材料和试剂

一次性移液器吸头，0.1-10 μl（M&S Instrument，目录号：F161630）
一次性移液器吸头，2.0-200 μl（M&S Instrument，目录号：F161930）
一次性吸头，100-1 ，000微升（M＆S仪器，目录号：F161670）
一次性移液器吸头，500-5,000 μl（M&S Instrument，目录号：F161571）
玻璃试管，18 × 150 毫米
玻璃管铝盖
300 -毫升小号克竞锥形˚F lasks带有挡板
硅胶塞（AS ONE，BIO-SILICO ® ，N-42，目录号：5-1100-03）
聚丙烯锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：3009650）
用于近紫外和可见光的一次性电池（AS ONE，标准型，目录号：1-2848-01）
无菌注射器过滤器，0.2 - μm（颇尔，Acrodisc ® ，产品 ID：4612）
大肠杆菌C43（DE3）细胞（Lucigen，OverExpress TM菌株，目录号：60446-1）
靶微生物的视紫红质基因克隆到所述的pET21a（+）载体
注意：目标基因针对大肠杆菌的密码子进行了优化并合成（GenScript）。将合成的基因的NdeI和XhoI位点之间克隆在所述的pET21a（+）载体（：69740 Sigma-Aldrich公司，Novagen公司，目录号）。
酵母提取物（BD ，目录号：212750）
胰蛋白胨（Nacalai T esque，目录号：35640-95）
氯化钠（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：191-01665）
氨苄西林钠（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：014-23302）
消泡剂 PE-L（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：013-17201）
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG；Sigma-Aldrich，目录号：I5502）
清一色的反式-视黄醛（多伦多研究化学品，目录号：R240000）
盐酸（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：080-01066）
氢氧化钠（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：192-15985）
羰基-氰化物 3-氯苯腙（CCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2759）
二甲亚砜（DMSO）（FUJIFILM和光纯药，目录号：046-21981）
磷酸氢二钠（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：042-30055）
羟胺ħ ydrochloride （FUJIFILM和光纯药，目录号：081-01471）
正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）（Anatrace，目录号：D310）
来自蛋清的溶菌酶（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：129-06723）
脱氧核糖核酸酶 I，来自牛胰腺，结晶前（DNaseI）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：043-26773）
2×YT培养基（参见ř ecipes）
50mg / ml的一个mpicillin股票溶液（见ř ecipes）
30mM的CCCP股票溶液（见ř ecipes）
的2M ħ ydroxylamine股（见ř ecipes）
漂白缓冲液（见ř ecipes）

设备

常数-温度摇动培养箱（TAITEC，Bioshaker BR-43FL·MR，码数：0053027-000）
高速冷冻离心机（的Eppendorf ħ的iMac Ť echnologies，型号：CF15RN）
固定-角转子（的Eppendorf ħ的iMac Ť echnologies，型号：T15A42）
微量移液器（10- 和 200-μ l和 5- ml ；Gilson）
涡流混合器（Electro Scientific Industries，型号：GENIE2，目录号：SI-0286）
数字色度计（TAITEC，型号：miniphoto518R，目录号：0040889-000）
管旋转器（AS ONE，型号：ACR-100）
pH计（HORIBA、LAQUA、型号：F-55）
pH 电极（HORIBA，型号：9618S-10D）
台式暗房
用于避光的pH 电极盖
注意：我们做了一个通过切割15的底盖的pH电极-毫升管中并用黑布胶带覆盖。
水夹套玻璃样品瓶
磁力搅拌器（AS ONE，型号：CT-MINI）
低温circulat荷兰国际集团浴（EYELA，型号：NCB-1210）
300-W 氙弧光源（ASAHI 光谱，型号：MAX-303）
龙-通滤波器（AGC科技玻璃，型号：Y型52）
吸热过滤器（SIGMAKOKI，型号：HAF-50S-50H）
超声波均质机（TAITEC，型号：VP-300N）
紫外可见光谱仪（JASCO，型号：V-750）
对积分球单元一紫外-可见分光光度计（JASCO，型号：ISV-922）
吸入泵（AIR LIQUIDE，型号：SP30）

软件

数据收集软件的一个pH计（HORIBA）

程序

大肠杆菌细胞中的蛋白质表达
接种4米升2×含有50μg/米YT肉汤升氨苄青霉素与大肠杆菌细胞携带靶基因的视紫红质的质粒，并培育在37℃过夜振荡（200rpm）。
接种 115 ml含有 50 μg/ ml氨苄青霉素和 0.01% (v/v) 消泡剂的115 ml 2× YT 肉汤和1.15 ml过夜培养物，并在 37°C 振荡（200 rpm）孵育直至对数中期（ OD 660为 0.5 - 0.7)。
当光学密度达到目标值，添加IPTG和清一色反式-视黄醛的储备溶液在一个分别为0.1mM和10μM的终浓度。
在 37°C 下振荡（200 rpm）孵育 4 小时。
注意：培养的细胞可以在 4°C 下避光保存过夜（用铝箔覆盖以防止曝光）。

通过监测细胞外 pH 变化测量离子转运活性
注意：用于测量光依赖 pH 变化的设备的设置如图 1 所示。
转移5米升培养到玻璃试管中，并测量OD 660使用数字量热计（培养的细胞的直径：ptical长度为18毫米）。d ispense培养细胞到15 -米升含有等效电池量至15 OD·米塑料管升（OD 660 ×总体积（米升的细胞悬浮液））。
通过离心（4收集细胞，800×克，2分钟，20℃），弃去上清液。
RES uspend在5米细胞升缓冲100mM NaCl的溶液中，通过离心收集（4 ，800×克，2分钟，20℃）。
RES uspend在5米细胞升缓冲100mM NaCl的溶液中，在室温下混合（22 - 25°C）通过旋转10分钟，并且通过离心（4收集，800 ×克，2分钟，20℃）。
重复小号TEP乙4个三次。
RES uspend在7.5米细胞升缓冲100mM NaCl的溶液中。
将细胞悬液转移到 20°C 的水套玻璃细胞小瓶中。
注意：在预先平衡的水的温度-通过运行在circulat调节至20℃的水夹套的玻璃小瓶细胞ING浴。随后的测量在 20°C 下进行。
浸入pH电极，避光，在向所述细胞小瓶中，并监测细胞悬浮液的pH，同时用磁体搅拌。
调整细胞悬浮液的pH至6.9 - 7.0用NaOH或HCl将少量，和稳定pH的波动。
按照下面描述的程序记录 pH 值随时间的变化。
在黑暗中记录基线pH 值3 分钟。
使用一个截止滤波器（Y-52）和一吸热滤波器（HAF-50S-50H），从氙气灯为150秒照射的光的样品在覆盖的视紫红质的吸收波长的波长范围内。
关灯，等待 pH 值恢复到基线水平（这需要 150 秒以上）。
记录的基线pH值再次在黑暗中2分钟。
添加 10 μl 20 mM HCl 并监测 pH 值 150 秒以校准细胞悬液的缓冲效果。
添加 10 μl 20 mM NaOH 使 pH 值恢复到基线水平。
注意：图 2 显示了一个代表性的痕迹。

图 1. 测量光依赖 pH 变化的设置。一个。设置的整体视图。乙。测量部分的特写视图。

图2的细胞外pH瓒代表跟踪GE监测。这里显示的是一个测量分裂视紫红质- 1 ( SzR1 )的例子，它表现出向内的质子泵活动。黑色和橙色框分别表示黑暗（黑色）和光照（橙色）条件。

添加2.5μ升30mM的CCCP和重复小号TEP乙10。
注：由于CCCP 是质子载体，当视紫红质直接运输 H +时，pH变化会降低，但当次级 H +运输与其他离子运输（如 Na +或 Cl – ）相关时，pH变化会增强（Inoue 等人，2013，吉泽等人，2014 年）。
完成测量后，使用微量移液器从玻璃细胞中取出细胞悬浮液。
用超纯水清洗玻璃池五次。
注意：要完全去除玻璃池中的废水，请使用抽吸泵。

孔定量吨使用羟胺表达的蛋白质的通货膨胀（HA）漂白方法
样品制备
转移5米升培养到玻璃试管中，并测量OD 660使用数字培养细胞的Ç ö lorimeter （ø ptical长度为18毫米）。分配培养细胞到15 -米升含有相当于20 OD·米的细胞量的塑料管升。
通过离心（4 ℃ 、800 × g 、2 分钟、室温）收集细胞并丢弃上清液。
将细胞沉淀储存在- 80°C 直至使用。
RES uspend收集的细胞在1毫升漂白缓冲器含有1mM溶菌酶（MW = 14307）和调整音量至3ml与漂白缓冲器。
注意：使用前立即溶解 1 mM 溶菌酶。
使用抹刀尖端将少量 DNase I 添加到细胞悬液中。随后，用铝箔覆盖管子并在室温下旋转混合 1 小时。
将细胞悬液置于冰上并通过超声破碎细胞，直到裂解物变得不那么混浊。此处使用的超声处理条件是 5 秒的超声辐照脉冲，间隔为5 秒，输出为 35%，总共 10 分钟。
为了溶解膜蛋白，将 0.09 g DDM 添加到超声处理的细胞悬液中（DDM 最终浓度为 3%），用铝箔覆盖管子，并在 4°C 下旋转混合过夜。
吸收光谱的测量
注意：吸收光谱是使用带积分球的紫外-可见光谱仪测量的。所有操作均在黑暗或红光（λ > 660 nm）条件下进行。
转移2.7毫升溶解样品的一次性光学试管用10 -毫米光路长度。中号之前easure吸光度的增加HA的。
注意：此步骤在添加 HA 之前检查样品的状态，例如细胞破坏和溶解的状态以及来自目标蛋白的信号。
向溶解的样品中加入 0.9 ml 2 M HA 储备溶液，并通过移液充分混合（最终 HA 浓度，500 mM）。测量后立即吸收光谱的在黑暗中添加HA的（照明时间，吨= 0）。
使用截止滤波器（Y-52）和一吸热滤波器（HAF-50S-50H），照射光的样品λ >从氙气灯1分钟500纳米（吨= 1分钟），然后测量又是频谱。
计算光照前后的光谱差异。
光照时间是在延长一几何级数的方式（吨= 2，4，8，16，32分钟，等等。）; 重复步骤 c 和 d，直到视紫质的漂白信号完全饱和。
CALCULAT È视紫红质（的摩尔消光系数ε从漂白视紫红质的吸收之间所产生的视网膜肟（之比）ε = 33600中号-1厘米-1在360nm）（沙尔夫等人。，1992）。通过将漂白视紫质的吸光度的绝对值除以ε，计算在大肠杆菌细胞中表达的视紫质的摩尔量。

数据分析

当比较ACTIV两者均的不同的蛋白质，包括突变体，正常化每个迹线到加入HCl后150秒的pH变化，如图小号TEP小号B10E一个第二B10的F“程序”，和蛋白表达的作为量在所示小号的TEP C2“程序”。
注意：由于responsiv eness大肠杆菌悬浮液的pH变化而变化中测量小号由于不可控的缓冲作用的细胞中，有必要的痕迹正常化至pH值变化为盐酸已知量。

笔记

通过改变测量中使用的盐的类型，可以评估各种离子种类的传输能力，例如 KCl、CsCl、NaNO 3和 Na 2 SO 4 。

食谱

2× YT 培养基
成分
浓度（克/升）
胰蛋白胨
16
酵母抽提物
10
氯化钠
5
将所有组分溶解在超纯水中并调节体积。
分配115米升介质到300 -米升烧瓶和顶部用硅酮塞子。
在 121°C 下高压灭菌培养基 20 分钟。
让烧瓶冷却。
50毫克/米升一mpicillin股票小号olution
10米添加升超纯水至0.5g氨苄青霉素粉末和完全溶解。
使用 0.2 - μm 孔过滤器对溶液进行消毒。
分装在1M的体积的溶液升中以无菌1.5 -米升管。
将库存储存在− 20°C。
30mM的CCCP股票溶液
将 16.3 ml DMSO添加到 100 mg CCCP 粉末中并完全溶解。
分配溶液作为100 - μ升等分试样在1.5 -米升管。
存放股票小号olutions在- 20℃。
的2M ħ ydroxylamine股
将 13.898 g 盐酸羟胺溶解在超纯水中。
调整吨他pH至8，用NaOH和调整音量至100μm升用超纯水。
分配溶液1 -米升无菌1.5等分试样-米升管。
存放股票的解决方案在- 20℃。
漂白缓冲液
成分
浓度 (mM)
氯化钠
133
Na 2 HPO 4
66
将所有组分溶解在超纯水中。
用 HCl 将 pH 值调至 8，并用超纯水将体积调至 100 ml 。
将缓冲液转移到玻璃螺旋盖瓶中，并在室温下储存。

致谢

这项工作得到了日本科学促进会 (JSPS) 对 KI (KAKENHI 授权号 JP17H03007、JP20K21383 和 JP20H05758) 和香港 (KAKENHI 授权号 JP18H03986) 的资助；CREST ，日本科学技术振兴机构（JST）转香港（JPMJCR1753）；和 PRESTO ，JST 到 MK (JPMJPR1903)。该协议是广告一个从我们原来的研究论文PTED （井上等人。，2020 ）。

参考

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