材料和试剂

1. C18 Sep-Pak 柱（Waters，目录号：WAT043395）
2.毛细管，125μ中号内径（Polymicro，目录号：1068151718）
3.离心管小号，将50ml（VWR，目录号：21008-178或类似的）
4.玻璃纤维（康宁，目录号：UX-34552-01）
5.凝胶加载移液管尖端小号1-200微升（费舍尔，目录号：02-707-138）
6.低蛋白结合的微量离心管š ，1.5毫升（的Eppendorf，目录号：022431081）
7.微量离心管小号，1.5毫升（的Eppendorf，目录号：0030108442）
8. Micro-spin column s （Thermo，目录号：89879）
9. Kimwipe s （Fisher，目录号：06-666-1A）
10. Parafilm（VWR，目录号：52858-076）
11. Qiagen公司的Ni-NTA旋转柱小号（QIAGEN，目录号：31014）
12.剃须刀刀片小号（VWR，目录号：55411-055）
13.样品瓶小号（孙西汀，目录号：501-300）
14.样品瓶卡扣盖s，11 毫米（Fisher，目录号：14-823-379）
15.乙酸（Fisher，目录号：A38S-500）
16.丙酮（Fisher，目录号：A11-1）
17.乙腈（Fisher，目录号：A998-1）
18. α酪蛋白（Sigma，目录号：C6780-250MG）
19.氢氧化铵溶液（Sigma，目录号：205840010）
20.血管紧张素II肽（Sigma，目录号：A9525-5MG）
21.贝塔酪蛋白（Sigma公司，目录号：C6905-250MG）
22.二硫苏糖醇（Sigma，目录号：10197777001）
23.乙醇（VWR，目录号：89125-186）
24.乙二胺四乙酸（VWR，目录号：MK258012）
25.甲酸（Sigma，目录号：33015-500ML）
26.碘乙酰胺（Sigma，目录号：I1149-5G）
27.铁（III）Ç hloride六水合物（霍尼韦尔，目录号：236489-500G）
28. NaCl（Promega，目录号：PRH5273）
29.十二烷基硫酸钠（Sigma，目录号：L3771-100G）
30.目标聚丙烯锥形插入物（Thermo，目录号：C4010-629P）
31.三氟乙酸（Thermo，目录号：28904）
32. Tris 碱（Fisher，目录号：BP152-500）
33.胰蛋白酶G老，质谱级（Promega，目录号：V5280）
34.尿素（Fisher，目录号：U15-500）
35.尿素/ Ť RIS溶液（见配方）
36. α/β ç asein p eptide d igest （见配方）
37. 0.1 P 溶液（见配方）
38.胰蛋白酶G旧溶液（见食谱）
39. C18 缓冲液 E （见配方）
40. C18 缓冲液 W1 （见配方）
41. C18 Buffer W2 （见配方）
42. C18 Buffer W3 （见配方）
43. FeCl 3溶液（见配方）
44. IMAC 洗脱液（见配方）
45. IMAC 剥离液（见配方）
46. IMAC 洗 I （见食谱）
47.碘乙酰胺（IAc）溶液（见配方）
48. IP 洗脱缓冲液（见配方）
49. PPT小号olution （见食谱）

设备

1毫升BD注射器小号与滑动尖端（BD，目录号：309659）
2 ×水浴或加热块（Thermo，型号：TSGP02 或类似）
镊子（VWR，目录号：89259-984）
台式离心机（Beckman，型号：A 99469 或类似型号）
台式微量离心机（Beckman，型号：A46471 或类似产品）
微量移液器（吉尔森，目录号：F167380或P2，P20，P200，P1000类型类似试剂盒）
注：直径：NE水浴/加热块应该被设置为42 ℃，而另一个至65 ℃下。
Orbitrap 质谱仪；例如，Q-Exactive HF (Thermo, IQLAAEGAAPFALGMBFZ)
剪刀（VWR，目录号：82027-596 或类似）
UHPLC系统耦合到一质谱仪; 例如，UltiMate 3000（Thermo，型号：IQLAAAGABHFAPMBEX）
真空浓缩离心机（Thermo，型号：SPD131DDA）
真空浓缩器过滤器（Thermo，型号：VPOF110）
真空浓缩泵（Thermo，型号：VLP120）
真空浓缩器蒸汽阱（Thermo，型号：RVT5105）
注：我TEMS 9-12是什么被称为各个部分在“speedvac中”该协议的后面的步骤。

软件

XCalibur Qual Browser (Thermo Scientific, https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30965?SID=s rch-srp-OPTON-30965#/OPTON-30965?SID=srch-srp-OPTON -30965 )
彗星 ( http://comet-ms.sourceforge.net/ )
注意：可以使用任何其他常用的质谱分析软件。

程序

IP 洗脱液的还原、变性、烷基化和胰蛋白酶消化
大多数标准 IP 协议都适用于此过程。建议免疫沉淀诱饵蛋白2-10 mg蛋白提取物在此过程中（本发明的蛋白质的样品中的免疫沉淀之后将在低的量-微克范围内）。以下裂解，免疫沉淀，和洗液，加入3 ×的树脂体积IP洗脱缓冲液（见食谱有关粗体溶液信息部分），以所述样品。在 65°C 下孵育 15 分钟。
注：- [R ESIN体积指的是在IP中使用的珠子的数量。例如，如果30 μ升50:50琼脂糖树脂：使用缓冲浆料，树脂体积为15 μ升，和洗脱的体积的缓冲液中使用。将45 μ升。
将样品旋转至 1000× g 1 分钟。取的上清液（=在使用IP洗脱缓冲液的体积的之前的步骤），并转移到一个新的试管中。
注：我˚F的样本已经被代谢标示SILAC分析，轻型和重型IP洗脱液应先汇集到碘乙酰胺处理。
添加碘乙酰胺 (IAc) 溶液至最终浓度为 25 mM。孵育在黑暗中室温erature 15分钟。
添加4卷PPT小号olution （见食谱）来的样品。涡流的管10 š洗的整个内部，并在冰上孵育30分钟-1小时。较长的孵育时间可以略微提高的产率，但在30分钟应足以沉淀大部分蛋白质小号。PPT 含有易燃丙酮，应小心处理。
旋转的以最大速度（〜14000样本×克）在台式离心机10分钟。
倒掉PPT溶液。您应该会在试管底部看到一个白色的小颗粒。或者，可能有小的蛋白质颗粒沿着管的侧面飞溅。
加入1 ml PPT溶液到该管和涡流洗的顶部和侧面。以最大速度减速 1 分钟。倒掉PPT 。
将开口管轻轻敲击 kimwipe 以去除残留的PPT ，注意不要移动底部的颗粒。离开的在室温下管开放erature 〜5分钟，或直至所述丙酮气味几乎消失了。
甲DD 20微升ù REA / Tris溶液到管。涡流的样品30秒，然后添加60 μ升的DDH 2再次O.涡流。
甲DD 1 μ升胰蛋白酶ģ旧溶液到管。封口膜管的顶部和 nutate 在 37 ° c过夜。

样品脱盐
n个分机天，酸化的通过添加甲酸（FA）的样品在三氟乙酸（TFA）的0.25％的终浓度，并在0.25％的最终浓度。此外，添加2微升α/β ç asein p eptide d igest （见配方节有关如何制备本soluti细节上）。
：注意我建议吨至使TFA和FA的10％工作储备在水中使用。
加入20制备微-自旋脱盐柱μ升100毫克/毫升C18树脂在乙腈。
首先，除去在从鲁尔插头的微离心柱。
通过切开任何尺寸的 Waters C18 Sep-Pak 柱获得 C18 树脂。称取少量 C18 粉末并以 100 mg/ml 的浓度重悬于纯乙腈中。
以 1 , 500 × g旋转30 秒。如果C18树脂是尚未水平在微离心柱的底部，添加40 μ再次升乙腈到列和自旋。
条件通过添加100柱μ升C18缓冲液E和自旋为1 ，500 ×克30秒。
平衡柱通过添加100 μ升C18缓冲液W1和自旋为1 ，500 ×克30秒。
加载的酸化样品上到该柱上; 大约 100 μ升。以 1 , 500 × g旋转30 秒。
通过加入100洗涤柱μ升C18缓冲液W1和自旋为1 ，500 ×克30秒。
通过加入100洗涤柱μ升C18缓冲液W2和自旋为1 ，500 ×克30秒。
通过加入100洗涤柱μ升C18缓冲液W3和自旋为1 ，500 ×克30秒。
洗脱的样品置于低蛋白通过添加结合Eppendorf管100 μ升C18缓冲液E和自旋为1 ，500 ×克30秒。
P花边在样品一个speedvac中直至干燥; 大约 40 分钟
注：我t是重要的，以确保样品完全干燥。如果一些液体仍持续干燥后的40分钟，继续在speedvac中干燥，直到所有的液体已经一去不复返了。
重构的在20样品μ在DDH升0.1％乙酸2 O.

制备的Fe-NTA ř ESIN
甲DD 25毫升IMAC剥离溶液到50 -毫升管。
除去一个从包装（图Qiagen公司的Ni-NTA旋转柱1 a）和相关联的收集管。确保该盖是打开的，并通过开放保持50柱-米升含有25ml IMAC剥离液（图管小号1个B和1个C）。用镊子尖小号或类似薄，尖对象，捅塔的底部孔以去除所述两个玻璃料和所述树脂之间（图1 C）。玻璃料和树脂会落入50 -毫升管（图1 d）。章动为1个小时，以剥离所述从镍的NTA树脂。

图1 。从离心柱中收获 Ni-NTA 树脂。(a) 从收集管中取出的 Ni-NTA 柱。（B）26 ml的IMAC在50剥离液-米升锥形管中。(c) 将玻璃料和干燥树脂戳入 IMAC 剥离溶液的镊子方法。(d) 来自 Ni-NTA 柱的玻璃料漂浮在汽提溶液中。树脂会沉到底部。后一个50 -分钟垂头在剥离液，熔块可以被丢弃。

以 1 , 000 × g旋转1 分钟。丢弃的上清。第一个上清液将包括来自 Ni-NTA 柱的两个筛板。
用 25 ml ddH 2 O洗涤一次。
用 25 ml 0.6% 乙酸的 ddH 2 O洗涤一次。
重悬的于18ml 0.3％的醋酸在DDH树脂2 O.加入2mL的FeCl 3溶液。章动2-3小时以结合的铁的NTA树脂。
以 1 , 000 × g旋转1 分钟。丢弃的上清。
用 25 ml 0.6% 乙酸的 ddH 2 O洗涤一次。
用 25 毫升IMAC 洗液 I洗一次。
注：˚F或这一步，章动为1分钟旋转下来之前。
用 25 ml 0.1% 乙酸的 ddH 2 O洗涤一次。
重悬的在DDH于0.1ml 0.1％乙酸树脂2 O和转移到微量离心管中。所述的Fe-NTA树脂应该是每次制备的新鲜。

凝胶加载器尖端列的制备。
用乙醇清洁小面积的工作台表面。有玻璃纤维（4），凝胶型装载机尖端小号（3），BD注射器š与滑动尖端（2），和125的一小部分- μ米毛细管准备（1）（参见图2一个）。
将凝胶加载器尖端安装到微量移液器上。Ť AKE高达10 μ升的DDH 2 O和在10作出一个标记μ与L电平一个永久性标记。
从移液器上取下凝胶加载器尖端，用剪刀剪开它的顶部，使其紧贴在 1 - ml BD 注射器上。
在戴手套的手指之间滚动一小缕玻璃纤维。使用剃须刀片切成 5-10 毫米的小段。
插入的玻璃纤维段与所述凝胶装载机尖的顶端的10 - μ l标记（图2的B）。使用的125的部分- μ米毛细管到玻璃纤维段迫使凝胶装载机尖的尖端。用镊子夹住凝胶加载器尖端的末端。一些玻璃纤维应该从凝胶的末端突出-加载器尖端在这一点上（图2 B中，在尖端的末端纸币缕）。使用剃刀刀片切断任何突出玻璃纤维（图2 c）所示。

图2 。凝胶加载器尖端微柱的制备。（a）中的材料所需要的装配柱：（1）125 - μ米毛细管; (2) 1 - ml l BD 注射器，带滑动头；(3) 凝胶加载器尖端；和（4）玻璃纤维，轧制和切成小部分。(b) 凝胶加载器尖端（注意 10 -蓝色墨水中的微升标记），顶部切割以适应 BD 注射器和从尖端略微突出的玻璃纤维束。(c) 准备好用于富集磷酸肽的最终树脂填充凝胶加载器尖端。插图显示末端已被卷曲并被移除以形成扁平尖端的位置。

磷酸肽富集。
制备的柱（参见图小号2和3为装配柱）加入20微升0.1％乙酸：树脂混合物从小号TEP C11到凝胶-加载器尖端。使用BD注射器申请背压列，迫使该树脂定居。保持该柱立式在任何时候都保证了树脂床均匀且不受干扰。不断加入0.1％乙酸：树脂混合物，直到所述树脂水平达到10 - μ在凝胶l标记-加载器尖端。一旦该结算树脂已达到10 -微升标记，可以使用BD注射器以迫使所述通过所述柱的剩余的0.1％乙酸溶液中。
注：我t是非常重要不允许列干。由于正在处理的数量很少，这具有挑战性。当最初制备的柱并进行洗涤时，允许所述液体到达树脂床的极边缘（弯液面应该几乎消失）。此时，必须快速从 BD 注射器中取出色谱柱以防止干燥。在洗涤之间，将所述在1.5树脂填充凝胶装载机尖端直立-毫升微量离心管中。

图3 。带有磷酸肽富集柱的 BD 注射器。图显示了一个完整的、组装好的磷酸肽富集柱。

一旦该磷酸富集柱已装配，洗一次，用25微升IMAC洗涤II平衡的柱上。
注：w ^母鸡传递解决方案在列，必须要非常谨慎小心，不要打扰树脂床。小心移液！
适用的酸化，用胰蛋白酶处理样品的柱（20 μ升在0.1％乙酸重构，从协议小号TEP B12）。使用应用一致的压力的BD注射器和丢弃的流出液。
注：（可选）的流出物可以在磷酸浓缩，如果第一次尝试失败积攒了第二次尝试。
一旦所述样品已被完全装到树脂，吸管100 μ升IMAC洗我ö n要的柱，然后取出90微升，留下10微升。通过推动将10μl的使用柱的BD注射器。
吸移管100 μ升的DDH 2 ö ø n要的柱，然后取出90微升，留下10微升。通过推动将10μl的使用柱的BD注射器。而所述的DDH 2 Ó洗脱，使用的Kimwipe擦拭凝胶装载机柱的最顶端。这将有助于以除去残留的污染物。
洗脱的用30磷酸μ升IMAC洗脱溶液到标记为“90％的微量离心管内的目标聚丙烯锥形插入管” 。然后将 3 µl转移到标有“10% . ”
P花边都将在SpeedVac样品，直至完全干燥。
在 5 µl 0.1 P 溶液中重悬两个样品。
继续进行 MS 分析。由于低丰度和磷酸化肽的疏水性，建议避免使用捕获柱。首先运行总样本的 5%。如果该MS色谱是相对自由的聚合物和其它的污染物，负载增加量的样品的（F或例如：10％，20％，和50％）。继续执行该“ d ATA的分析”一节。

图4 。代表性 IP-IMAC 色谱图。0.1P 溶液中5% 样品的代表性色谱图（上图）。如果 5% 样品的色谱显示具有很少污染物的对称峰，则继续注射 20% 样品（底部面板）。污染物可识别为样品中存在的任何+1 电荷态离子。两个样品中都存在相同数量的血管紧张素 II 肽 (~200 fmoles)。还指出了酪蛋白肽。酪蛋白肽 (1)：β 酪蛋白，m/z 1031.41，FQSphosEEQQQTEDELQDK；酪蛋白肽 (2)：α 酪蛋白，m/z 830.90，VPQLEIVPNSphosAEER。

数据分析

对磷酸肽重新内部控制covery （监视α/β Ç asein磷酸肽）
应在脱盐前将胰蛋白酶化的 α/β 酪蛋白加入样品中作为内部对照，以验证方案的磷富集部分是否正常工作。在质谱仪上运行 5% 的样品后，在 Qual Browser (Thermo Scientific) 中添加以下 MS1 m/z范围：830.5-831.5；1030.5-1031.5。保留时间可能因用户而异，具体取决于所使用的 HPLC 梯度曲线。这些范围包括两种诊断性 α/β 酪蛋白磷酸肽（详见图4图例）。磷酸化的酪蛋白肽的光谱强度应大于比1.00E6 5％样本。较低的强度表明需要进行磷富集故障排除。通常情况下，低效磷酸富集是由于过度搅拌的洗涤之间的Fe-NTA树脂柱或干燥。
大众小号pectrometry d ATA一nalysis
质谱数据可以是ANALY Ž使用任何现有的软件如MaxQuant，巫师，彗星，或蛋白质组发现者编参数为所述通过质谱法公顷磷酸化的肽的鉴定VE了详尽的别处所描述的（Mann和詹森，2003;穆勒等人，2008;德语。等人，2010;巴斯托斯奥利维拉等人。，2018;法卡等。, 2020) 。典型质谱数据分析参数将包括半胰蛋白酶的要求，一个10-20ppm的前体质量耐受性，79.966331的微分质量修改沓为的丝氨酸，苏氨酸，或酪氨酸残基的磷酸化，和的57.021465静态质量修改为氨基甲酰半胱氨酸。
有多种方法可以显示 IP 磷酸富集实验生成的数据。有2个或多个肽谱匹配（的PSM）磷酸肽可以显示在不存在沿的定量信息与该蛋白质的棒模型的兴趣。在存在定量 MS 信息的情况下，例如从 SILAC 或 TMT 分析获得的信息，可以生成散点图或直方图，表明两种遗传或药理学条件之间诱饵蛋白磷酸化的定量差异。举例来说，我们指的是包含在我们的实验室中产生IMAC数据执行以下工作（兰兹等人。，2018;百乐等人。，2019）。

食谱

0.1P 溶液
1皮摩尔/ μ升血管紧张素II的肽，在DDH 0.1％三氟乙酸2 ö
储存在-20 ℃下在500 -微升等分试样
C18 缓冲液 E
80% 乙腈、0.1% 乙酸的ddH 2 O
储存在室温erature
C18 缓冲器 W1
0.1% 三氟乙酸的ddH 2 O
储存在室温erature
C18 缓冲器 W2
3% 乙腈、0.1% 甲酸的ddH 2 O溶液
储存在室温erature
C18 缓冲器 W3
0.1% 乙酸的 ddH 2 O
储存在室温erature
DTT 溶液（用于 IP 洗脱缓冲液）
ddH 2 O 中的1 M DTT
分小份冷冻，尽量减少冻融循环
FeCl 3溶液
1 M FeCl 3 ，0.3% 乙酸的 ddH 2 O
存放在室温erature 。在实验前几天准备好，不要搅动。在室温下稳定数年。
IMAC 洗脱液
12% 氢氧化铵、10% 乙腈的 ddH 2 O溶液
存放在室温erature 。盖紧盖子以防止氢氧化铵蒸发。
IMAC 剥离液
50 mM EDTA、1 M NaCl 溶于 ddH 2 O
储存在室温erature
IMAC洗我
25% 乙腈、100 mM NaCl、0.1% 乙酸的 ddH 2 O
存放在室温erature 。确保是该解决方案盖紧以防止蒸发乙腈。
IMAC洗II
1% 乙酸的 ddH 2 O
储存在室温erature
碘乙酰胺 (IAc) 溶液
的500mM碘乙酰胺，1M Ť RIS pH 8.0中在DDH 2 ö
准备新鲜
IP 洗脱缓冲液
1％十二烷基硫酸钠，100mM的Ť RIS pH 8.0中在DDH 2 O，10mM的二硫苏糖醇（DTT）。
不含 DTT 的 IP 洗脱缓冲液可在室温下长期保存；每次都应添加新鲜的10 mM DTT。
PPT小号olution
50% 丙酮
49.9% 乙醇
0.1%醋酸
存放在室温erature 。确保是该解决方案盖紧以防止丙酮和乙醇蒸发。
胰蛋白酶G旧溶液
1微克/微升Ť rypsin ģ老，0.3％乙酸在DDH酸2 ö
储存在-80 ℃下在1 -微升等分试样
脲/ Ť RIS溶液
8M脲，50mM的Ť RIS pH 8.0中在DDH 2 ö
准备新鲜
α/β ç asein p eptide d igest
5 pmol/ µl 胰蛋白酶消化的 α-酪蛋白、5 pmol/ µl 胰蛋白酶消化的 β-酪蛋白、1% 乙酸的ddH 2 O
储存在-20 ℃下在500 -微升等分试样

致谢

作者感谢 Smolka 实验室的成员提供与这项工作相关的宝贵见解 –特别是威廉康斯托克，他对这个协议进行了仔细的测试。我们感谢Beatriz SV Almeida 的技术支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院对 MBS 的资助（R35GM141159、R01GM097272、R01GM123018 和 R01HD095296；设备补充 R01GM097272 - 07S1）。该协议源自于(Lanz et al . , 2018; Sanford et al . , 202 1 ) 中出现的实验。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

没有人类或动物伦理与本协议相关。

参考

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