材料和试剂

1.带透明盖的培养皿（Fisherbrand TM ，目录号：FB0875712）
2.牙签（扁平，消毒）
3.载玻片和盖玻片（例如，Fisherbrand，目录号：12-550-A3 和 12-542A）
4.酵母菌株
互补交配型的供体和受体菌株；MAT a和MAT α 。
其中一个，理想的供体，必须包含在kar1-1突变等位基因。
独特的营养缺陷型或抗生素标记物，可区分供体和受体菌株，显着简化细胞诱导剂的分离和确认。
使用中所描述的协议plasmiduction小号下面挠度d，供体和受体菌株应共享将由质粒补充至少一种营养缺陷型标记。或者，可以使用赋予抗生素抗性（例如 G418 抗性）的质粒。
一个附加的酵母菌株（ř eferred一般地贯穿该协议作为“测试菌株，”例如BY4741，BY4742，或一个其它喜爱的应变;它必须满足下列的条件）。
必须是相对于您的受体菌株的相反交配类型。
应该是KAR1基因的野生型。
应包括与您的受体菌株相关的独特营养缺陷标记，以促进二倍体选择。
使用该菌株筛选荧光聚集体的细胞诱导剂（如步骤B4a 中所述）需要两个额外的要求。首先，相对于您的受体菌株，该菌株必须具有至少一个营养缺陷型标记，这有助于维持确认您的细胞诱导剂的朊病毒状态所需的质粒（如下面的步骤B4a 中所述）。例如，如果使用URA3质粒，您的受体和测试菌株都必须是ura3。其次，该菌株应不含所有朊病毒，但至少必须不含被细胞诱导的朊病毒。如果该测试菌株的朊病毒状态不确定，请使用盐酸胍治愈该菌株（如以下步骤B4b 中所述）。无论您是否怀疑测试菌株不含朊病毒还是自己治愈了该菌株，谨慎的做法是通过荧光显微镜观察细胞来验证该菌株是否不含朊病毒（步骤B4a，重点放在第 i 部分，和v.-vii. 仅，因为不需要交配）。如果正确治愈，这些细胞将在步骤B4a 中描述的条件下具有漫射荧光。
注意：Ť ħ是协议主要侧重于HSP104依赖性朊病毒和因此描述用于固化盐酸胍法这些朊病毒。如果正在使用的是朊病毒工作需要一种替代的固化方法，如[GAR + ]或[史矛革+ ] ，那么你的测试菌株的固化应该使用，而不是在步骤B4B描述你的朊病毒特定的固化方法来完成。
5.用于朊病毒鉴定或质粒抽吸的质粒
为了检测[ PSI + ]使用荧光显微镜，质粒用荧光标记的Sup35蛋白（例如。，pCUP1-Sup35-GFP，与URA3 ，Addgene.org ＃1087）
为了检测[ PIN + ]使用荧光显微镜，用质粒荧光标记蛋白RNQ1 （例如。，pCUP1-RNQ1-YFP，与URA3 ，Addgene.org ＃15596）
提供可选抗生素或营养缺陷型选择的质粒（用于质粒抽吸方案）。
6.培养基/琼脂板
用于固体培养基的脱水琼脂（Bacto TM ，目录号：214030 ；2 kg，或更少量）
YPD（成分，下面单独部分中的食谱）
酵母提取物，低尘（LD）（Gibco TM ，Difco TM ，目录号：210933 ）
蛋白胨（Gibco TM ，Bacto TM ，目录号：211677 ）
无水葡萄糖，2 kg （BD TM Difco TM ，目录号：215510或更小数量）
用于合成 Dropout 板的组件
不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮基（Difco TM ，目录号：233520 ）
硫酸铵，99.5%，用于分析（ACROS Organics TM ，目录号：205870010 ）
辍学粉营养素（˚F或一个详尽的清单，其中包括相对比例看谢尔曼，2002年）
1)氨基酸：L-精氨酸-HCl、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸单-HCl、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸（Sigma-Aldrich）
2）腺嘌呤半硫酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：A-9126 ）
3）尿嘧啶（Sigma-Aldrich，目录号：U-0750 ）
4)一些酵母菌株可能具有额外的独特营养缺陷标记并需要相应的营养物(Sherman, 2002) 。
放线菌酮溶液（详细协议B仅见ř ecipes）
放线菌酮（Sigma，目录号：C7698）
DMSO（Sigma，目录号：D8418）
溴化乙锭（如果受体菌株需要为适当的细胞诱导策略提供rho 0 （Sigma，目录号：E8751）
甘油（Sigma，目录号：G-5516）
可能是一种或多种酵母抗生素，取决于细胞诱导剂的选择策略。两种常见的酵母抗生素遗传霉素（Sigma公司，目录号：A-1720 ; Winzeler等人，1999）和诺尔丝菌素（GoldBio，目录号：Ñ -500-1; Haarer 。等人，2007）。
7.用于传播酵母细胞的玻璃珠（Zymo Research ，目录号：S1001 ）
8.酵母转化试剂(Gietz, 2014)
ssDNA（Sigma ，目录号：D7656）
PEG 3350（Sigma ，目录号：88276）
Tris（C 4 H 11 NO 3 ，GoldBio ，目录号：T-400-1）
EDTA（EMD ，目录号：EX0539-1）
醋酸锂（Sigma ，目录号：L4158）
9.盐酸胍（Sigma ，目录号：G4505）
10.硫酸铜（Sigma ，目录号：C1297）
11.媒体（参见ř ecipes）
12. 10 mg/ml 放线菌酮原液（见配方）
13. YPD（或YPGlycerol）与10个平板μ微克/毫升放线菌酮（见ř ecipes）
14.为2.5mg / ml溴化乙锭（EtBr的;参见ř ecipes）
15. YPD平板用25 μ微克/毫升溴化乙啶（见ř ecipes）
16. 5盐酸胍（盐酸胍;参见ř ecipes）
17.用5mM盐酸胍的YPD平板上（参见ř ecipes）
18. SGlycerol选择性板（参见ř ecipes）

设备

荧光显微镜（通过荧光标签监测朊病毒的存在）
复制品接种仪/平绒平方（Fisher Scientific公司，Ç atalog Ñ棕土：09-718-1 ）
高压釜
培养箱（30 °C）
锥形瓶（1 L 用于培养基制备）
（所有设备均可从任何标准科学供应经销商处获得；不需要特定品牌/型号）

程序

选择细胞诱导策略
在尝试细胞诱导之前，重要的是要考虑您的供体和受体菌株的基因型和表型，以及程序中的后续细胞（见图 1），以确定哪种细胞诱导策略最有效。目的是选择对所述cytoductants，以及针对许多其它细胞类型如可能的，因为配合是从来没有100％，并且10-16ħ交配期后图1中所示的所有细胞类型将并存。放线菌酮抗性/ rho 0策略，其中受体菌株具有放线菌酮抗性和rho 0 ，是用于朊病毒细胞诱导的最常用策略。然而，如果受体菌株具有缓慢的生长表型或呼吸缺陷，则使这些菌株分别具有放线菌酮抗性或rho 0可能很困难。因此，我们提供了两种可以使用的替代策略：仅使用rho 0 的方法，或使用质粒进行选择（质粒诱导）。还应该承认，质粒抽吸过程可用于同时将朊病毒和质粒引入受体菌株，避免需要单独的交配步骤来引入验证朊病毒状态所需的质粒。表 2 总结了细胞诱导策略以及每种方法的优缺点。
版权所有 © 20 21作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。1
说明： logonew

表2 。三种细胞诱导策略

版权所有 © 20 21作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。1
说明： logonew

使用放线菌酮/ rho 0策略选择细胞诱导剂
菌株选择
供体菌株或受体菌株必须包含kar1突变，但当供体为kar1时，此协议效果最佳。
对于朊病毒的细胞诱导，供体菌株必须含有朊病毒（例如高 [ PIN + ] 或弱 [ PSI + ]）。
绘制供者和受者的完整基因型信息（图 1）。
示例供体：MAT a , kar1-1, his3, leu2, ura2 , URA3, LYS9, TRP1, high [ PIN + ]
示例受体：MAT α 、KAR1、his3-1、LEU2、URA2、ura3-14、lys9 Δ 、trp1-1 ，无朊病毒
接受者必须能够承受自发性放线菌酮抗性和线粒体 DNA ( rho 0 )丢失的选择。
注意：对生长缓慢或温度敏感的菌株使用此策略可能不可行。
准备受体菌株
产生抗放线菌酮的隐性菌株。
在几个 YPD 板上生长所需的受体菌株，以产生活跃分裂细胞的厚厚草坪。在 30 °C 下孵育板过夜。
注意：这片厚厚的草坪最好通过使用无菌玻璃珠在几个 YPD 板上的每一个上镀 150 μl的 10 7细胞悬浮液来实现。
复制品板（小号EE图2为复制平板的图）单元中的每个独立草坪到含有10新鲜的YPD平板μ微克/毫升放线菌酮，并在孵育室温（RT ）为长达两周直至罕见菌落出现。
注意：为了避免干燥，确保板是大约厚6-7毫米，并且温育是在一个“湿度室”做含在塑料容器中浸泡几个纸巾用一个透气或未密封盖子。相对于直接将大量对数期细胞培养物直接镀到 YPD + 放线菌酮板上，使用来自活跃分裂细胞的厚草坪的复制电镀大大增加了获得放线菌酮抗性细胞的可能性。

图 2. 复制电镀图。A. 复制板需要无菌天鹅绒、复制板和无菌板。本协议中其他地方使用复制电镀类似于此处显示的过程，在这些位置标明了关键差异。B. 将细胞培养成厚厚的草坪（以红色酵母菌株为例）。还需要一个浓稠的新鲜 YPD+放线菌酮（图中缩写为 YPD+Cyh）板。C. 厚厚的细胞草坪将被放置在无菌天鹅绒上，并在板顶部轻轻按压 (D)。E. 将新鲜的 YPD+Cyh 板放在天鹅绒上，轻轻按压板顶部将转移细胞 (F)。

在放线菌酮平板上生长的菌落应该代表罕见的突变。
通过在新的 YPD+放线菌酮板上重新划线菌落来验证放线菌酮的抗性。在30 °C 下孵育板2-3 天。在此验证步骤中菌落发育所需的时间应与通常观察到的受体菌株相当。
为了验证放线菌酮抗性突变是隐性的，必须在二倍体状态下对突变进行评分。为了产生二倍体，你的兴趣和应变测试仪应变（见材料与试剂，4 。ē ）必须新鲜生长。在单独的 YPD 板上，使用无菌牙签将每种菌株的薄膜涂抹成 2 × 2 厘米的“贴片”。在 30 °C 下过夜孵育板。要使菌株交配，请使用无菌牙签从每种菌株中挑取少量，然后在新鲜的 YPD 板上混合成一个补丁。在 30 °C 下过夜孵育板。为了选择二倍体，将单个菌落的交配细胞划到平板上，该平板将针对每个单倍体进行选择，但保持二倍体。使用如上定义的示例受体菌株和 BY4741（Mat a 、his3、leu2、ura3、met15 ）作为测试者，可以在 SD-Leu 上选择二倍体。在 30 °C 下孵育板2-3 天，直到单个菌落发育。为了对放线菌酮抗性进行评分，将几个菌落贴在 YPD+放线菌酮与 YPD 上。二倍体应该在 YPD 上生长，而不是在 YPD+放线菌酮上生长，因为隐性突变不会赋予二倍体抗性。
生成rho 0受体细胞
通过在含有25 μ g/ml 溴化乙锭的YPD 平板上划线获得单个菌落，培养受体菌株，优选在使菌株对放线菌酮具有抗性之后。溴化乙锭是一种诱变剂和潜在的致癌物，因此请戴上手套处理板。在 30 °C 下孵育板3-5 天。
Ñ OTE ：溴化乙锭治疗会诱导线粒体DNA的损失，和菌落将是小的。
通过在 YPD 和 YPGlycerol 上划线来验证菌株是否为rho 0 。YPD 上的菌落会很小或“娇小”，并且不会在 YPGlycerol 上生长。

细胞诱导剂的交配和选择
使用无菌牙签，传播放线菌酮抗性RHO 0受体菌株在YPD平板的一个或多个长的水平行，如在30中所示在图3中孵育℃下1-2天。
注意：受体菌株生长非常缓慢；最好做厚厚的补丁或生长两天。

图3.使用交配策略的示意图RHO 0 ，放线菌酮抗性受体菌株。供体菌株以一条或多条垂直线分布在平板上，而受体菌株以一条或多条水平线分布在单独的平板上。生长后，使用无菌平绒将板供体菌株复制到新鲜的 YPD 板上。使用第二个无菌平绒在捐赠者身上以纵横交错的方式复制受体菌株。允许菌株交配，然后将板复制到 YPGlycerol + 放线菌酮板上。只有细胞诱导剂能够生长并出现在供体和受体交配发生的交叉点。菌落通常在生长 7 天后出现。

散布在另一个YPD平板的一个或多个长的垂直线的供体菌株的薄膜，如在30中所示在图3中孵育℃下过夜。
使用复制板和无菌平绒，将供体菌株涂抹在新鲜的 YPD 板上。
使用新鲜的无菌平绒，在供体菌株上以纵横交错的方式覆盖受体菌株，如图 3 所示。
在 30 °C 下孵育板约 10-16 小时。
可选：可以在大约 6 小时内对“shmoos”或定向投影形态进行显微镜监测，以提供菌株成功交配的积极指标；有关 shmoo 形态学的更多详细信息，请参阅 Merlini 等人。( 2013) 。
将交配的细胞复制到 YPGlycerol 10 μ g/ml放线菌酮板上，并在30 °C下孵育。
注意：由于选择压力，菌落出现通常需要长达 7 天的时间，如上述步骤B2a ii 中所述。
通过复制电镀或在选择性培养基上划线来验证菌落是否为细胞诱导剂，以确认受体特异性营养缺陷型标记的存在，以及在 YPGlycerol 板上生长的能力。使用上面提供的和图 1 中描述的示例，细胞诱导剂将在 YPGlycerol、YPD+放线菌酮和 SD-Leu 上生长，但不会在 SD-Lys、SD-Ura 或 SD-Trp 上生长。
确认朊病毒的存在
朊病毒的存在应该通过两种不同的方式来确认：荧光聚集体的存在和朊病毒在盐酸胍上生长造成的损失。这些确认可以同时进行。
通过荧光聚集体确定朊病毒的存在。
变换您测试菌株（材料和试剂，4 。ë ，满足所有条件i.-iv.）使用标准转化方案（Gietz，2014）与质粒编码朊病毒域或全长朊病毒蛋白，融合到条件启动子下的荧光标记（GFP、RFP等）。
1)可以通过 addgene.org 获得几种质粒，例如 pCup1-Sup35-GFP 和 pCUP1-Rnq1-YFP ；有关质粒编号，请参阅材料和试剂5 。
2)出于本示例的目的，我们将使用 BY4741（Mat a 、his3、leu2、ura3、met15 ）的无朊病毒版本作为测试菌株和包含URA3选择标记的质粒。此外，BY4741 已被证明带有 [ PIN + ] 变体（Manogaran等，2010），因此用作测试器时，它在含有盐酸胍的 YPD 上治愈了所有朊病毒。
通过生成活跃生长的细胞的新鲜板来准备细胞诱导剂和转化的测试菌株进行交配。使用无菌牙签在新鲜的质粒选择板（如 SD-Ura）上将含有测试细胞的质粒薄膜涂成 2 × 2 厘米的“贴片”。对 YPD 板上的受体应变做同样的事情。在 30 °C 下孵育板过夜。
在新鲜的 YPD 板上，使用无菌牙签将接受者和测试者菌株混合在一个补丁中。在 30 °C 下过夜孵育板。
交配后，在 medi a上为单个菌落划线细胞，该菌落选择二倍体和质粒。使用示例受体菌株以及携带URA3可选择质粒的 BY4741 测试仪，可以在 SD-Leu-Ura 上对细胞进行划线，以选择保留质粒的二倍体。在 30 °C 下孵育2-3 天，直到出现单个菌落。
挑从选择性平板的单菌落并生长在30 ℃下在液体培养基中，将保持该质粒过夜（É 。克，SD浦实例中所给出）。作为对照，生长含有质粒（从单倍体测试器的液体培养小号TEP B4A我上文）。这将重复确认该测试菌株不携带朊病毒和提供并联生长为视觉对照细胞时得分cytoductants用于荧光聚集体小号TEP B4A VII。以下。
要通过诱导荧光标记的朊病毒蛋白的表达CUP1启动子，添加硫酸铜50的终浓度μ M，并且生长在30 ℃下额外4-6小时。
使用荧光显微镜观察细胞的荧光聚集体（图 4）。
注：Ç ELLS表达质粒但不包含朊病毒，如你的单倍体测试菌株控制，将具有弥散荧光（图4）。

图 4. 具有漫射荧光的细胞的荧光显微镜图像与指示朊病毒存在的聚集体。Sup35-GFP 或 Rnq1-GFP 在固化菌株中的瞬时表达表现出漫射荧光，类似于左侧的图像。在朊病毒存在的情况下，观察到荧光斑点。右图显示了 BY4741 菌株中 Rnq1-GFP 的瞬时表达，具有高 [ PIN + ] [来自Dorweiler等人。(2020) ] 。

盐酸胍治疗Hsp104 依赖的朊病毒。
注意：如果您使用的朊病毒需要另一种固化方法，例如 [GAR + ] 或 [SMAUG + ]，则必须使用该固化方法而不是此处描述的方法。查阅描述您感兴趣的朊病毒的文献以确定要使用的适当固化方法。
在含有 5 mM 盐酸胍的 YPD 培养基上修补单倍体 cytoductants（而不是步骤B4a 中生成的二倍体）。在30 °C 下孵育 1-2 天。
通过采取修补细胞并在新鲜的 YPD 5 mM 盐酸胍板上制作另一个补丁来重复。在30 °C 下孵育 1-2 天。
注意：虽然连续两次贴片通常会导致大多数细胞固化，但建议重复贴片总共 3 次。
使用新鲜牙签，在 YPD 板上划线细胞并在30 °C下孵育，直到出现单个菌落。
为了验证朊病毒的丢失，对荧光聚集体的存在进行评分（如步骤 B4a 中所述）。

使用rho 0策略选择细胞诱导剂
菌株选择
供体菌株或受体菌株必须包含kar1突变。
对于朊病毒的细胞诱导，供体菌株必须含有朊病毒（例如高 [ PIN + ] 或弱 [ PSI + ]）。
在细胞诱导方案/图表中绘制供体、受体和所有后续细胞的完整基因型信息（见图 1）。
示例供体：MAT a , kar1-1, his3, leu2, ura2 , URA3, LYS9, TRP1, high [ PIN + ] 。
示例受体：MAT α 、KAR1、his3-1、LEU2、URA2、ura3-14、lys9 Δ 、trp1-1 ，无朊病毒。
供体应与受体区别于 1 个或多个营养缺陷型或抗生素标记物（给出的示例中为leu2 ），以成功将细胞诱导剂与方案中的其他细胞区分开来。
接受者应变不能有呼吸缺陷（除非已经是rho 0 ）。
生成RHO 0受体细胞如上述小号TEP的B2B
细胞诱导剂的交配和选择
注：由于此策略提供了对异核体没有直接的选择，建议不要使用图3描述而是纵横交错方法，配合细胞将被划线以在单个菌落小号TEP C3 d。
通过生成活跃生长的细胞的新鲜板来准备细胞进行交配。使用无菌牙签在新鲜的 YPD 板上将一层供体细胞薄膜铺成 2 × 2 厘米的“补丁”。对另一个 YPD 板上的受体菌株做同样的事情。在 30 °C 下过夜孵育板。
注意：受体菌株生长缓慢，最好是修补更多的细胞进行生长。
在新鲜的 YPD 板上，使用无菌牙签将受体和供体菌株混合在一个补丁中。
在 30 °C 下孵育板约 10-16 小时。
注意小号：
如上述shmoos的存在可被验证小号TEP B3E 。
超出16个小时的菌株的交配产生小号一个占据整个培养异核，这可减少在获得cytoductants的频率的过量小号TEP C3以下即
在合成甘油 (SGlycerol) 板上对交配细胞进行条纹选择，以对抗供体菌株（使用示例 -leu 供体菌株，SGlycerol-Leu），并在 30 °C下孵育3-5 天，直到出现单个菌落。
挑选单个菌落并贴在新鲜的选择性 SGlycerol 板上（SGlycerol-Leu 例如供体）。在 30 °C 下孵育。
注意：建议至少选择 20 个菌落，因为在选择性 SGlycerol 板上同时存在异核和细胞诱导剂。选择菌落时，避免大菌落；这些大群体往往是异核。
为了筛选细胞诱导剂特异性标记，将S tep C3 e 中的平板贴片复制到适当的培养基上。这个过程类似于图2中所示的是，不同之处在于在图2D中所用的板将包含几个cytoductants（中制备的各个补丁小号TEP C3 ë ），和几个选择性平板将来自棉绒被顺序地印刷（图2F）。重要的是，标记所有复制板的方向，以确保每个独立的 cytoductant 的评分一致。细胞传导剂将是rho + 。因此，使用上面的例子，细胞诱导剂将在 YPGlycerol 和 SD-Leu 上生长，但不会在 SD-Lys、SD-Ura 或 SD-Trp 上生长。如果菌株在 SD-Ura 上生长，则它们是异核体。
确认朊病毒的存在
为了证实朊病毒的存在，跟随小号TEP B4。

使用质粒抽吸策略选择细胞诱导剂
菌株选择
供体菌株或受体菌株必须包含kar1突变。
对于朊病毒的细胞诱导，供体菌株必须含有朊病毒（例如高 [ PIN + ] 或弱 [ PSI + ]）。
在细胞诱导方案/图中绘制供体、受体和所有后续细胞的完整基因型信息（见图 1）。
示例供体：MAT a , kar1-1, his3, leu2, ura2 , URA3, LYS9, TRP1, high [ PIN + ] 。
示例受体：MAT α 、KAR1、his3-1、LEU2、URA2、ura3-14、lys9 Δ 、trp1-1 ，无朊病毒。
注：d onor和接收者必须共享至少一个营养缺陷型标记，使得两种菌株可以维持选择用于编码该特定标记的质粒（例如，克，在这个例子中HIS3）。虽然上述菌株都不能在缺乏尿嘧啶的培养基上生长，但 URA3 质粒只能补充受体菌株的这种缺陷。
准备供体菌株
使用标准转化方案(Gietz, 2014) ，用质粒转化供体菌株，该质粒也可以在受体中通过选择维持（在上面的示例中，它将是HIS3质粒）。
质粒的交配和选择
注：由于此策略提供了对异核体没有直接的选择，建议不要使用图3描述而是纵横交错方法，配合细胞将被划线以在单个菌落小号TEP D3 d 。
通过生成活跃生长的细胞的新鲜板来准备细胞进行交配。使用无菌牙签将含有供体细胞的质粒薄膜涂成 2 × 2 厘米的“补丁”，放在新鲜的质粒选择板上（如 SD-His）。对 YPD 板上的受体应变做同样的事情。在 30 °C 下过夜孵育板。
在新鲜的 YPD 板上，使用无菌牙签将受体和供体菌株混合在一个补丁中。
在 30 °C 下孵育板约 10-16 小时。
注意：如上述shmoos的存在可被验证小号TEP B3E。超出16小时的菌株的交配能导致质粒损失由于在不存在选择压力的，并且可以生成接管培养异核，这两者都可以降低在获得cytoductants的频率的比例过多小号TEP D3下面即
交配后，条细胞为一个单菌落上的媒体，对所述受体菌株和供体菌株进行选择。在上述情况下，因为除了受体菌株之外的所有菌株现在都包含一个HIS3质粒，并且供体菌株是 leu - ，因此可以在 SD-Leu-His 上对交配进行条纹。在 30 °C 下孵育2-3 天，直到出现单个菌落。
挑选单个菌落并贴在新鲜培养基上，再次针对供体和受体菌株进行选择。在 30 °C 下孵育。
注意：建议至少选择 20 个菌落，因为异核和细胞诱导剂都将出现在选择板上。选择菌落时，避免大菌落；这些大群体往往是异核。
为了筛选细胞诱导剂特异性标记物，将平板贴片复制到培养基上，提供阳性和阴性选择。这个过程类似于图2中所示的是，不同之处在于在图2D中所用的板将包含几个cytoductants（中制备的各个补丁小号TEP D3 e）和几个选择性平板将来自棉绒被顺序地印刷（图2F）。重要的是，标记所有复制板的方向，以确保每个独立的 cytoductant 的评分一致。使用上面提供的示例，连同 HIS3 质粒，细胞诱导剂将是 His +和 Leu + ，而在 SD-Ura 上生长的任何菌株都是异核体。因此，细胞诱导剂会在 SD-Leu 和 SD-His 上生长，但不会在 SD-Lys、SD-Ura 或 SD-Trp 上生长。
确认朊病毒的存在
为了证实朊病毒的存在，跟随小号TEP B4。
如果用于质粒抽吸的质粒携带荧光标记的朊病毒，则无需将细胞诱导剂与测试菌株（如步骤s B4a i-iv 中所述）配对，但立即进行筛选细胞诱导剂是否存在荧光聚集体（如所述）在步骤s B4a v-vii )。可以在 YPD+GuHCl 上进行朊病毒的提取（如步骤B4b 中所述）。然而，重要的是要认识到治愈也会导致质粒丢失。因此，随后通过荧光聚集体进行筛选可能需要随后选择仍然携带质粒的稀有细胞、转化或与携带质粒的测试菌株交配，以验证朊病毒聚集体的丢失（如步骤B4b iv 中所述）。另一种选择涉及在将保持质粒的合成介质上固化朊病毒，但请注意，这需要使用较低浓度的 GuHCl（3 mM 而不是 5），因此需要额外的通道才能成功固化。

数据分析

该细胞诱导方案的目的是在您感兴趣的遗传背景中生成含有朊病毒的细胞。这些细胞可用于您选择或设计的任意数量的下游实验。细胞诱导和质粒抽吸可用于确定基因突变体或某些朊病毒变体是否影响朊病毒维持。例如，引入的μ点[ PIN + ]变体cytoduced野生100％-型细胞，但不是在一些如实地传递ACT1突变体（Dorweiler等人，2020）。为了解释这种性质的实验，重要的是运行细胞诱导控制，其中包括很容易通过细胞诱导和野生型受体细胞传播的朊病毒。

食谱

媒体
所有基础培养基均按照 Sherman ( 2002)所述制备。
1 0 mg/ml放线菌酮原液（用于涉及放线菌酮抗性的细胞诱导）
在无菌的 15 ml 锥形管中混合以下物质：
20 mg 放线菌酮（***注意：剧毒，佩戴 PPE；在通风橱中称重以避免吸入灰尘。）
2 ml 100% DMSO（放线菌酮也可溶于乙醇，但需要更长的时间才能完全溶解）
充分混合直至放线菌酮完全溶解
注意：我们没有发现有必要对这种溶液进行过滤灭菌，但请注意，可选的灭菌需要一个兼容 DMSO 的过滤器。
用箔纸包裹管子并将剩余体积储存在 -20 °C 。
YPD（或 YPGlycerol）板与 10 μ g/ml 放线菌酮
将新鲜高压灭菌的 YPD（或 YPG）冷却至 ~50 °C 。
添加放线菌酮至终浓度为 10 μ g/ml（例如，每 500 ml YPD 加入 0.5 ml放线菌酮）。
在倒入盘子之前彻底但小心地混合。
2.5 mg/ml 溴化乙锭原液（用于产生rho 0菌株）
在无菌的 15 ml 锥形管中混合以下物质：
25 mg 溴化乙锭粉末（***注意：诱变剂）
10 毫升无菌 dH 2 O
剧烈涡旋直至 EtBr 粉末溶解。
为了储存剩余的体积，用箔纸包裹管子并放置在 4 °C 。
带有 25 μ g/ml EtBr 的YPD 板（两个板，因为这对于大多数情况来说已经足够了）
在一次性，无菌的50毫升锥形管，结合500 μ的EtBr的2.5升毫克/毫升的储备溶液和50毫升YPD琼脂+从新鲜高压灭菌批次（剩余可用于倾标准YPD平板）。
2个无菌之间分配P ETRI板。
5 M 盐酸胍
对于 10 ml 5M 盐酸胍溶液，将 4.78 g 盐酸胍溶解在 10 ml 无菌蒸馏水中。
使用0.2过滤消毒μ微米的过滤器。
将未使用的溶液储存在 4 °C 。
含有盐酸胍 (5 mM) 的YPD 板
将新鲜高压灭菌的 YPD 冷却至~50 °C 。
盐酸胍添加到一个5mM的终浓度（例如，将0.5ml每500ml YPD的5M盐酸胍）。
在倒入盘子之前彻底但小心地混合。
SGlycerol 选择性板（用于 600 ml – 大约 16-18 个板）
1克酵母氮基没有一个蓑一个的CID和一个mmonium小号ulfate
3克硫酸铵
18 毫升甘油
12 克琼脂
所有营养，如在材料和试剂描述6个.c.iii。，除了那些其提供所需的选择。
600 毫升 dH 2 O
高压灭菌，冷却，倒板。

致谢

作者非常感谢 Hannah Buchholz、Claire Radtke，尤其是 Adam Knier 对本协议的有益评论。此外，我们要感谢匿名审稿人的有益评论。这项工作得到了 NIH 授予 ALM GM109336 的支持该协议描述了Dorweiler等人使用的技术。(2020) ，但它也代表了众多研究人员利用酵母核配突变体kar1-1 40 多年取得的进步。上面的背景部分引用了这些进步的许多例子。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

这里描述的协议都不需要使用人类或动物受试者。

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