材料和试剂

1.5 - ml 微量离心管（DNase，无RNase低粘附微量离心管）（USA Scientific，目录号：1415-2600）
受精鸡蛋：来自查尔斯河实验室（美国马萨诸塞州威尔明顿）的无特定病原体鸡 (SPF) 鸡蛋
收到后，鸡蛋应储存在 16°C 下，并在 1 周内使用。将卵放入 38 ℃的加湿孵化器中时，胚胎发育恢复° Ç 。胚胎可以根据汉堡和汉密尔顿 (1951) 的系统进行分期。注：温度的鸡蛋，有时不好运输，从而降低自己的生存能力，以及夏季和冬季期间这样做差异时控制。
ALT-R ® CRISPR-Cas9 crRNA，2纳摩尔，设计为以下详述的（集成DNA技术（IDT））
ALT-R ® CRISPR-Cas9 tracrRNA，20纳摩尔（IDT，目录号：1072533）
ALT-R ® SP Cas9核酸V3，100微克（IDT，目录号：1081058）
ALT-R ® Cas9电穿孔增强器，2纳摩尔（IDT，目录号：1075915）
Alt-R ® HDR 增强剂，100 µl（IDT，目录号：1081072）
10×反应缓冲液（具有Cas9从金斯瑞核酸酶，Ç atalog号：Z03386）（200mM的HEPES，1M NaCl的，50毫摩尔MgCl 2 ，1mM的EDTA，pH为6.5，在25℃）
不含核酸酶的水（使用Alt-R管® CRISPR-Cas9自RNA的IDT）
Hanks平衡盐溶液（HBSS，不含钙、镁或酚红，Thermo-Fisher Scientific，目录号：14175095）
DNA oligo 100 n mol规模，按照协议(IDT) 中的讨论进行设计
Q5 DNA聚合酶（NEB，目录号：M0491）
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物（NEB，目录号：N0447S）
核酸外切酶 I（大肠杆菌）（NEB，目录号：M0293S）
EconoTaq PLUS GREEN 2 × Master Mix（Lucigen ，目录号：30033-1）
QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen，目录号：28704）
2-丙醇生物试剂，用于分子生物学，≥99.5%（Sigma-Aldrich，目录号：19516）
异戊醇，≥98%，FG（Sigma-Aldrich，目录号：W205702）
无水乙醇 200 Proof（Koptec，目录号：V1016）
pXL-BacII-CAG-Venus（包含位于 CAG 和Venus两侧的 piggyBac 反向末端重复序列 (ITR) 序列的质粒）（Yamagata 和 Sanes，2012）
pXL-BacII-CAG-mCherry（包含位于 CAG 和 mCherry 两侧的 piggyBac ITR 的质粒）
pXL-BacII-CAG-loxP-STOP-loxP-Venus（包含位于 CAG 侧翼的 piggyBac ITR 的质粒、loxP-STOP-loxP 盒和Venus）
pCAG-mPBorf（含有 piggyBac 转座酶的质粒，密码子优化）
tPT2A-Venus-pCR21 （含有 tPT2A-Venus序列的质粒）（该质粒可从 Addgene 获得，质粒 170521 ）
pCAG-Cre:GFP (Addgene, 13776)
兔抗 GFP（Millipore，目录号：AB3080P）
P-RAN-GFP1 上清液（Yamagata 和 Sanes，2018 a ；Addgene 质粒，106408）
TSA Plus 荧光素评估试剂盒（PerkinElmer，NEL741E001KIT）用于分子生物学的标准实验室试剂（例如，70% 乙醇、用于凝胶电泳的琼脂糖）
琼脂糖（Agarose RA（Amresco）；VWR Life Science，目录号：97064-258）
缓冲液的琼脂糖电泳：10 ×的Tris -乙酸盐- EDTA （TAE）（Mediatech公司，目录号：SC45001 - 074）
硫酸卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K1377）（HBSS-卡那霉素参见下面的配方1 ）
Fast Green FCF，染料含量≥85%（Sigma-Aldrich，目录号：F7252）（储备溶液见下面的配方2 ）
氯仿，含有 100-200 ppm 戊烯作为稳定剂，≥99.5%（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）（有关氯仿-异戊醇（25:1），请参见下面的配方 3）
苯酚，BioUltra，用于分子生物学，≥99.5%（GC）（Sigma-Aldrich，目录号：77608）（苯酚-氯仿（1:1）见下文配方 4）
质粒（#20、#21、#22）可从 Addgene 获得（Addgene 质粒s 170518、170519、170520），但目前的限制阻止 Addgene 分发编码 piggyBac转座酶的质粒( https://www.addgene.org/terms/ 1118/ )。所有注射用质粒都需要苯酚 - 氯仿处理（参见下面的配方 5）。

设备

1.鸡蛋孵化器
许多孵化器可在市场上买到；我们使用 1550 HATCHER（GQF MFG，萨凡纳，GA）。培养箱应保持湿润并设置为 38°C。用于运送鸡蛋的纸箱可用作孵化和电穿孔的支架。
2. ECM 830 方波电穿孔系统 (BTX; Holliston, MA)
3.钨丝（0.1 -毫米直径）
4.玻璃毛细管，3 -英寸长，1 -毫米直径（世界精密仪器，1B100F-3）
5. Gentrodes，3 -毫米 L 形（金尖）45-0116
用于将电极固定和连接到电穿孔器的附件可从多家供应商处获得，包括 BTX 和NEPAGENE 。
6.透明胶带2592（25.4 - mm宽）
警告：ç从其他供应商的一些录音带hemical粘合剂是有毒的胚胎。可疑磁带，如果该成活率是很低。
7. 18 ½ G针
8. 10 -毫升注射器
9.夏普-边缘d弯曲手术剪（约4英寸）
10. #5 镊子
11.的Mastercycler P ro的Ť有源冰箱Ç ycler仪（Eppendorf，950040015）
12.条8管，0.2 -毫升（Corining PCR - 0208 -甲和PCR - 02CP - A）
13.解剖立体镜（用于电穿孔）
卡尔蔡司 Stemi 2000 (444036-9000) 配备10 × /23目镜（放大范围：6.5-50 × ）。应根据需要调整观察倍率
14.荧光立体显微镜（Olympus，SZX12，配备观察GFP/荧光素和mCherry/罗丹明荧光的立方体
15.小号pectrophotometer（赛默飞，型号：纳米滴2000）测量OD 260

程序

A.关键试剂的制备
1. CRISPR-RNA (crRNA) (IDT)
设计crRNA指南中的说明中注释1 。
2. ssDNA 供体
设计准则的单链DNA的供体是描述了ð在注2 。
a. 产生双-链DNA模板轴承的同源性武器。
创建一个双-链DNA模板（对于一个实施例，请参阅图小号2A和2乙），使用两个90 -碱基的ssDNA的引物（对于一个实施例，参见图2C ）和GFP模板（例如，PXL-BacII-CAG-金星）。我们使用高保真PCR酶（Q5 DNA聚合酶），执行100 -在微升反应一个热循环，琼脂糖凝胶上运行，并纯化适当大小的主要的PCR产物（L EFT臂+ GFP +右臂：〜850bp的;图 2C ) 使用 QIAquick凝胶提取试剂盒。

图2.设计crRNA和所述单链DNA的供体：TFAP2A给出作为一个例子。(A) UCSC Genome Browser 中的TFAP2A基因。（B）的基因组序列TFAP2A中的目标区域和TFAP2A -crRNA如图A. （C）90个核苷酸的引物序列退火的5 “ （ATG）和3 ”端小号GFP的和所述的结构的单-链用于插入到GFP供体DNA的TFAP2A轨迹。（d）的引物和单-用于插入到CRE链供体DNA的TFAP2A轨迹。小号EE表1的序列。

该 PCR 使用标准方法和设备。一个典型的反应是 25 个循环（2分钟，95°C ；25 个循环，94°C，30 秒/60°C，30 秒/72°C，1分钟 + 1 秒，72°C/循环；72 °C，7 分钟；4°C）。如果未获得干净的单一 PCR 条带，请尝试使用针对富含 GC 的模板优化的缓冲液和/或添加 DMSO。

表 1 引物序列（见图 2 和图 8）
TFAP2A-Nter-left arm-GFP-Forward

CGGCTCTGCACAGCTCCGCCGCGCTCCGCAGCACCGCGCCGGGGGGATCGGACCCTCTCCCGCCGACCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG

TFAP2A-Nter-右臂-GFP-反向

GGCCCTGGCGGGCGCTTACCTCGCACTCCTCGTACTTGATGTTATCCGTCAGCTTCCAGAGCATTTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC

TFAP2A-Nter-left arm-CRE-Forward

CGGCTCTGCACAGCTCCGCCGCGCTCCGCAGCACCGCGCCGGGGGGATCGGACCCTCTCCCGCCGACCCATGGCCAATTTACTGACCGT

TFAP2A-Nter-右臂-CRE-Reverse

GGCCCTGGCGGGCGCTTACCTCGCACTCCTCGTACTTGATGTTATCCGTCAGCTTCCAGAGCATTTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC

TFAP2A-Cter-左臂-GFP-前进

AGCAACAACCCCAACAGCCACACAGACAACAGCACCAAAAGCAGCGACAAAGAGGAGAAGCACCGAAAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG

TFAP2A-Cter-右臂-GFP-反向

GGGAGGAGGGAGATGAATGGACTGATGGGCTGCGAGGGGGGGAAGGGAGAGGAGTGGGGGGGAATCCTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC

TFAP2A-Cter-左臂-tPT2A-GFP-F

AGCAACAACCCCAACAGCCACACAGACAACAGCACCAAAAGCAGCGACAAAGAGGAGAAGCACCGAAAGGGCAGCGGCGCCACAAACTTC

TFAP2A-Cter-右臂-GFP-反向

GGGAGGAGGGAGATGAATGGACTGATGGGCTGCGAGGGGGGGAAGGGAGAGGAGTGGGGGGGAATCCTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC

b. 为 ssDNA生成优化 PCR
在通过不对称 PCR 进行大规模 ssDNA 制备之前，有助于小规模优化反应。为此，我们使用稳健且价格低廉的 PCR 酶混合物。首先，使用双-链DNA模板上面制备，我们设置了含有的引物不同的摩尔比两个反应：反应＃1，1正向：100反向; 反应#2，100 正向：1 反向。

反应 #1 和反应 #2 （2 管）
50 µl EconoTaq PLUS GREEN 2 × Master
47 微升 dH 2 O
1微升〜0.01微克/ μ升从模板步骤A2一
1 µl 0.01 mM 引物：（反应 #1）正向或（反应 #2）反向
1 µl 1 mM 引物：（反应 #1）反向或（反应 #2）正向
*请注意，典型的 PCR 使用 0.1 mM 引物储备液。分成两个 PCR 孔（每个孔 50 µl）。
94°C，2 分钟
94°C、30 秒/60°C、30 秒/72°C、1分钟 + 1 秒延伸 72°C/循环 40 个循环
72°C，7 分钟
4°C

运行 1% (w/v) 琼脂糖凝胶（使用溴化乙锭）。注意，单链DNA被有效地少用溴化乙锭染色的比是双-链DNA。

典型的结果示于图3A 。在这种情况下（TFAP2A ），反应＃1，得到一个强谱带（〜850 bp）的和几个弱带，其中包括一个共迁移具有〜500bp的双-链DNA标记物。反应＃2给了两个干净频带：在慢- migrat荷兰国际集团带（星号）对应于两倍-链DNA（〜850bp的），根据其预测的大小。然而，ssDNA 的电泳迁移在常规的非变性电泳缓冲液中通常是异常的，因此很难确定哪个条带对应于 ssDNA 物种。因此，将一部分 PCR 产物 (2 µl) 与E一起孵育很有用。大肠杆菌外切酶 I，专门消化线性 ssDNA。如图3B所示，消化中的一些条带，包括约 500 bp 处的部分扩散条带，对E具有抗性。大肠杆菌核酸外切酶I消化，这表明一些双-链DNA的出席〜500bp的。相比之下，在反应#2 中，相应的条带扩散较少，并被E完全消化。大肠杆菌外切核酸酶 I，表明它仅包含 ssDNA（箭头）。因此，我们使用反应 2 的条件进行大规模制备。

图3 。评估ssDNA的质量。(A)不对称 PCR 产生的产物（引物的摩尔比（正向/反向）：反应 #1 中的 1/100；反应#2 中的100/1 ）。（B）PCR产物用消化大肠杆菌核酸外切酶I（É 。大肠杆菌外切I），其特异性地消化单-链DNA（箭头）。一个额外的带（星号）对应于两倍-链DNA。详情见正文。

c. 大-的规模制备的单链DNA的供体
规模-向上反应b中优化和然后提纯单链DNA供体。

500 µl EconoTaq PLUS GREEN 2 × Master
470 微升 dH 2 O
10微升〜0.01微克/ μ升从模板步骤A2A
10 µl 0.01 mM 反向引物
10 µl 1 mM 正向引物
分成 20 个 PCR 孔（每个孔 50 µl ）
94°C，2分钟
94°C、30 s/60°C、30 s/72°C、1 min +1 s延伸40个循环
72°C，7分钟
4°C

B. 运行大琼脂糖凝胶并使用 QIAquick凝胶提取试剂盒纯化 ssDNA 。
使用细井，所以很重要的是，带被明确分开。通常，我们使用n 11 - cm 宽× 13 - cm 长× ~7 - mm 厚的凝胶。增溶后的在QG溶液（QIA快速琼脂糖凝胶提取试剂盒）中，添加20％体积的2-丙醇，和负载上以4个微型自旋-列。洗脱每个管与100μlEB（QIA快速凝胶提取试剂盒）和50μlEB ，依次。添加1:10体积5M的NaCl，提取两次用苯酚-氯仿，然后两次用氯仿，并通过添加2.5体积-20℃的乙醇最终乙醇沉淀。在-20 °C 下用 70% 乙醇冲洗颗粒3 次。降速，完全除去的残留的乙醇，干燥，并再在无RNA酶的水（总计20μL）暂停。
估计DNA使用常规的或纳米浓度d ROP TM （赛默飞世）分光光度计。需要注意的是OD 260 ssDNA的是低级由于增色（40微克/ ml的OD 260 ，而不是至50μg/ ml的双-链DNA）。将浓度调整至1 µg/ µ l，冷冻，并在 -20°C 下储存直至使用。

B.设备设置
图 4显示了用于注射和电穿孔的立体显微镜设置（图 4A 和 4B ）。

图 4. eCHIKIN 所需的设备和仪器。的A.设置的electroporater，解剖显微镜，和电极保持器。BD。阴极 (+) 和钨阳极 (-)。E. 装有 eCHIKIN 鸡尾酒和 Fast Green 的玻璃毛细管。

1.钨针
切0.1 -毫米的钨丝，以合适的长度（〜2cm）上并锐化尖端。我们以电方式对其进行锐化（Brady，1965 年）（参见图 4C 和 4D ）。
2.注射用玻璃毛细管
制作注射用玻璃毛细管。我们使用从玻璃毛细管（World Precision Instruments，1B100F-3（3 -英寸，1 -毫米）使用拉拔器）精细拉制的自制微量移液器。折断尖端的最后几毫米，以便在保持锋利的同时进行轻松注射（图4E ）。

C.孵化鸡蛋
在注射和电穿孔（见下文）之前的适当时间，将所述蛋的孵化器。鸡蛋需要侧身孵化（水平；图 5A ）。标记每个鸡蛋的顶部，因为胚胎会漂浮在蛋黄上。孵化比您计划注射更多的卵子，因为有些卵子可能不育或胚胎放置不当以进行注射。

图 5. 用于注射和电穿孔的鸡胚的制备。A. 侧身孵化的鸡蛋。是。将塑料胶带贴在鸡蛋的顶部，从鸡蛋的圆形一侧去除蛋清蛋白。女，G.使用手术剪具有弯曲叶片，一个小窗口（〜5 -毫米直径）上的蛋的顶部通过带切割制成，壳一起。

D.注射和卵内电穿孔
1.注射鸡尾酒的制备
在卵内电穿孔当天，准备注射用的鸡尾酒。所有塑料器皿和试剂必须不含 RNase。
a. crRNA:transcrRNA/Cas9 RNP（解决方案“ R ” ）
为了重建引导 RNA 双链体，目标特异性 crRNA (35 - 36 nt) 和 tracrRNA (67 nt) 结合、热变性并通过缓慢冷却至室温退火。在1.5 -毫升管中，以该顺序添加这些试剂：

2.5 微升 dH 2 O
0.5 µl 10 ×反应缓冲液
1 µl crRNA（2 n mol /20 µl d H 2 O ；浓度，100 µM ）
1 µl tracrRNA（2 n mol /20 µl d H 2 O ；浓度，100 µM ）

自旋简要并孵育在95℃下在5分钟内一个加热块。
大号在室温下檐，从而该冷却速度慢，最大化退火。
静置 5 分钟，短暂旋转，并在室温下孵育 30 分钟。

加入 0.8 µl 10 mg/ml Cas9 蛋白（化脓性链球菌Cas9 Nuclease V3），混合，短暂离心，室温孵育 60 分钟。这个解决方案是解决方案“ R” 。”

b. 变性的单链DNA的供体
ssDNA 供体应提前准备好并储存在 -20°C 直至使用。
解冻冷冻的等分试样，在 95°C 下加热 5 分钟，然后在冰上快速冷却。这种变性可以与上一步中描述的 crRNA:tracrRNA/Cas9 RNP 的退火同时进行。然而，与 crRNA:tracrRNA 的缓慢退火相反，该管需要立即放在冰上快速冷却。使用前短暂旋转试管。
c. 带有 HDR 增强剂的稀释缓冲液（溶液“ D ” ）
在一个不含RNA酶的1.5 -毫升管中，加入这些在此顺序的试剂：

21.5 微升 dH 2 O
2.5 µl 10 ×反应缓冲液
1 µl Alt-R ® HDR Enhancer（可作为悬浮在 DMSO 中的溶液提供）。混合均匀并短暂旋转。

d. piggyBac 质粒混合物（溶液“ P ” ）
对于GFP报告eCHIKIN，混合在1.5 -毫升管：
45 µl 1 µg/µl pXL-BacII CAG-mCherry
5 µl 1 µg/µl pCAG-mPB

对于CRE报道eCHIKIN，混合在1.5 -毫升管：
22.5 µl 1 µg/µl pXL-BacII CAG-mCherry
22.5 µl 1 µg/µl pXL-BacII CAG-loxP-STOP-loxP-Venus
5 µl 1 µg/µl pCAG-mPB
请注意，这些质粒 DNA 必须不含 RNase（参见配方 5 和注释 3）。

e. 最后注射鸡尾酒
向一管溶液“ R ” （共 5.8 µl）中，按以下顺序添加这些试剂（见注 4）：
11 µl 溶液“ D ”
3 µl 1 µg/µl ssDNA 供体（提前 95°C 变性）
3 µl Alt-R ® Cas9 电穿孔增强剂（2 n mol /50 µl ；浓度，40 µM ）
3 µl 溶液“ P ”
2 µl 0.1%(w/v) 坚牢绿

拌匀，和对花边冰这个解决方案。在 5-6 小时内使用。

2.卵子和胚胎的制备
a. 胚胎在 38°C 下在约 40 小时内达到第 9-10 阶段。因此，如果蛋放置在培养箱中在下午8点（第0天）时，它们应该准备中午电穿孔在第2天然而，胚胎应根据汉堡和汉密尔顿（1951），因为上演的发育率是敏感温度变化很小，鸡蛋之间也有差异。为了在计划注射多个胚胎时减缓发育，可以从孵化器中取出卵子并在室温下保持长达 5-6 小时，而不会影响生存能力。
b. 用 70% 乙醇喷洒鸡蛋并使其干燥。始终保持蛋的先前标记正面面对了病房（图5B ）。
c. 在每个鸡蛋的顶部贴上一块透明胶带（图5C ）。
d. 插入Ñ 18 ½ģ上的10针-毫升注射器到每个蛋（的圆形侧图5D ）; 这一面包含气囊。
e. 除去1-2ml的卵白蛋白取决于大小的鸡蛋（图5E ）。一些研究人员省略了这一步以获得更好的生存。
f. 使一个小窗口（〜5 -毫米直径）上的蛋通过胶带切割的顶部和用手术剪与弯曲叶片（图5F和外壳5G ）。
3.注射和卵内电穿孔
a. 如果有必要，所以轻轻摇动鸡蛋是胚胎坐落在顶部的蛋黄。如果需要，使窗口更大（图 6A ）。在某些情况下，需要使用 #5镊子小心地去除壳下方的半透明膜。

图6.关键步骤的注射和卵内电穿孔。（A）定位的胚胎和扩大窗口。（B）将阴极作为G和注入试剂混合物（蓝色）中的胚胎。(C)用汉克斯+卡那霉素润湿阴极和胚胎。（DE）我nsert阳极如在G和电穿孔。成功电穿孔后，小气泡出现在阳极。(F)用塑料胶带密封鸡蛋。它以密封所述小孔（绿色）是重要的是被用于去除由白蛋白。(G)总结。

b. 放置的下的蛋的解剖显微镜。对于初学者来说，在胚胎中看到足够的细节以进行准确注射可能具有挑战性。一种帮助是在胚胎下方注入几微升黑色印度墨水。Hamburger 和 Hamilton (1951) 中的图像对于定位很有用。
c. 将 L 形d阴极平行于胚胎放置（图 6A 和6G ）。
d. 加载CRISPR鸡尾酒成微量（图4E使用口移液管或微量（）和注入〜0.1-0.2微升例如，FemtoJet，Eppendorf）中。转导的视网膜，注入到阶段9-10胚胎（的视泡的一侧图6B和图6G ）。转导的视顶盖，注射应该在阶段11-12被靶向脑囊泡。
e. 润湿两者的阴极和胚胎与20μlHBSS +卡那霉素使用移液管尖端（图6C ）。
f.将电穿孔器的细钨阳极插入胚胎的头部 (图 6D 和6G )。
G。提供方波脉冲（图 6E 和 6G ）。视神经囊泡，我们使用6个脉冲（7 V / 25毫秒）在1 -秒的间隔。成功电穿孔的标志是阳极处出现大量微小气泡。
H。用透明胶带关闭窗口（图 6F ）。它也密封所述小孔（绿色箭头是在重要的图6F ）这是由以除去白蛋白。
一世。放置的鸡蛋备份在38℃培养箱中。
这种技巧（步骤 D2 和D 3）在很大程度上依赖于表演者的技能，需要大量的练习。专家可以每隔几分钟注射一个胚胎或在 4 小时内注射约 120 个胚胎。

E.组织学分析
小鸡胚胎在 E21 孵化；ħ H但是，从E17死亡率大大增加。这是在蛋壳中引入窗口的操作的常见结果；它不是特定于 eCHIKIN。因此，如果可能的话，最好通过 E16 检索组织。两者的视网膜和视顶盖都非常受这个年龄的成熟。
尽管可以使用其它方法，主要的分析方法是免疫histolog ÿ 。胚胎被检索，并且该适当区域（在视网膜或顶盖的此处描述的情况）被解剖。组织用 4% (w/v) 多聚甲醛/PBS 固定 15 h，依次浸入 15% (w/v) 和 30% (w/v) 蔗糖/PBS 中，包埋于组织冷冻培养基（Triangle Biomedical Sciences）中)，在 -80°C 下冷冻，并在低温恒温器中以 20 µm 切片。第然后doubl é染色的抗GFP和抗体对细胞讲座或类型特异性标志物。市售可用的兔多克隆抗GFP ，小鼠单克隆抗GFP ，一个第二抗-GFP纳米抗体-报道缀合物（RANbodies;山形和Sanes，2018一个）都可以使用。然而，市场上可用的鸡抗GFP性IgY抗体显示高的背景我ñ小鸡组织，应予以避免。详细的免疫组织化学方法已在之前的出版物中进行了描述（Yamagata 和 Sanes，2018 b和2019；Yamagata等，2021）。
一个问题是我们遇到的是找到由eCHIKIN标记的单元格，一方面是因为他们是罕见的，因为在某些情况下表达水平很低。为了规避这一限制，我们共电穿孔了由强大的、无处不在的(CAG) 启动子表达的第二个报告基因（通常是红色荧光蛋白）。为了保证通过多次细胞分裂保持表达，我们使用 piggyBac 转座子/转座酶系统确保稳定的基因组整合。在大多数情况下，使用配备荧光的解剖显微镜可以很容易地在组织中检测到来自 CAG 驱动的荧光蛋白的荧光。然后可以对以这种方式识别的区域进行解剖、切片和免疫染色。
一个潜在的混淆荷兰国际集团的因素是，HDR可能导致融入，从而失活的，的两个副本的等位基因的目标，因此改变在靶细胞。我们没有遇到这个问题：我们能够通过替代方法（例如，免疫组织化学）可视化的标记细胞未检测到异常。然而，我们不能排除它，并为此Ë测试两种方法来绕过它。一方面，我们通过靶向 C 端产生融合蛋白来维持内源蛋白的功能。例如，我们所附GFP到TFAP2A编码的C-末端区域（图7E，图8A ，及8乙）。该方法揭示了标记蛋白的亚细胞分布。在示出的情况下，所述TFAP2A蛋白是核转录因子，因此所述融合蛋白在细胞核中（局部图7F ）。根据实验的目的，亚细胞定位可能是有利的，也可能是不利的。作为第二种方法，当需要填充细胞时，我们使用可自我切割的 2A 肽来生成插入的蛋白质，并单独生成 GFP（图 7E ）。我们使用包含 P2A（来自猪 teschovirus-1 的 2A）和 T2A（来自那些 asigna 病毒的 2A）（Liu等，2017）的两个 2A 序列 (tPT2A) 的串联融合将 TFAP2A 与 GFP 分开。在这种情况下，GFP保持可溶并且填充细胞质（图小号7G和图8C ）。

图 7. TFAP2A 的 eCHIKIN。（A）的第一个与TFAP2A-eCHIKIN-GFP（绿色）和CAG-mCherry的（红色）转导的E14视网膜。内源性TFAP2A蛋白用染色的抗-抗体TFAP2A（蓝色）。TFAP2A 标记视网膜中的大多数无长突细胞，并且水平细胞（箭头）也弱表达。（B ，C）的第一个与TFAP2A-eCHIKIN-CRE，转导的E14视网膜CAG-loxP的STOP-loxP的GFP（绿色），和CAG-mCherry的（红色，只在B中所示' ）。细胞核用 NeuroTrace 635（蓝色）复染。(D)与 C 相似，但用 RANbody 染色到 GFP (P-RAN-GFP1)。注意，第是方法（山形和Sanes，2018一）导致有效水平的细胞标记（ħ ）。(E) TFAP2A-Cter-eCHIKIN-GFP 和TFAP2A-Cter-tPT2A-GFP-eCHIKIN 的示意图。（F）第一个E12视网膜转导TFAP2A-CTER-eCHIKIN-GFP。由于 GFP与TFAP2A 蛋白的 C 端融合，因此 GFP 定位于细胞核。上部 INL 中的弱染色从 mCherry 通道渗出。（G）第一个E12视网膜转导TFAP2A-CTER-tPT2A-GFP-eCHIKIN。GFP在该方法中变得可溶，从而导致在细胞质中填充有GFP。（H）的第一个与TFAP2A-eCHIKIN-GFP（绿色）和CAG-mCherry的转导的E12视顶盖（红色）。（I）第一个与染色E12视顶盖的抗TFAP2A抗体; 阳性细胞位于浅层灰色纤维层 (SGFS) 的几个薄层中。层流分布与包含光感受器的 H. ONL、外核层中的转导细胞的层流分布相匹配。INL，内核层，含有的interneurons（水平，双极，和无长突细胞）。IPL，内丛状层，包含视网膜神经元的突起。GCL，神经节细胞层，含有视网膜神经节细胞和一些无长突细胞。I 中的 Bar，B 和 FI 为 10 µm；A 和 C 中的条形为 10 µm。

图8 。eCHIKIN为TFAP2A：˚F延髓蛋白和tPT2A。(A) TFAP2A C 端侧翼的基因组序列。TGA（红色）是终止密码子。TFAP2A-Cter-crRNA的靶序列（相反链）如下所示。(B)为了生成具有 70 个碱基臂的供体 DNA 模板，使用了两个 90- nt引物。一个引物（TFAP2A-CTER-左臂-GFP前转）链接到5'端的的GFP序列（ATG），牛逼他其他的引物（TFAP2A-CTER-右臂-GFP-反向）链接到3'末端的GFP。（C）要插入TFAP2A和GFP之间的tPT2A自裂解的肽序列，所述用使用tPT2A-GFP质粒为模板的两个引物产生的供体DNA模板。序列见表 1。

例子
图 7显示了使用eCHIKIN 方法标记的表达 TFAP2A 的鸡细胞的示例。TFAP2A编码强烈无长突细胞表达的转录因子小号通过水平细胞和弱中所述的内核层视网膜。图 7A来自使用 TFAP2A/GFP 敲入构建体的视网膜转染，显示整合事件在某些情况下非常频繁。很明显，eCHIKN 标记的细胞都存在于无长突细胞所在的内核层，而 CAG-mCherry 标记的细胞分布在所有视网膜层中。每层细胞的数目可能是由间分割数的影响的piggyBac转座子的质粒和以后分析的整合; 这因细胞类别和类型而异。在此图像中，eCHIKIN-GFP 标记的细胞比 mCherry 标记的细胞多，但这是非典型的。图7B-d示出了小号从由TFAP2A-CRE和CRE依赖性报告的共电穿孔标记的视网膜切片。在图细胞7B和7 Ç分别用抗GFP，而在细胞图7D ，用抗GFP RANbody（标记为P -RAN-GFP1;山形和Sanes，2018一）。RANbody 提供比传统间接免疫荧光更强烈的标记（Yamagata 和 Sanes，2018 a ）。图7F和图7 ģ ，如上所述，显示小号标记TFAP2A-CTER-eCHIKIN-GFP和TFAP2A-CTER-tPT2A-GFP-eCHIKIN，细胞分别。
光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞- eCHIKIN的到其它15个基因，由所有视网膜神经类表示应用，在山形示出-和视网膜神经节细胞等。(2021)。在我们的手中，eCHIKIN成功标签〜90％的基因，虽然标注的效率我个相当变数。在这个快速发展的领域，可以将新方法添加到 eCHIKIN 协议中以提高效率（Yeh等人，2019 年；Broeders等人，2020 年）。
我们还将 eCHIKIN 应用于视顶盖。图7H示出了具有TFAP2A-GFP I细胞的标记n中的相同层状分布的那些标记与抗TFAP2A（图7I ）。这一结果鼓励了 eCHIKIN 可以应用于鸡胚胎的多种组织，也可能应用于其他鸟类。根据我们迄今为止的经验，我们认为该技术成功的主要关键是实现稳健的电穿孔和选择合适的 CRISPR 试剂；因此，可能需要针对其他组织或物种修改方案。

笔记

1. CRISPR-RNA
该协议使用来自化脓性链球菌的 CRISPR/Cas9 系统，因为它是最常用的。此外，目标特异性 RNA 和 Cas9 蛋白很容易从商业供应商处获得。
crRNA 的基因组编辑性能高度依赖于其序列和二级结构，以及目标基因座的染色质状态（Doench等，2014；Xu等，2015）。在这里，我们以 TFAP2A-GFP 载体（图 2和图8）的设计为例来说明选择过程。所述CRISPR / Cas9系统的一个约束是，一个protospacer相邻基序（PAM）必须被结合到所述CRISPR的设计; 对于化脓性链球菌Cas9，PAM 是三核苷酸 NGG。靶向 CRISPR/Cas9 核酸内切酶在 NGG 上游三个核苷酸处生成平末端。被设计S中的靶序列的需要UCH该预期的插入接近该双-链断裂，preferabl ÿ <10个碱基之内。首先，从最近的基因组组装（目前为Gallus gallus GRCg6a）中检索序列。确认报告的序列可能会有所帮助，因为某些基因仍未完全注释。ENSEMBL（https://ensembl.org）提供了一个功能， “导出数据，”这允许序列便于检索小号侧翼第ë搜索序列。然后使用公开可用的工具（例如，UCSC 基因组服务器 https://genome.ucsc.edu 中的 CRISPR 10K Super-track）基于一组特异性和效率评分选择目标序列（图 2A）。有多种最近的方法可用；然而，对它们的描述超出了本协议的范围[参见 Hanna 和 Doench (2020) 的全面审查] 。目标不应该是重复的元素通过扩散出来的基因组，但没有必要严格地排除潜在的靶crRNA切割网站，因为HDR大大增强了一体化的特异性的靶向的基因座。
2.设计和准备的供体DNA的HDR
对于HDR，单-链DNA（ssDNA）被广泛用作供体。为了实现HDR在高效率，单链DNA通常包含小号侧翼围绕在每一侧上的同源50-80个碱基的序列的核酸酶切割位点（陈等人，2011;杨等人，2013;理查森等人，2016;德罗斯等，2017）。对于 eCHIKIN，我们使用 70 个碱基的同源臂，因为 90 个碱基的 DNA 的商业合成可用且价格合理（见下文）。另外，也可以使用双-链环状质粒DNA或双-链线性DNA作为HDR供体。然而，它们需要更长的同源臂（200 BP-2 kb的p或更长），这可通过分子克隆来制备（例如，贝克等人。，2017）。此外，线性化的双-链的DNA常常随机地融入的基因组中，而不是专门针对CRISPR介导的断裂，这可能导致非特异性模式表达。
短单链DNA也可以得到与单-链寡核苷酸（例如，高达200个核苷酸; IDT的Ultramer）其可以结合短的表位标签的一些侧翼序列（例如，27个核苷酸对于HA标签），以及左侧和右侧臂（ 2 × 70 nt）。化学合成可用于更长的 ssDNA，足以编码同源臂和报告基因（例如，GFP [~700 nt] 或 Cre [~1 , 000 nt]）；ħ H但是，这些方法成本高到由于大量的ssDNA的需要。相反，我们生成使用两个90模板-bp DNA寡核苷酸（70个碱基的左，右手臂，和20个碱基互补的5 “和3 ”的端部的的cDNA，分别记者）（图1，图2D-F ）。为了使用此模板制备大量长 ssDNA，我们使用不对称 PCR ，其中以100 倍的浓度添加一个引物。扩增的ssDNA可以通过琼脂糖凝胶电泳纯化，用苯酚-氯仿和氯仿处理，乙醇沉淀，-20°C保存。
尽管已使用其他方法制备长 ssDNA（例如，T7 RNA 聚合酶/逆转录酶/RNase H 的组合，或使用一种磷酸化引物产生的 PCR 产物的 λ 外切核酸酶消化），但我们的经验是不对称 PCR 方案更多一致、坚固且价格低廉。
已证实的对非靶链的ssDNA互补施主略好为HDR比的单链DNA的供体互补的靶链（理查森等人。，2016）。因此，对应于目标序列将是单链DNA的第一选择，虽然在相对的ssDNA也是有效的在我们手中。我们根据琼脂糖凝胶纯化的难易程度选择 ssDNA 。
3. piggyBac 记者
为了监测成功的电穿孔，我们添加一个转座子piggyBac的质粒配备CAG（CMV，β-肌动蛋白启动子/增强子/前导球蛋白）驱动的mCherry连同一个CAG驱动piggyBac转转座（山形和Sanes，2012）。该转系统用于通过集成的帮助下稳定地标记电区域的转座。随机集成的 mCherry 用于区分 GFP，它专门集成在目标基因座上。当 Cre 用于 HDR 时，我们还使用 pigg y B ac来引入依赖于 Cre 的 GFP 报告基因（loxP-STOP-loxP-GFP）。
4.高清增强器
添加了两种额外的试剂以增强 HD 和电穿孔。甲DNA连接酶IV抑制剂（Alt键-R ® HDR增强器，从IDT的SCR7相关专利产品）抑制NHEJ，由此导致HDR。SCR7有几项研究被用来改善HDR（丸山等人，2015年;胡等人。，2018）; 尽管如此，这种方法尚未成为普遍做法（Yeh等，2019）。对于鸡胚胎，这种试剂似乎是无毒的。我们还使用了IDT的 Alt-R ® Cas9 电穿孔增强剂；这是一种纯化载体 DNA 片段的混合物，可通过电穿孔改善 CRISPR/Cas9 RNP 的递送。我们发现在注射液中加入 Alt-R ® HDR Enhancer 和 Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer 可以提高 eCHIKIN 的效率。

食谱

1. HBSS与卡那霉素
每毫升 HBSS添加50 µg 硫酸卡那霉素
保持在 4°C
2. 0.1% (w/v) 固绿FCF
将100 mg Fast Green FCF溶解在1 ml 无 RNase 的水中
过滤慢慢通过一个0.45 -微米的过滤器
保持在 4°C
3.氯仿我soamyl醇（25：1）
25 c氯仿：1 i大豆醇
保持室温。
4.苯酚- Ç hloroform （1：1）
1个p苯酚的制备：1 Ç hloroform-我soamyl醇。
苯酚需要用 10 mM Tris - HCl、1 mM EDTA、pH 8.0饱和。保持在 4 °C 。
5.质粒
所有质粒都需要不含 RNase。使用试剂盒（例如Qiagen）纯化后，质粒应如下处理：
一种。加入1 ：10体积的5M NaCl和相同体积的p henol- Ç hloroform（1：1）和涡流30秒。
湾旋在的最大转速5分钟一微型离心机（例如，16 ，100 ×克在室温下）。回收的水相。
C。重复的苯酚-氯仿处理。
d. 添加氯仿-异戊醇（25：1），涡旋，旋转，并恢复所述含水相。
e. 重复的氯仿-异戊醇处理。
F。添加2.5体积小号的乙醇，以沉淀的质粒DNA。
G。P ellet和冲洗用70％乙醇（在-20℃预冷）洗涤三次。
H。干燥并重新悬浮于不含RNA酶的水，以使一个1微克/微升的库存溶液。
在 4°C 下保存一个月内使用或分装成等份并在 -20°C 下冷冻以长期储存。

致谢

这项工作得到了 NIH 的赠款 R01EY022073 和 R37NS029169 的支持。在最近的出版物中使用了此处描述的方法：
Yamagata, M., Yan, W., Sanes, JR (2021)。基于单细胞转录组学的鸡视网膜细胞图谱。eLife10：e6 3907。doi：10.7554/eLife.63907。

利益争夺

作者报告没有竞争利益。

伦理

动物按照批准NIH的指导方针和协议所使用的实验动物使用和护理委员会在哈佛大学。

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