材料和试剂

10毫升血清移液管（干ç ELL Ť echnologies，目录号：38004）
70 µm 细胞过滤器（Corning，目录号：431751）
10 cm培养皿（Eppendorf，目录号：30702118）
FACS管（干ç ELL Ť echnologies，目录号：38007）
50毫升Falcon管（热˚F isher，目录号：10788561）
15毫升Falcon管（干ç ELL Ť echnologies，目录号：05860）
超低附着培养板（Corning，目录号：CLS3471-24EA）
96 - 孔盘（Eppendorf，目录号：EP0030730011-80EA）
Kimwipes（Kimberly-Clark Kimtech Science，目录号：34155 ）
C57BL6 小鼠（Jackson L aboratories）
乙醇（Sigma - Aldrich，目录号：T4049 02870）
胎牛血清（Gibco，目录号：10270106）
磷酸缓冲液（PBS）（CSH P rotocols，http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec8247）
胰蛋白酶溶液（Sigma - Aldrich，目录号：T4049）
不含钙的 E 培养基（Nowak和Fuchs，2009 年）
7-Aminoactin omycin D（7-AAD）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A1310）
FITC 同种型对照（Thermo Fisher Scientific，目录号：GM4992）
PE-Cy7同种型对照（Thermo Fisher Scientific，目录号：25-4714-80）
PE同种型对照（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-4714-42）
FITC 抗 Vγ3 TCR（Thermo Fisher Scientific，目录号：MHGD01）
PE-Cy7抗CD3ε（Thermo Fisher Scientific，目录号：25-0038-42）
PE抗γδTCR（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-9959-42）
Concanavalin A（Sigma - Aldrich，目录号：C5275）
谷氨酰胺（Sigma - Aldrich，目录号：G8540）
HEPES（Sigma - Aldrich，目录号：H3375-25G）
丙酮酸钠（Himedia，目录号：PCT0503）
NEAA（默克，目录号：7145 M7145）
青霉素-链霉素（Merck，目录号：P4333）
β-巯基乙醇（ME）（Sigma - Aldrich，目录号：M6250）
重组人IL-2（促销ç ELL，目录号：61241）
庆大霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15750078）
RPMI-1640 培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11875101）
小鼠IL-17的Quantikine ELISA试剂盒（R＆d小号ystems，目录号：M1700）
FGF7（Sigma - Aldrich，目录号：RAB0188）
TNFα（Thermo Fisher Scientific，目录号：KHC3011）
IFN-γ（Thermo Fisher Scientific，目录号：RAB0223）
IL-23（Thermo Fisher Scientific，目录号：PHC9321）
重组IL-1β（10纳克/毫升）（R＆d小号ystems，目录号：201-LB-005 / CF）
DMEM/F-12，粉末（Gibco，目录号：12500062）
碳酸氢钠（Gibco，目录号：S5761）
霍乱毒素（Sigma - Aldrich，目录号：C8052-.5MG）
氢化可的松（Sigma - Aldrich，目录号：H0888）
蒸压中号ILLI-Q蒸馏水
盐酸（Sigma - Aldrich，目录号：320331-500ML）
抗 CD3（1 μg/ml）（Abcam，目录号：5690）
台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，目录号：15250061）
抗 JAML（Abcam，目录号：67843）
WST-1 试剂（默克，目录号 5015944001）
MTT试剂（默克，目录号：CT01-5）
OCT培养基（Thermo Scientific ，目录号：23-730-571）
16％多聚甲醛（费舍尔小号系统求解，目录号：50-980-487）
Triton X-100（Thermo Science ，目录号：PI28313）
角蛋白 5（Abcam，目录号：ab52635）
Anti-Ki67（Abcam，目录号：ab16667）
抗γδTCR抗体（eBioscience，目录号：12-5711-82）
山羊抗兔Alexa氟488（分子P长袍，目录号：A-11008 ）
山羊抗鸡的Alexa氟647（分子P长袍，目录号：A-21449 ）
DAPI（Abcam，目录号：ab228549）
Vectashield（Vector L aboratories，目录号：H-1500）
MOWIOL 4-88 试剂（Sigma - Aldrich，目录号：475904-100GM-M）
Tris（Sigma - Aldrich，目录号：10708976001）
甘油（Sigma - Aldrich，目录号：G5516）
Superfrost P lus幻灯片（VWR，目录号：48311-703）
PBS用2 ×抗生素（见ř ecipes）
e媒体无钙（见ř ecipes）
FACS染色缓冲液（见ř ecipes）
RPMI培养基（见ř ecipes）
0.2％的Triton X-100 （见ř ecipes）
封闭缓冲液透（见ř ecipes）
4％多聚甲醛（PFA）（见ř ecipes）
70% 乙醇（见配方）
Mowiol （见食谱）

设备

细镊子（Fisher Scientific ，目录号：NC9924848）
剪刀（Fisher Scientific ，目录号：08-951-20）
细胞培养箱（Eppendorf，型号：Eppendorf TM Galaxy TM 170 ）
吸气器（Sigma - Aldrich，目录号：BMSV0020-1EA）
FACS Aria（BD ，型号：FACSAria TM III 分选机）
离心机仪（Eppendorf，米Odel等：5702）
分光光度计（Thermo Scientific TM GENESYS TM 20 可见分光光度计）
细胞培养箱（Eppendorf，型号：Eppendorf TM Galaxy TM 170 S）
细胞计数器（Thermo Fisher Scientific ，型号：Countess3）
7-17 DETC 细胞系（Boismenu和Havran，1994）
低温恒温器（徕卡，型号：CM1950）
-80 °C冷冻机（Thermo Scientific，Forma 超低温立式 DD 冷冻机）
疏水笔（默克，目录号：Z377821-1EA）
加湿室
化合物双目显微镜（塞莱斯特实验室，米Odel等：CB2000CF）
荧光显微镜（Olympus，型号：IX73），共聚焦显微镜 FV 3000 5 激光（IEC60825-1:2007）

软件

ImageJ 1.46版软件
GraphPad棱镜6

程序

DETC 的分离、维护和增殖
鉴于 DETC 的重要作用，需要研究这些细胞的调节和功能的方法。这得益于分离和建立 DETC 原代培养物的能力，并在体外重建它们与不同细胞的细胞间串扰。
分离和文化性Ë DETCs的
通过 FACS 从皮肤中分离 DETC（Kashem 和 Kaplan，2018 年）
产后天安乐死C57BL6幼仔小号通过断头或0至5的方法核定由机构动物伦理委员会。培养 DETC 的 3.5 厘米培养皿需要三到四只幼崽。
使用 70% 乙醇清洁幼崽的表面，以减少微生物污染的机会。
使用锋利的剪刀将每只小狗的四肢和尾巴尽可能靠近核心身体。将剪刀插入通过去除尾部形成的孔，沿着身体的背中线一直剪到颈部的皮肤。
使用镊子，把握皮肤和剥离整个皮肤脱去了身上的，注意不要撕破皮肤成片。将去皮的皮肤放入装有 10 ml 含有 2 ×抗生素（参见配方1）的无菌 PBS的管中 10 分钟，以冲洗去皮。然后通过在组织上涂抹皮肤来去除多余的 PBS。
在一个新的10厘米P含有10ml 0.25％胰蛋白酶的ETRI盘，放置与皮肤的真皮面朝下使与所述溶液接触。避免在胰蛋白酶溶液，以防止过度淹没表皮-表皮的消化。使用细镊子展开卷边，以最大限度地使整个真皮与胰蛋白酶溶液接触。
在 37 °C 下在胰蛋白酶中孵育皮肤一小时或在 4 °C 下过夜。

注意：步骤 A7 到 A9 在室温下进行。
使用细镊子将表皮与真皮分开。分离的表皮将显示为薄的不透明片。真皮可用于分离真皮细胞，例如成纤维细胞（Kashem 和 Kaplan，2018 年）。要查看表皮细胞分离的详细协议和视频，请参阅 Li等人。( 2017)。用剪刀将表皮剪成小块。将表皮和胰蛋白酶混合物转移到新的 50 毫升管中。
使用 10 ml 血清移液管，反复吸取表皮和胰蛋白酶的混合物，以促进组织分离成单个细胞。由于组织团块，血清移液管可能会被堵塞。轻敲移液器以从移液器中取出团块。
继续移液，直到无需敲击即可轻松上下移液。缓慢吸取溶液 10 到 15 次，以正确去除团块。
将细胞悬液通过 70 µm 细胞过滤器放入新的 50 ml 管中。此外，通过5毫升e媒体的无钙（见配方2）通过细胞过滤器以去除被捕获在straine任何细胞- [R ，这也将在激活所述胰蛋白酶。
在 4 °C 下，将细胞悬液在摆斗转子中以 250 × g离心10 分钟。
使用抽吸器小心地取出上清液。通过重悬细胞沉淀在5ml PBS和离心机的洗涤细胞一次，用PBS荷兰国际集团在250 ×克，每次5分钟，在4 ℃下。
用 1 ml 染色缓冲液（参见配方3）重悬细胞以进行 FACS 分选。
注意：对于染色缓冲液，请使用螯合胎牛血清，因为钙的存在可能会导致细胞团块的形成。
使用台盼蓝染色计算活细胞的数量（图 1）。

图 1. 用于计数的细胞的制备。亮-显微镜进行自动计数下将细胞悬浮液的场图像。比例尺：50μ米。

为了防止抗体的非特异性结合，在 4 °C下用抗 CD16/CD32（1 µg/百万细胞）孵育细胞 5 分钟。CD16 / CD32温育非特异性阻止免疫球蛋白到FcγIII，FcγII的结合，以及可能FcγI受体。
从这个表皮细胞悬液中，在五个不同的 FACS 管中制作五份 50 µl 的等分试样。将 50 µl 染色缓冲液添加到每 50 µl 等分试样中，以匹配表 1 中列出的体积并按指示标记样品。
注意：校准流式细胞仪至少需要 100,000 个细胞。

表1 。FACS 分析所需的对照和分析物样品汇总。要校准流式细胞仪，需要各种控制：未染色控制 (#1) 和单染色和同种控制 (#2-5)。对于样品的是要被用于分离DETCs（＃6 /分析物的样品），细胞被染色的所有抗体，再悬浮于染色缓冲液机智H 5微升7AAD的（荧光染料用于染色非活细胞）。用于分离DETCs可能需要的样品进行稀释，使得对事件速率的FACS机器1之间，000-4 ，000事件/秒（它是理想的开始与一个更高浓度和更高稀释基于所述事件发生率）。

将细胞在黑暗中孵育 30 分钟后，通过在 4 °C 下以 250 × g的摆斗转子将管离心5 分钟来沉淀细胞。用抽吸器小心地取出上清液。将细胞沉淀重悬在 1 ml 染色缓冲液中，并在 4 °C 下以 250 × g离心5 分钟，将细胞沉淀洗涤 3 次。
然后可以使用 FACS 分离 DETC ，如Badarinath等人详细解释的那样。（2019 年）和尼尔森等人。（2014）。
比主DETCs其他，也有一个7-17 DETC细胞系，其可以被用于研究效果š对DETCs各种因素和它们的相互作用小号与其他皮肤细胞。在7-17细胞系最初从FACS建立-从AKR小鼠纯化DETC并通过反复刺激伴刀豆球蛋白A补充有的rIL-2（（1微克/毫升）膨胀Edelbaum等人，1995;尼尔森等人，2014 ) 。
笔记：
用于流cytomet样品的制备RY和机器的使用是复杂的过程，ES和超出了本章的范围。在计划 FACS 实验之前，应熟悉流式细胞术的一般背景和理论(Shapiro, 2003) 。
有关排序时门控策略的更多详细信息，请参阅Wohn等人。( 2014 ) 和Havran 等人。( 1989) 。

原代 DETC 和 7-17 DETC 细胞系的培养
由 FACS 分离的原代 DETC 和 7-17 DETC 稳定细胞系均在 RPMI 1640 培养基中培养，温度为 37 °C 、5% CO 2 。在RPMI培养基中补充有10％FBS，2mM谷氨酰胺，500微升青霉素-链霉素（100 × ），50 μ中号β巯基乙醇，25mM的HEPES，1mM的丙酮酸钠，100μM非必需氨基酸，和20U /ml重组人IL-2（Sharp等人，2005 年；Nielsen等人，2014 年）。
初级DETCs和DETC细胞系可以作为悬浮培养物中培养小号通过使用超低附着培养板中。每两天，轻轻倾斜培养皿，取出一半培养基，让细胞安定下来并补充新鲜培养基。
一旦细胞达到 70% 汇合，通过将总细胞悬浮液收集到 15 ml 管中并在室温下以 300 × g离心细胞5 分钟来传代。轻轻取出上清液，将细胞重悬在 1 ml 新鲜培养基中。由此，将 200 µl 添加到一个新的 10 cm 培养皿中，该培养皿含有 10 ml 新鲜生长培养基，并以上述相同的方式培养它们。
DETCs 的体外培养是研究它们与不同细胞类型的相互作用和各种可溶性因子的影响的有用平台。例如，DETCs 可以被邻近细胞分泌的细胞因子激活，也可以被细胞间的直接相互作用激活。还观察到 DETC 通过与毛囊干细胞共培养而被激活（Badarinath等，2019）。
注：虽然在共培养实验中培养不同类型的细胞，我们要时刻注意对不同的细胞类型为不适当条件下的生长条件为培养任何细胞类型可以影响以各种方式，如紧张，增殖的细胞，和细胞凋亡。
我们可以研究各种可溶性分泌因素对效果的DETCs的激活。一种方法是利用从皮肤外植体在该研究者检查从受伤的角质形成细胞分泌的上IL-1α的效果条件培养基的DETCs的活化并详细描述于利说明等。( 2017 ) 和Badarinath等人。（2019）。该实验需要控制被DETCs用重组IL-1α处理的和分离DETCs从IL-1受体KO动物小号用IL-1α处理。分离出的细胞可用于实验以确定影响 DETC行为（如增殖和激活）及其对皮肤中邻近细胞的影响的可溶性和细胞间信号。
笔记：
对于调理，使用将在其中进行后续培养实验的相同培养基。在这些实验中避免在培养基中使用血清，因为血清会对细胞产生其自身的影响。
作为 DETC 激活的替代对照，这些细胞可以用重组 IL-23 (10 ng/ml)、重组 IL-1beta (10 ng/ml)、抗 CD3 (1 μg/ml) 或这些的组合进行处理并通过测量IL-17，FGF7，TNFα的表达得分为激活，如上所述通过ELISA或转录物水平和IFN-γ。

体外活化 DETC 的增殖试验
增殖增加是激活的 DETC 的标志之一，因此可用作激活的读数。除增殖外，活化的 DETC 的其他生物标志物还包括各种细胞因子的表达和分泌，例如 IL-17、FGF-7、TNFα 和 IFN-γ。这些分泌的细胞因子可以在 48 小时后使用 ELISA 试剂盒进行检测（Nielsen等，2014），或者在处理 24 小时后在转录水平上很明显（Lee等，2017）。

分泌因子对 DETCs 的影响
对于增殖分析，如前文所述，培养 DETC。当细胞是70％汇合，收集在细胞中一个15毫升˚F爱尔康管和离心机在300 ×克，在室温下5分钟。
用新鲜的 RPMI 培养基稀释控制和测试条件培养基 1:3。
注意：Badarinath 等人详细解释了条件培养基的制备。（2019）。
将细胞重悬于100微升各自的条件培养基和，从那些，板中的每个30,000细胞孔的96 -孔培养皿。
将细胞在 100 µl 条件培养基中在 37 °C下孵育24 至 48 小时。
温育后，除去含DETCs和量化增殖媒体在不同的时间间隔如24，48 ，和72小时。
有可用的多种测定法，通过它可以计数的细胞数为增殖测定小号与各种刺激物如处理后的MTT细胞增殖测定法，WST-1细胞增殖测定法，和台盼蓝细胞计数。

DETCs分泌的各种因子对毛囊干细胞的影响
注意：如之前 Nowak 和 Fuchs ( 2009)所述，分离原代毛囊干细胞。
用来自对照或测试皮肤/表皮外植体动物的条件培养基处理 DETCs 16-24 小时。
将悬浮培养物收集在 15 ml F alcon 管中，并以 300 × g离心5 分钟。收集上清液并丢弃细胞沉淀。
用新鲜的电子媒体以 1:5 的比例稀释条件培养基。
用稀释的条件培养基在 37 °C 、7% CO 2下孵育毛囊干细胞 24-48 小时。
在 24-48 小时的时间段内以不同的时间间隔计算细胞。

DETC 活化的体内分析
组织微环境强烈决定了 DETC 的调节和功能。在稳态条件下，DETCs 具有独特的树突形态，但在受伤或压力后，靠近伤口部位的 DETCs 获得圆形形态并暂时失去其树突。除形态学变化外，DETC 激活的另一个标志是增殖指数增加。激活后，DETC 会释放某些细胞因子，这些细胞因子在维持小鼠皮肤的保护性物理和免疫屏障方面发挥着重要作用。DETC 功能的变化会加重与皮肤相关的自身免疫性疾病，阻碍肿瘤根除，或破坏正常的伤口愈合（Cruz等人，2018 年）。因此，对 DETC 的体内分析促进了我们对这些细胞在生理条件（如伤口愈合）和各种病理情况（包括纤维化、炎症性疾病和癌）中的功能的理解。

数据分析

小鼠皮肤切片
要将皮肤嵌入 OCT 介质中，请遵循 Gund等人中描述的协议。（2021）。
按照 Fischer等人的描述对冷冻块进行切片。（2008 年）。
将切片存放在 -80 °C的带电幻灯片上。
笔记：
从小鼠的同一区域收集皮肤，以比较对照和试验动物之间的 DETC。众所周知，小鼠皮肤不同区域的 DETCs 存在异质性。
由于 DETC 在不活动时在形态上是树突状的，因此最好有更厚的部分来可视化形态和量化树突。因此，取部分≥ 10米μ微米厚。

γδTCR 和 Ki67 的免疫荧光检测
从 -80 °C冰箱中取出带有皮肤切片的冷冻载玻片，并在室温下解冻至少一分钟（但不超过 5 分钟）。
使用无尘纸，小心地取出皮肤组织周围的凝结。将载玻片放入加湿室（Gund等人，2021 年）。
使用疏水笔在组织切片周围制作疏水屏障。为了固定段，加50-100 μ 4％PFA的升每组织切片在室温下10分钟。确保组织切片完全被 PFA 覆盖。
注意小号：
这使您可以最大限度地减少使用的缓冲液和抗体的体积，并能够对一张载玻片上的多个皮肤切片进行差异染色。
请务必阅读抗体数据表以使用适当的固定剂。该协议针对试剂部分中提到的抗体进行了描述。
不超过一个固定的时间的10分钟以上的组织为小于10 μ微米厚作为过定影导致过量交-抗原连接，并且能够产生假阴性结果。
较厚的部分必须固定更长时间 –建议在 4 °C 下孵育过夜。
孵育 10 分钟后吸出 4% 的粉煤灰。用50-100彻底清洗部μ 1升× PBS，每次5分钟三次。
注意：如果切片松散地附着在载玻片上，则可以避免吸入。相反，可以使用移液器去除固定剂/缓冲液。
添加足够的封闭缓冲液以覆盖组织切片，以在室温下阻止非特异性相互作用 1 小时。
注意：切片的冻融会导致质膜透化，并保持膜蛋白的完整性。因此，应避免使用任何苛刻的去污剂（如 Tween-20 或 Triton-X）进行额外的透化步骤，因为这会破坏膜蛋白，特别是如果放置时间过长。
孵育在封闭缓冲液稀释，并用一级抗体（γδTCR标记DETCs和Ki67标记增殖细胞）的部分（参照到表2稀释）。添加50-100 μ稀释的初级抗体的升向每个部分，并培育过夜，在4 ℃下在加湿室中。
注意：确保疏水屏障完好无损。如果没有，再与标记的边界一前加入所述部分周围的疏水性笔的初级抗体。
吸出一抗，每 3 次用 1 × PBS清洗切片5 分钟。
添加50-100 μ二级抗体的升（参照到Ť能够2用于抗体稀释液）在封闭缓冲液中稀释到部分并孵育在加湿室中室温下20分钟。
注意：本协议中使用的 γδTCR 抗体是偶联抗体，不需要二抗。
吸出二抗，每 3 次用 1 × PBS清洗切片5 分钟。
使用 Vectashield 安装介质安装部分。
注意：可以使用替代安装介质（例如 Mowiol 或 80% 甘油）安装切片。
在荧光显微镜下对幻灯片进行成像。
注意：虽然染色后立即成像信号是最佳的，但染色切片可以在 4°C 下保存，然后再对载玻片成像。
替代方法：如果使用其他抗体以及需要对组织进行额外透化的 γδTCR，请按照以下步骤操作：
对于 γδTCR 的染色，请按照 B 部分中的协议进行操作，直至步骤 8。
对切片重复步骤B 1 到B 5。
添加50 μ透化缓冲液（0.25％的Triton X-100的PBS），并培育的升，在室温下15分钟。
注意：用于透化的 Triton X-100 的浓度应针对每种感兴趣的抗原确定。
用含有山羊血清和 0.1% Triton X - 100的封闭缓冲液在室温下封闭切片1 小时。
注意：封闭缓冲液应包含与二抗宿主相同物种的热灭活正常血清。
在室温下用在封闭缓冲液中稀释的初级抗体孵育切片 2 小时。
按照协议B部分中的步骤B 8 到B 12。

表2 。B 部分中使用的各种一抗和二抗及其各自的稀释度的总结

影像采集与分析
在荧光显微镜下对染色切片进行成像。为了量化增殖的 DETC 的数量，10 ×和 20 × 的较低放大率图像就足够了。为了可视化非活动和活动 DETC 之间的形态差异，需要更高放大率 (>40 × ) 的图像。
注意：建议使用 z 堆栈图像来完全可视化在多个平面中遍布整个表皮的 DETC 的树突。
在稳态条件下，DETCs 通常是无活性的并且局限于表皮的基底层和毛囊的上部区域（Lee等，2009）。顾名思义，它们具有树枝状形态。另一方面，DETC 被激活的条件，例如特应性皮炎（Lee等人，2009 年和2017 年）和鳞状细胞癌（Du等人，2010 年；De Craene等人，2014），细胞失去了它们的树突状延伸，并且在形态上看起来更圆（Lee et al. , 2009; Du et al. , 2010）。之前曾报道过半胱天冬酶 8 cKO 小鼠，一种特应性皮炎模型（Lee等人，2009 年；Du等人，2010 年），表现出激活的 DETC（Lee等人，2017 年）。在这个协议中，我们证明了这种 DETCs 的激活（形态变化和增殖增加）在具有强烈炎症表型的小鼠模型中是保守的。例如，我们观察到皮肤鳞状细胞癌的小鼠模型（K14 Snail 转基因小鼠）（Du等人，2010 年）早在新生儿阶段也表现出 DETC 的激活（图 2 和图 3）。

图 2. WT 和Snail 转基因皮肤中激活的 DETC 的可视化。Ki67（绿色）的免疫荧光分析用于描述增殖，γδTCR（红色）用于标记 DETC，K5（蓝色）用于标记 WT 和 SnTg 皮肤切片上的表皮基底层，以观察 DETC 的激活。比例尺小号：50 μ米。

图 3. 激活后的形态变化。与 WT 皮肤中 DETC 的树突形态相比，Snail转基因皮肤中由 γδTCR（红色）标记的 DETC 的圆形形态显示出激活的迹象。比例尺s ：25 µm 。

当被激活时，DETC 会增殖，因此 Ki67 呈阳性。因此，为了量化增殖的 DETC 的数量，我们计算了出生后第 7 天- WT 和 K14 Snail 转基因小鼠表皮中 Ki67 阳性的 γδTCR 阳性细胞的数量。WT 和 Snail转基因皮肤表皮上的 DETC 数量是可变的。因此，为了确保不同背景之间量化的一致性，我们计算了每 1毫米皮肤切片的所有 γδTCR 阳性细胞。
在p是Ki67阳性和阴性DETCs的ercentage可以通过使用ImageJ如下量化：打开γδTCR和Ki67的合并图像上ImageJ软件>主菜单>插件>细胞计数器>初始化>类型1.点击细胞γδTCR和 Ki67均为阳性。这将给出正在增殖的 DETC 的数量。计数是阴性的Ki67 DETCs的数目，去ImageJ软件>主菜单>插件>细胞计数器>初始化>类型2在P增殖和非增殖DETCs的ercentage可以使用下列公式计算：

比例š DETCs的那是Ki67阳性和在WT和K14蜗牛负转基因皮肤如示于图4。

图 4. WT 和 SnTg 皮肤中激活的 DETC 的量化。描述增殖 DETC 比例的百分比图，这表明 Snail 转基因皮肤比WT 皮肤具有更多增殖的 DETC 。

为了量化WT和SnTg表皮DETCs的圆，ImageJ软件的使用。仅拍摄 DETC（γδTCR 阳性细胞）的图像 > 使用 ImageJ 上的多边形选择工具为每个 DETC 标记轮廓 > 分析 >设置测量 > 区域和形状描述（选择“形状描述符”参数进行测量和显示）> 分析> 测量或 Ctrl+M。这将显示一个带有测量值的表格。对WT 和 SnTg 皮肤部分中的所有DETC执行此步骤。圆度值为 1 表示单元格是一个完美的圆，接近 0 的值表示单元格被拉长。在此协议中，我们使用了≥ 0.5的阈值循环值来调用 DETC 活动。使用这些测量值绘制的图（图 5）显示K14 Snail 转基因皮肤中的 DETC更圆，表明与 WT 皮肤中的相比，DETC具有激活作用。

图 5. 在 DETC 中观察到的形态变化的量化。激活DETCs显示形态变化小号从一个树枝状到圆形形状，这是使用量化的ImageJ软件。散点图显示，与 WT 表皮中的 DETC 相比，Snail 转基因表皮中的 DETC 更圆（圆度值 ≥ 0.5）。数据代表值 ± SEM，*** P < 0.0001，基于学生t检验。

食谱

P BS用2 ×抗生素
将 2 ml青霉素-链霉素(100 × ) 添加到 10 ml 10 × PBS 中，并用 ddH 2 O使体积达到 100 ml 。
无钙E培养基
如Nowak 和 Fuchs ( 2009)所述，为表皮角质形成细胞制备不含钙的 E 培养基。
FACS 染色缓冲液
2毫升螯合胎牛血清
1 ml 青霉素-链霉素 (100 × )
100 微升 50 毫克/毫升庆大霉素
添加到 5 ml 的 10 × PBS 中
B环体积高达 50 ml，使用 ddH 2 O
RPMI 媒体
10% 胎牛血清
2 mM 谷氨酰胺
500 µl 青霉素-链霉素 (100 × )
50 μ中号β巯基乙醇
25 mM HEPES
1 mM 丙酮酸钠
100 µM 非必需氨基酸
20 U/ml重组人IL-2
B环体积高达 500 ml，使用 RPMI 培养基
0.2% 海卫 X-100
加入2mL 100％的Triton X - 100到100毫升10 × PBS，并把体积达到1升用的DDH 2 ö 。
用于透化的封闭缓冲液
加0.5 ml山羊血清（或血清源自相同物种作为次级荧光缀合的抗体）和10 μ升的Triton X -在1毫升10的100 × PBS和使体积至10ml的DDH 2 O.
4% 多聚甲醛 (PFA)
通过将 12.5 ml 16% PFA 添加到 5 ml 10 × PBS 中稀释 10 × PBS 中的 16% 多聚甲醛，并通过添加ddH 2 O使体积达到 50 ml 。
70% 乙醇
通过在 300毫升蒸馏水中加入 700 毫升 100% 乙醇，在蒸馏水中稀释 100% 乙醇。
莫维尔
将 2.4 克 MOWIOL ® 4-88添加到4.75 毫升甘油中并搅拌混合。
加入 6 ml 水并在室温下搅拌数小时。
加入 12 ml 0.2 M Tris (pH 8.5) 并加热至 50°C 10 分钟，偶尔混合。
MOWIOL 4-88 溶解后，以 5 , 000 × g离心15 分钟澄清溶液。

致谢

作者要感谢 Binita Dam 和 Johan Ajnabi 对手稿的批判性审查。Jamora实验室的工作得到了 inStem 核心基金和印度政府生物技术部过去的资助 (BT/PR8738/AGR/36/770/2013)；国立关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所 (NIAMS)，NIH (5R01AR053185-03)；和美国癌症协会 (15457-RSG-08-164-01-DDC)。动物工作得到了生物技术系国家小鼠研究资源 (NaMoR) (BT/PR5981/MED/31/181/2012; 2013-2016) 的部分支持。我们感谢 NCBS/inStem 动物护理和资源中心的工作人员对畜牧业的帮助，以及 NCBS/inStem 中央成像和流式细胞仪 (CIFF) 的工作人员在图像采集方面的帮助。我们致力于此协议内存的我们的同事和朋友温迪哈夫兰教授谁是在该领域的先驱和领导γδ T细胞生物学。
该协议用于以下手稿：Lee, P., Gund, R., Dutta, A., Pincha, N., Rana, I., Ghosh, S., Witherden, D., Kandyba, E., MacLeod , A., Kobielak, K., Havran, WL 和 Jamora, C. (2017)。通过 IL-1 依赖性激活γδ T 细胞来刺激毛囊干细胞增殖。Elife 6 ：e28875 。

利益争夺

没有需要申报的利益冲突。

伦理

所有与动物有关的工作都是在 NCBS/inStem 动物护理和资源中心进行的，并且协议得到了机构动物伦理委员会的批准。

参考

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