材料和试剂

塑料移液管（一次性，5 ml，切尖进行组织操作）
针（ENTO SPHINX sro，03.15-Minutens 白色，03.20-Minutens 白色）
胰岛素注射器（BD，Ultra-Fine ® ，目录号：328421）
盖玻片小号
4％多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
脱脂奶粉（Valio）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：V 900502-100ML）
Glycer醇（Sigma-Aldrich公司，目录号：G5516-500ml）
R at anti-mouse PECAM-1（BD Pharmi n gen，目录号：553370）
ģ燕麦抗小鼠/大鼠TIE2（R ＆d，目录号：AF76 2 ）
ģ燕麦抗小鼠的EphB4（R ＆d，目录号：AF446 ）
Cy3-共轭抗小鼠αSMA（Sigma-Aldrich，目录号：C6198）
Alexa Fluor 488 -偶联二抗（Invitrogen，目录号：A-21208）
Cy3-结合的二抗y （杰克逊，目录号：705-165-147）
Cy 5-缀合的二级抗体y （杰克逊，目录号：705-175-147）
他莫昔芬（Sigma-Aldrich，目录号：T5648-5G）
硅橡胶（SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit）
磷酸盐-缓冲盐水（PBS），pH 7.4（见食谱）
PBS-TX（见食谱）
50％glycer醇（见配方）

设备

共聚焦激光扫描显微镜（奥林巴斯，型号：FluoView）
Fluorescen CE立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZX16 ）
解剖剪（医用剪刀; 66视觉科技有限公司，目录号：54002，直尖端100毫米; Vannas囊剪刀：苏州明仁中号edical甲pparatus和我nstruments有限公司，目录号：MR-S302A，尖头， 16 毫米刀片）
S立体显微镜（Motic，目录号：SMZ168 系列，放大倍数范围：7.5-50 × ）
微-钳（上海医疗器械集团有限公司，目录号：WA3040，14厘米直，头宽0.3mm）的

小号oftware

FV-ASW 查看器 3.0 或 4.2a

程序

一代泰克-有针对性的小鼠模型在静脉皮肤及肠系膜分析的萌芽阶段。该协议基于 Chu等人的论文。（2016 年）。
准备小鼠胚胎。P花边一个雄性小鼠（Tek的+/- ; UBC-CreERT2 ，≥ 2一个月小号旧）和两个雌性小鼠（Tek的FLOX / FLOX ，≥ 2一个月小号旧）转换成用于配合在下午晚些时候18:00左右的保持架. 检查女性乞伏aginal塞在清晨以下的天（8:00左右）。如果雌性小鼠怀孕,则考虑到阴道塞存在的当天中午作为胚胎天 0.5 (E0.5)来估计胚胎阶段。
诱导基因缺失。使用小号unflower籽油（粮财富）作为稀释剂为他莫昔芬的制备（他莫昔芬游离碱，10毫克/毫升）。执行我的ntraperitoneal注射吨amoxifen溶液（100微升，10毫克/毫升）从E12.5至E14.5 （图1A）。
在 E17.5 (胚胎日 17.5)处通过颈椎脱位对怀孕的女性实施安乐死, 并将鼠标放在解剖板上。使用别针将鼠标的脚连接到板上，并用 75% 乙醇充分浸泡毛皮。
使皮肤的伤口，并用剪刀腹壁，露出腹腔并剖析了用剪刀子宫。
通过去除子宫肌肉层，用细镊子拉出胚胎外膜，并在解剖显微镜下去除胎盘，在冰冷的 PBS 中分离胚胎。
切断的尖˚F尾部的所述安柏瑞OS进行基因分型。
剥开的带眼科剪皮肤和修复皮肤组织中，以含有机硅橡胶6孔板使用细针晶（图1B ）。
打开胚胎的腹部。切小肠足够长的片段，以形成一个环，以保持所述肠系膜完整血管可视化。用细针将肠道固定在含有硅橡胶的 6 孔板上（图 2A ）。
用 4% 多聚甲醛 (PFA) 在 4 °C或在冰上固定组织2 小时。洗3次，用PBS溶液用于每次5分钟。
用含有 3% 脱脂奶粉的 PBS-TX 溶液在 4 °C下封闭组织 6-8 小时，并在轨道振动筛上轻轻搅拌。
取出封闭液，用一抗（PECAM-1、αSMA、TIE2 ；根据制造商的建议稀释）在封闭液（总体积：1 ml ）中孵育组织，在定轨振荡器上轻轻搅拌，4°C 过夜。
洗组织用PBS-TX 5次为20分钟的每个。
在 PBS-TX 溶液（稀释1:500）中用二级抗体（Alexa Fluor 488，Cy 5偶联二级抗体）孵育组织，在 4 °C 下在轨道振荡器上轻轻搅拌过夜。
剪掉多余的组织。转移修整皮肤在载玻片上，加入50滴％glycer醇，对花边盖玻片并密封与指甲抛光的边缘。对于肠的分析，修整肠直接转印到一个盖玻片，并保持在解剖显微镜下完全拉伸肠系膜。通过加入50％glycer滴避免组织的干燥醇。
分析b一个下100d中血管共聚焦激光扫描显微镜（Olympus Fluoview共）和获取并处理图像用的FV-ASW查看器3.0 /4.2a软件（图小号1 c ^和图2乙）。

图1. d isruption皮肤静脉发展以下Tek的缺失。(A) 他莫昔芬腹腔给药和分析方案。(B) 图显示为分析而解剖的胚胎背侧皮肤区域(虚线)。（C）的背部皮肤血管通过分析整个安装免疫染色的PECAM-1（绿色），αSMA（红色），TIE2（蓝色）在泰克- / iUCKO （Tek公司FLOX / - ; UBC-CreERT2 ，泰克iUCKO ）和对照（Tek Flox/+ ；UBC-CreERT2 ）小鼠。请注意，Tek缺失已通过Tek iUCKO小鼠的免疫染色分析得到证实。箭头表示动脉，箭头表示静脉。比例尺：100 μ在C.米

图2. Tek基因敲除小鼠肠系膜中动脉和静脉的M排列。（A）笔他吨amoxifen管理和分析方案我S IN图1描述URE 1A。图显示了通过使用细针固定在含有硅橡胶的 6 孔板中，肠道的解剖和进一步分析的准备。(B) 通过对Tek iUCKO和对照小鼠中的PECAM-1（绿色）、αSMA（红色）和 TIE2（蓝色）进行整体免疫染色来分析肠系膜血管。箭头表示动脉，箭头表示静脉。比例尺：B 中的100 μ m。

中产生一个泰克-视网膜静脉分析针对小鼠模型在对新生儿阶段
：注d的issection的根据方案进行视网膜描述由Pitulescu等。（2010 年）。
30-50微升他莫昔芬溶液施用（他莫昔芬游离碱，2毫克/毫升在种子油）通过胃内注射（胰岛素注射器，BD超细® ）到新生小鼠每日从1日龄到4（P1-4）（图 3A) 。
Ë uthanize的颈椎脱位的小鼠在P 21。
将小鼠的眼球s解剖到 2 ml 管中，并将眼球s固定在冰上的 4% PFA 中 2 小时。
制备的通过除去角膜，巩膜，脉络膜，颜料层视网膜，在解剖显微镜下，并从在冷PBS中的眼透镜。
在分离透明血管后, 做四个径向切口, 将视网膜分成四个象限(图 3B) 。
转移视网膜成一个1.5毫升试管中，并洗涤3次，用PBS对1每次5分钟。
完全去除 PBS 并在 PBS-TX 溶液中用 3% 脱脂奶粉在 4 °C 下在轨道振荡器上轻轻搅拌一夜阻断视网膜。
卸下集团王溶液孵育所述视网膜与伯（PECAM-1，EphB4的）抗体和第二抗体在该适当的浓度小号在4 12-16小时℃下用温和搅拌在轨道振荡器上。
注：Ť这里是初级和次级抗体孵育之间的洗涤步骤。
洗的用PBS-TX视网膜5次为20分钟的每个。
转移的视网膜上到一个载玻片具有几50％glycer滴醇以及盖与盖滑动。
分析的一个下视网膜血管共聚焦激光扫描显微镜（Olympus Fluoview共）和获取和处理图像如上所述（图3 Ç ）。

图3.对于视网膜静脉相关的血管绒头的mation小号以下TIE2衰减。(A) 他莫昔芬胃内给药和分析方案。（B）小鼠的眼球用收集的角膜，巩膜，脉络膜，和颜料层除去。通过四个径向切口切割视网膜以进行进一步的免疫组织化学分析。（C）视网膜血管的分析PECAM-1（绿色）和EphB4的（红色）在泰克iUCKO和对照组小鼠在P21。请注意，TIE2 不足会导致沿视网膜静脉形成血管簇。箭头表示动脉，箭头表示静脉。比例尺：100 μ在C.米

数据分析

在该协议中，在共聚焦激光扫描显微镜 (Olympus FluoView) 下分析样品，并使用FV-ASW Viewer 3.0 或 4.2a 软件获取和处理图像。使用 Image-Pro Plus 6.0 软件对不包含在本协议中的视网膜血管化区域和血管密度进行量化，如原始论文 ( Chu et al. , 2016 ) 中所述。我们已经注意到的血管表型Tek的突变体取决于对酶Cre DELET ê使用河例如，当在产后研究中使用VEcad-CreERT2诱导Tek缺失时（Okabe et al. , 2014 ），我们发现大多数Tek敲除小鼠（Tek Flox/- ；VEcad-CreERT2 ，Tek iECKO ）在之前死亡P21（产后第 21 天，数据未显示）。尽管在Tek iECKO小鼠中仍然可以检测到Tie2 mRNA ，这可能是由于 TIE2 在其他细胞中的表达，包括造血细胞，而在 ECs 中几乎检测不到 TIE2（数据未显示）。然而，几乎所有的泰克iUCKO在这项研究中产生的小鼠存活甚至虽然他们的体重略有升流儿比他们的同窝（楚等人。年，2016年）。通过定量 PCR 分析剩余的Tie2转录本。在这项研究中，水平的Tie2的mRNA为0.14±0.05 （P7，在肺中N = 7）小号的泰克iUCKO小鼠与比较1.0±0.16在这些的对照小鼠（P7，N = 3）。
我ñ此外，注意到值得Ÿ说的他莫昔芬的管理和组织分析的时间点应取决于血管表型定义如下诱导的基因缺失的Nd加以解决的具体问题。例如, 在本协议中, 他莫昔芬对怀孕小鼠的给药是通过从 E12.5 到 E14.5 的腹腔注射进行的, 因为早期诱导Tek删除 (例如,从E10.5 ) 将导致E17.5 的胚胎致死. 关于时间点选择的详细信息也在Chu等人中进行了描述。（2016）（图URE小号1和3）。

笔记

他莫昔芬对光敏感。保持牛逼amoxifen避光。
所有孵化步骤SH乌尔德轻轻摇动轨道振荡器上进行。
将皮肤与胚胎分离时避免肌肉附着。
在共聚焦成像过程中保持肠系膜样品湿润。
隔离眼球年代后立即老鼠已经ê uthanize d 。在解剖过程中避免用移液器或其他仪器的尖端接触视网膜，以防止组织损伤。

食谱

磷酸盐-缓冲盐水 (PBS)，pH 7.4
10 mM Na 2 HPO 4
1.8 mM KH 2 PO 4
137 毫米氯化钠
2.7 毫米氯化钾
PBS-TX
0.3% 海卫 X-100 ; PBS，pH 7.4
5 0％glycer醇
50％glycer醇; PBS，pH 7.4

致谢

我们感谢苏州大学动物设施的工作人员提供技术援助。本工作得到科技部资助(YFA0801100)、放射医学与防护国家重点实验室项目(No. GZN120 20 02 ) 、国家自然科学基金(31970768、81770489、 91739304)、江苏省高等学校自然科学基金重点项目(18KJA180012)、研究生创新计划( KYCX19_1979 ) 、江苏省高等学校重点学科建设项目。该协议基于 Elife 上发表的原始论文（Chu et al ., 2016 ）。

利益争夺

作者没有要申报的财务或非财务竞争利益。

伦理

所有动物实验均按照苏州大学动物中心（# IACUC - 201611 ）的机构指南进行。

参考

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