动员依赖的内质网腔减少是由于胞质谷胱甘肽的流入。BMC 生物学18（1）：19。
Malinouski , M., Zhou, Y., Belousov , VV, Hatfield, DL 和Gladyshev , VN (2011)。过氧化氢探针针对不同的细胞隔室。PLoS一6(1)：e14564。
Mehmeti, I.、Lortz, S. 和 Lenzen, S. (2012)。H 2 O 2敏感的HyPer 蛋白靶向内质网，作为氧化硫醇-二硫化物环境的镜子。免费拉迪奇生物学医学53（7）：1451-1458。
Morishita , Y. 和Arvan , P. (2020)。由分泌途径中蛋白质折叠缺陷引起的内分泌失调动物模型的教训。分子细胞内分泌499：110613。
Pak, VV, Ezerina , D., Lyublinskaya , OG, Pedre , B., Tyurin-Kuzmin , PA, Mishina , NM, Thauvin , M., Young, D., Wahni , K., Martinez Gache , SA, Demidovich , AD, Ermakova , YG, Maslova , YD, Shokhina , AG , Eroglu , E., Bilan , DS, Bogeski , I., Michel, T., Vriz , S., Messens , J. 和Belousov , VV (2020)。过氧化氢的超灵敏基因编码指示器可识别氧化剂在细胞迁移和线粒体功能中的作用。细胞代谢31（3）：642-653 e646。