材料和试剂

Safe-升玉珠吨ubes，1.5毫升（的Eppendorf，目录号：0030120086）
玻璃-底菜ES （赛默飞世科学，目录号：150680）
玻璃微纤维过滤器（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1820047）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
硫酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：746452）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903）
尼日利亚菌素钠盐（Tocris Bioscience，目录号：4312）
磷酸氢二钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8282）
磷酸二氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
琼脂糖低胶凝温度（Sigma-Aldrich，目录号：A9045）
萌发培养基（小号EE配方1）
储备溶液（š EE配方2 ）
磷酸钠缓冲液（小号EE配方3 ）
校准溶液（š EE配方4 ）

设备

热板
pH计
涡流
细针尖镊子（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1820047）
台式微量离心机（Eppendorf，型号：5415D）
DeltaVision成像系统（Applied Precision - GE，型号：Elite）
注意：包括一个我nverted显微镜（Olympus，型号：IX71），InsightSSI荧光照明器，前照SCMOS相机（2560×2160，像素尺寸6.45 微米），和6 3 × 1.2 NA水浸物镜（奥林巴斯，型号：U -计划S-Apo）。
滤光片组，激发 390/18 nm (DAPI) 和 475/28 nm (FITC)；发射，435/48 nm (DAPI) 和 523/36 nm (FITC)
精密电动 X、Y 载物台

软件

ImageJ（多个 Kymograph 插件），斐济（https://imagej.net/Fiji/Downloads）
统计编程语言 R（R 核心团队，2020 –此处使用 4.0.4 版），推荐使用RStudio（RStudio 团队，2020 –此处使用 1.4.1103 版）以及我们定制的分析脚本 CHUKNORRIS（Damineli等人，2017 年）
可选使用作为补充材料提供的自定义 R 脚本“ CalibrateFromKymographs.R ”

程序

花粉收集和样品制备
从原液中制备新鲜的液体发芽培养基，并将pH 值调整为 7.5（配方 1）。
注意：将花粉发芽培养基的库存溶液储存在-20 °C，并在实验当天准备新鲜的发芽培养基。
生长拟南芥转基因植物，在LAT52 启动子(pLat52:pHluorin)下表达比率pHluorin （Hoffmann等人，2020 年），在 22 ° 的短日光周期条件（12 小时光照/12 小时黑暗周期）下的生长室中C 具有 70% 的湿度和~100 μmol m -2 s -s的光强度，以提高花粉完整性和密度。
注：生长在短日照条件，光照增加拟南芥植物小号花粉质量和完整性，导致高发芽率（> 90％）。在这些条件下，健康的植物大约需要 60 天才能开始开花。然而，也可以使用在其他光周期条件下生长的花。
收集开花的花使用薄镊子后立即小号和转移到1.5 - ml管（每管不超过100鲜花-使用每10月20日至25日的花-毫米皿）。
注意小号：
i )开始从第 10个长角果中收集鲜花。初生长角果花粉密度降低，发芽率降低；
ii)优先在光照周期的 3-5 小时采花。一个是压脚提升，鲜花开始关闭和花粉活力降低;
iii)密度对于拟南芥花粉的萌发非常重要。据建议的是每10月20日至25日的花-毫米培养皿中收集。这里用来标准化花粉密度的参数是花的数量；然而，花粉密度可能因生长室条件而异。的相关性，花粉粒应覆盖玻璃-底皿中，避免了任一稀疏或拥挤的情况。
添加 1 ml 发芽液体培养基。
高速涡旋 (~2,500 rpm) 30-40 秒。
以 1 , 600 × g离心3 分钟。
删除了鲜花和上清液。
轻轻重悬花粉沉淀 100 μ l液体发芽培养基。
注意：对于花粉沉淀再悬浮，切断所述第一几200的毫米- μ升尖端扩大孔径和避免花粉粒损坏。
将 0.01% 低熔点琼脂糖在安全锁管 (1.5 - ml)中的 1 ml 萌发培养基中融化30 秒，在微波炉中。
冷静下来琼脂糖足以用裸手接触的管小号，而不允许它jellify。
添加100 μ升琼脂糖溶液到花粉沉淀物，并轻轻混匀。
添加50 μ升溶液（在溶液+胶凝萌发培养基花粉粒）到各玻璃底培养皿（体积足以制备4个的实验品）。
放置玻璃底培养皿ö Ñ的热板上在50℃下1分钟。
注意：花粉粒对高温很敏感，长时间加热会杀死它们。保持菜肴的热量下不长于2分钟，刚好足够的时间，以允许花粉粒至下沉到玻璃底部，以促进成像下倒置显微镜。
取出菜肴和允许琼脂糖溶液到jellify。
注意：萌发培养基的凝胶化含有花粉粒允许š花粉管生长，同时使变化š在顶部液体溶液。此步骤是校准程序的基础。
添加100 μ升的胶凝琼脂糖垫的顶部液体萌发培养基含有花粉粒。
在 22°C 下孵育培养皿，最好在黑暗中孵育。
2-3 小时后，可以检测长度≥ 200 μ m 的花粉管。
注意：孵育2 -3小时后，实验菜肴应保存在冰盘中，以减缓从图像采集开始到程序结束的花粉管伸长；Ó therwise，管将连续细长的，并且后一几小时，花粉管长度将是不同的从第在在过程开始时取得的。

步骤1 - 17如图 1 所示。

图 1. 样品制备程序。序列的示意图用于菜制备和步骤的素-pHlurin在校准过程拟南芥花粉管。圆形图表示10 -玻璃毫米直径以及-底部培养皿。

校准程序和图像采集
制备10mM磷酸钠缓冲液中的单-和二元形式的摩尔比适合在以下pH值小号：5.8，6.2，6.6，7.0，7.4，7.8，以及8.0; 用140毫氯化钾和30μM的尼日利亚菌素（校准溶液-配方小号3，图4和表1）。
注：尼日利亚菌素，钾离子载体破坏š的膜电位和细胞内ħ +和K +浓度小号，被用来促进pH值在胞质溶胶之间和在外部溶液平衡。
用移液管从培养皿中取出萌发液体培养基，保留含有生长花粉管的琼脂糖垫。
加入100 μ升的给定的pH校正液。
等待 5 分钟稳定。
对于在给定 pH 值下采样的每个生长花粉管，每 4 秒获取两个通道（DAPI 和 FITC）的延时图像，持续 2 分钟（配方 5）。
注意小号：
我）应用相同的采集协议和显微镜参数到两个实验和校准样品。
ii) Deltavision系统用于开发此协议；然而，执行该协议的最低成像设置要求是任何能够以适当的时空分辨率和时间尺度进行活细胞成像的系统。这样一个系统应包括与流感倒置显微镜orescence源，一个照相机，和相应的发射/激发滤波器集合。
重复步骤2-6，˚F或全部给出的pH小号和重复。
注意：多个管的获取图像（10-20次重复在单独的管）在所有pH值小号从至少两个不同的菜肴，但理想3或更多以避免潜在的块效应。

表 1. pH 5.8 至 8.0 的磷酸钠缓冲液制备
酸碱度
1 M Na 2 HPO 4 的体积 ( ml )
1 M NaH 2 PO 4 的体积 ( ml )
5.8
0.79
9.21
6.2
1.78
8.22
6.6
3.52
6.48
7.0
5.77
4.23
7.4
7.74
2.26
7.8
8.96
1.04
8.0
9.32
0.68

Kymograph 提取
从延时生成 kymographs。
观看视频 1 中的教程。

视频 1. 在 ImageJ 中执行的 kymograph 提取程序的屏幕截图

在 ImageJ（推荐斐济）中打开每个文件，拆分 DAPI 和 FITC 通道。
使用“分段线”工具沿着最强通道上的花粉管中线追踪一条线，从柄开始到尖端。确保将迹线延伸到花粉管尖端之外，以便对足够的背景进行采样。这可能是有用的启动跟踪在最后一帧，以供参考，并调整跟踪，以确保这大致是在中线的每一帧。此外，避免与所述柄部的边界观察窗（图URE 2）。
图 2. kymograph 生成的跟踪。使用多 kymograph 插件 (ImageJ) 通过绘制花粉管中线生成 kymograph 的手动轨迹的说明性表示，沿两个pHluorin通道的轨迹对 7 像素邻域进行平均。延伸的迹线出来的荧光图像的是estimat基本荷兰国际集团为背景的像素强度减法。

沿中线提取 kymograph ，使用斐济“分析”菜单下的“多个 Kymograph”插件选择一个 7 像素的邻域。
行从一个信道复制到其他使用Command + Shift键+ E（上一个Mac上，代替“与Windows“控制”命令”）和提取kymograp为h描述在前面的步骤。
保存每个kymograph如本文“文件的文本，”'另存为，“文本图像。“牛逼Ø便于分析，最好是采用文件-命名系统; 在这里，我们建议从通道名称开始并指定外部 pH 值和重复次数。因此，取得的各文件与显微镜将产生两个kymographs名d “FITC_5.8_1.txt”和“DAPI_ 5.8_1.txt ，”在第一复制的情况下，在pH值5.8。该文件必须有时间为行和空间列，从左边的花粉管的信号-手侧和右侧的背景-右手边。

数据分析
执行作为外部pH值函数的比率值的线性回归。
选项 1：此处提供的 R 脚本基本上不需要编程经验。
注意：我们使用Hoffmann 等人的数据举例说明了数据分析工作流程。（2020）和替代数据与脚本“而生成GenerateSurrogateData.R作为提供”小号upplementary中号aterial。替代数据瓦特ERE产生在pH校正使用模拟kymographs，采用渐近曲线来表示具有噪声添加和实际的pH值的前端信号。

观看视频 2 中的教程。

视频 2. 在 RStudio 中执行的校准脚本的屏幕截图

该补充ř脚本“ CalibrateFromKymographs.R ”工具所需的所有步骤，以生成从所获得的kymographs校准曲线在不同的外部pH值，所提供的文件-部分C指定的命名系统6 。被严格遵守。任何命名差异都会产生错误。
打开 RStudio 并通过菜单“文件”和“打开文件...”打开文件 ' CalibrateFromKymographs.R ' 所需的参数将在脚本的“用户定义部分”中指定。
指定您的文件位于（“ fl.dir ‘）以及要输出被保存（’ out.dir ”）。确保目录斜杠的方向适合您的操作系统：“/”适用于MacO ，“\”适用于 Windows。
指定作为计算比率的分母的通道名称 ('top.ch') ; 在这里，它是“DAPI”，因为我们的目标是计算e DAPI/FITC。该名称必须是完全按照使用前缀来南é的kymograph文件，如第C.解释6 。任何不一致都会导致错误。
选择要使用的像素的数量作为一个余量，以计算每个信道的背景（“擦伤”），从朝向所述矩阵的右侧的端部位置的计数（参见图URE 3A作为一个参考）。这个数字不能大于从最远尖端位置到矩阵末端的距离；否则，会导致错误。
选择要使用的像素的数量作为一个余量来定义的前端位置后面关心区域，并计算比率信号（“ roi.mar ”）朝向矩阵的左侧的端部位置的计数（参见图URE 3A作为一个参考）。此数字不能大于最短尖端位置加上下一步中定义的宽度。
定义感兴趣的（“区域的宽度roi.wdth以像素为单位的数”），其将被放置后面的尖端位置估计朝向矩阵的左侧（参照图URE 3A作为一个参考）。此数字不能大于最短尖端位置加上上一步中定义的边距。
观看“ KymoTimePoint ”图（图URE在输出文件夹3A），以查看是否尖端位置估计似乎足够，即，大约从定位信号与背景的过渡。如果不是这样，一个选项是设定用来自动检测尖端（“压裂”）的信号范围的分数在一个较小的值，如果该位置估计太远的背景区域，或在一个较大的值，如果发现位置离信号区域太远。
确保有中位数比信号中没有显著趋势随着时间的推移（图3B），这可能表明，在细胞内外的浓度没有达到平衡。查看输出文件夹中的“ RatioInROI ”图。如果随着时间的推移有一致的变化，要么放弃原始文件中的时间点，要么放弃复制。
点击“源”的脚本顶部的图标，并注意错误，警告，并在“R控制台消息。'
获得在输出目录的校准曲线，它包含所估计的参数，P -值，和R 2在图例中（图3C）。
图3.替代数据模拟的校准素-pHlurin在拟南芥花粉管。A.单一时间点，其中的尖端位置估计。B.中号随时间和总体分布edian比率信号，以验证是否有一种趋势，用于绘制在输出每个文件。C. 使用线性模型的系数和显着性进行最终校准。

线性回归选项 2：需要编程经验的自定义 R 脚本。这些是步骤小号实现我N选项1使用提供的脚本“ CalibrateFromK ymographs.R ，”但单独说明，允许在使用更大的灵活性。
使用函数“ read.table ”在 R（或Rstudio ）中打开 kymograph 文件。' 此过程将针对单个文件进行描述，但可以轻松实现自动化。
或者通过使用CHUKNORRIS估计花粉管尖端和上最强信道的背景之间的边界（Damineli等人，2017），所述网络应用程序（https://feijolab.shinyapps.io/CHUK/），简单地用一个或临界点。可以通过观察哪个荧光值清楚地将信号与噪声分开来直观地估计阈值。或者，可以尝试自动估计阈值，例如，作为中值信号范围的一部分。要在花粉管结束的每个时间（行）获取矩阵 'm' 中的位置（列） - 对于任意荧光阈值 ' thrsh ' -使用 'apply(m, 1, function(v) max(which(which( v > thrsh ))) 。'
通过在每行花粉管结束的位置之后对矩阵“m”进行子集化来估计中值背景值。这可以进行在一个命令，例如，'（中位数与不公开（lapply （POS ，函数（P）M [，（P +擦伤）：昏暗（M）[2]]））），'其中' POS'是在先前步骤中获得的花粉管尖端的位置的矢量，和‘擦伤’是整数，指定像素使用的数量为一个余量（例如，5-25，取决于剩余向右的像素数每个位置）。
通过平均花粉管尖端后面几个像素的区域并减去背景来估计该通道的信号值。
打开用于其他信道的文件，并使用花粉管尖端位置来估计背景（如在第D.2.iii ）和荧光信号（第d 。2 .IV）。
最后，计算每个通道的背景-减去信号之间的比率：pHluorin比率 = [（DAPI-DAPI背景）/（FITC- FITC背景）]。
重复d 。2次。我。- d 。2个.vi的。对于所有其他重复并使用“lm ”执行线性模型，其中“y”是比率值，“x”是细胞外 pH（图3C ）。提取的系数的斜率和截距，并转换在所有比率数据到pH值，提供的是一个令人满意的[R 2和p值被达到。一般地，一个期望的p值远低于10 -2和一个- [R 2在0.5以上; 虽然，必须检查是否线性拟合看起来像一个适当的描述O ˚F的数据。或者，sigmoidal 拟合可能更合适，但这超出了本协议的范围。
使用线性模型来估计的实际pH值或浓度值。
现在，一个线性模型已被装配到校准数据，可以估算实数值为所述使用胞质浓度的适于方程为线以获得pH：

用上面的等式替换从所需的实验结果中获得的比率值。如果您像第 C 节那样提取了 kymographs。1 。或如Damineli等人所定义。(2017)对于您感兴趣的测量，此过程允许对 pH 值（图4）或其他细胞溶质浓度s进行定量时空估计。
可以按照Damineli等人的定义分别估计细胞内梯度。(2020)。
图 4. 细胞质pH 值的时空量化。A. 由比率pHluorin校准生成的 Kymograph 。B. Ť IME系列d从ATA的aha6 aha8突变拟南芥在霍夫曼呈现花粉管等。(2020)。

食谱

发芽培养基
500 μM p otassium Ç hloride（氯化钾）
500 μM Ç alcium酰氯（氯化钙2 ）
125 μM米agnesium硫酸（硫酸镁4 ）
0.005% (w/v) b硼酸 (H 3 BO 3 )
125 μM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 ( HEPES)
16％（W / V）小号ucrose
甲djust pH至7.5与小号裂果ħ ydroxide（氢氧化钠）
库存解决方案
钾Ç hloride（氯化钾）100毫
氯化钙 (CaCl 2 ) 100 mM
硫酸镁 (MgSO 4 ) 100 mM
硼酸 (H 3 BO 3 ) 1%
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES) 100 mM
磷酸钠缓冲液
制备1M的小号裂果磷酸氢二（娜2 HPO 4 ）
制备1M的小号裂果磷酸二氢（的NaH 2 PO 4 ）
校准溶液
10mM磷酸钠在以下pH值小号：5.8，6.2，6.6，7.0，7.4，7.8，8.0
140毫米氯化钾
30 µM 尼日利亚菌素
Deltavision系统中使用的图像采集协议
强度：10%
曝光时间：250 ms （两个通道）
渠道一：DAPI、FITC
通道 2：FITC、FITC
间隔：4秒
时间-推移：16点（64个S）

致谢

该JF实验室是由美国国家科学基金会资助（MCB2016分之1616437和二千零十九分之一百九十三万零一百六十五）和马里兰大学的支持。MTP是由基金资助小号2019 / 26129-6和2021 / 05363-0从圣保罗研究基金会（FAPESP）。DSCD由津贴资助小号19 / 23343-7，然后从圣保罗研究基金会15 / 22308-2（FAPESP）。我们也承认Majon等人。（2011）从那里改编了协议。

利益争夺

有没有利益或竞争利益冲突小号。

参考

Certal , AC, Almeida , RB, Carvalho , LM, Wong , E. , Moreno , N., Michard , E., Carneiro , J., Rodriguéz- Léon , J., Wu , HM., Cheung , AY and Feijó , JA (2008)。从顶端膜中排除质子 ATP 酶与烟草花粉管中的细胞极性和尖端生长有关。植物细胞20：614- 6 34。
Choi, WG.、Toyota, M.、Kim, SH.、Hilleary, R. 和 Gilroy, S.（2014 年）。盐胁迫诱导的 Ca 2+波。Proc Natl Acad Sci U S A 111(17):6497-6502。
Damineli , DSC, Portes , MT 和Feijó , JA (2017)。振荡特征是拟南芥花粉管生长机制的基础：估计生长细胞中尖端位置、周期性和同步性的计算方法。J Exp Bot 68：3267 - 3281。
Damineli , D. S. C., Portes , M. T. 和Feijó , J. A. (2020) 。分析花粉管中的细胞内梯度。方法 Mol Biol 2160：201-210。
Evans, M. J., Choi, WG., Gilroy, S., Morris, R. J. ( 2016)。依赖于 AtRBOHD NADPH 氧化酶和 TPC1 阳离子通道的 ROS 辅助钙波传播对盐胁迫的全身反应。植物生理学171(3): 1771-1784。
Feijó , J. A. 和Wudick , M. M. (2018)。钙是生命。J Exp Bot 69(17)：4147-4150。
Hilleary, R.、Choi, WG.、Kim, SH.、Lim, SD 和 Gilroy, S.（2018 年）。理智和情感：在植物中使用基于荧光蛋白的基因编码生物传感器。Curr Opin Plant Biol 46：32-38。
Hoffmann, R. D., Portes , M. T., Olsen, L. I., Damineli , D. S. C., Jesper, M. H., Pedersen, T., Lima, P. T. Campos, C., Feijó , J. A., Palmgren . M. (2020)。质膜 H + -ATPases 维持花粉管生长和受精。国家通讯社11：2395。
Mahon, M. J. (2011) 。pHluorin2：一种增强的、比例的、pH 敏感的绿色荧光蛋白。进阶BIOSCI生物技术2（3）：132-137。
Michard , E.、Dias, P. 和Feijó , J. A. (2008)。烟草花粉管作为离子动力学的细胞模型：使用 pHluorin 和 YC3.1 CaMeleon 提高细胞外通量的空间和时间分辨率以及钙和质子的游离细胞质浓度。性植物繁殖21：169 - 181。
Miesenböck , G.、De Angelis, D. A. 和 Rothman, J. E. (1998)。用 pH 敏感的绿色荧光蛋白可视化分泌和突触传递。自然394：192-195。
Miyawaki, A., Llopis , J., Heim, R., McCaffery, JM 和 Adams, J. A., Ikura , M. 和Tsien , R. Y. (1997)。基于绿色荧光蛋白和钙调蛋白的Ca 2+荧光指示剂。自然388：882 - 887。
Monshausen , G. B.、Messerli, M. A. 和 Gilroy, S. (2008)。Yellow Cameleon 3.6 指标的成像显示细胞质 Ca 2+ 的升高跟随拟南芥根毛生长的振荡增加。植物生理学147：1690 - 1698。
Nagai, T.、Yamada, S.、Tominaga, T.、Ichikawa, M. 和 Miyawaki, A. (2004)。通过循环排列的黄色荧光蛋白扩大了 Ca 2+荧光指示剂的动态范围。Proc Natl Acad Sci U S A 101：10554 - 10559。
非政府组织，QA，沃格勒，H.，Lituiev ，DS，Nestorova ，A。和Grossniklaus ，U。（2014）。由 FERONIA 信号转导途径介导的钙对话控制植物精子的输送。开发单元29：491 - 500。
Nguyen, CT, Kurenda , A., Stolz, S., Chételat , A. 和 Farmer, EE ( 2018)。鉴定受伤植物中叶间电信号传递所需的细胞群。Proc Natl Acad Sci U S A 115(40): 10178-10183。
R 核心团队。(2020)。R：一种用于统计计算的语言和环境。R 统计计算基金会，奥地利维也纳。
RStudio 团队。(2020)。RStudio：R 的集成开发。RStudio，PBC，波士顿，马萨诸塞州。
Toyota, M., Spencer, D., Sawai-Toyota, S., Jiaqi, W., Zhang, T., Koo, A. J., Howe, G. A. 和 Gilroy, S. ( 2018)。谷氨酸盐触发长距离的、基于钙的植物防御信号。科学14：1112-1115。
Walia, A.、Waadt , R. 和Jones, AM（2018 年）。植物中的基因编码生物传感器：发现途径。Annu Rev Plant Biol 69(1): 497-524。