材料和试剂

显微镜载玻片（Citotest，目录号：198105）
12孔板（Jet，目录号：TCP011012）
10 cm细胞培养皿（Jet，目录号：TCD010100）
15/50 ml无菌离心管（Jet，目录号：CFT011500）
血清移液管（JETBIOFIL，目录号：GSP-010-005/GSP-010-010）
25 cm细胞刮刀（BIOFIL，目录号：CSC011025）
显微镜盖玻片（NEST，目录号：801008 ，Φ 15毫米）
5 ml 注射器，带 26 G 针头
2 0 ml 注射器，带18 G 针头
小鼠（C57/BLJ6，北京维塔河实验动物科技有限公司）
RPMI 1640（Gibco，目录号：31800022，4°C）
DMEM/F12（Gibco，目录号：12500062，4°C）
FBS（Hyclone，目录号：SH30084.03，-20°C/4°C）
非必需氨基酸（Gibco，目录号：111140-050，4 °C）
青霉素-链霉素（Gibco，目录号：15140-122，4°C）
PBS（Gibco，目录号：21600-069，4°C）
4% 多聚甲醛（PFA）（Sangon Biotech，目录号：E672002-0500，15-25 °C（RT））
牛血清白蛋白（Sangon Biotech，目录号：A500023，4 °C）
抗 ASC（AdipoGen，目录号：AG-25B-0006，-20°C）
皂苷（Sigma，目录号：47036，4°C）
荧光偶联二抗（Alexa Fluor TM 488 山羊抗兔）（Invivogen，目录号：A11008，-4°C）
LPS（Invivogen，目录号：tlrl-smlps ，-20°C）
ATP（Sigma，目录号：FLAAS，-20°C）
X-fect 转染试剂（X-fect 聚合物，X-fect 缓冲液）（Clontech，目录号：631318，-20°C）
4',6-二脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（CST，目录号：8961 S，-20°C）
抗荧光衰减密封剂（Solarbio，目录号：S2100，4 °C）
TWEEN ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
Cell-neubauer 改进 (LW Scientific, 0.0025 mm 2 )
BBL TM Trypticase TM Soy Broth（BD，目录号：211768，RT）
NaCl（Sangon Biotech，目录号：A501218-0001，RT）
胰蛋白胨（OXOID，目录号：LP0042，RT）
酵母提取物（OXOID，目录号：LP0021，RT）
琼脂（SbaseBio，目录号：A010-1.1，RT）
TSB 固体培养基（见配方）
TSB 液体培养基（见配方）
LB 固体培养基（见配方）
LB 液体培养基（见配方）
1% BSA（见食谱）
0.1% 皂苷（见食谱）
0.1% PBST（见配方）

设备

眼科剪刀（北京宝源工业科技，目录号：M-Y003）
眼科钳（北京宝源工业科技，目录号：M-Y005）
共聚焦显微镜（蔡司，型号：LSM880）
显微镜（蔡司，型号：Primo vert iLED）
生物安全柜超净工作台（热˚F isher小号系统求解，型号：1300）
CO 2孵化器（热˚F isher小号系统求解，型号：3111 ）
便携式移液器辅助装置（Drummond ，目录号：4-000-201）
隔膜真空泵（天津金腾实验设备，型号：GM-0.33A ）
纳米光度计 p 级（IMPLEN，型号：NT-80）
-80°C 冷冻机（The r mo，型号：FDE30086FV ）

软件

ZEN black_2-3SP1（蔡司，https: //www.zeiss.com/corporate/us/home.html ）
ZEN blue 2.6（蔡司，https ://www.zeiss.com/corporate/us/home.html ）

程序

的培养弗朗西斯新凶手弗朗西斯菌（U112株）和鼠伤寒沙门氏菌（SL1344 菌株）
新生弗朗西斯菌(U112)
新生弗朗西斯菌的回收：将冷冻的新生弗朗西斯菌原液在 TSB 固体培养基（含 1% L-乙酰半胱氨酸）上划线，并置于 37°C 培养箱中 24 小时。
的培养弗朗西斯新凶手弗朗西斯菌：放置一个的单一菌落弗朗西斯新凶手弗朗西斯菌到5毫升的TSB液体培养基（含1％L-乙酰半胱氨酸）和在37℃下摇床以200rpm旋转生长过夜。
新生弗朗西斯菌的继代培养：将3 ml 过夜培养的新生弗朗西斯菌转移到 6 ml 新鲜 TSB 液体培养基（含 1% L-乙酰半胱氨酸）中，并在 37°C 下孵育，同时以200 rpm摇动2 小时。
细菌的浓度的测定：使用1毫升继代培养的弗朗西斯新凶手弗朗西斯菌到测量电Ë OD的值600与根据此方程“Nanophotometer p级（IMPLEN，NT80）和计算的细菌的浓度为1（OD 600 ）= 1 × 10 6 CFU / μ升”。
鼠伤寒沙门氏菌 (SL1344)
鼠伤寒沙门氏菌的回收：将冷冻的鼠伤寒沙门氏菌原液在 LB 固体培养基上划线，然后放入 37°C 培养箱中 24 小时。
的培养沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌：放置一个的单一菌落沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌到3ml LB液体培养基，并生长在37℃下摇床以200rpm旋转过夜。
鼠伤寒沙门氏菌的继代培养：将0.5 ml 过夜培养的鼠伤寒沙门氏菌转移到 2.5 ml 新鲜的 LB 液体培养基中，并在 37°C 下孵育，同时以200 rpm摇动2 小时。
细菌的浓度的测定：使用1毫升继代培养的沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌到测量电Ë OD的值600与根据Nanophotometer p级（IMPLEN，NT80）并计算细菌的浓度，以该方程“1（OD 600 ）= 1 × 10 6 CFU / μ升”。

L929上清液的制备
种子5 × 10 5 L929细胞于10cm P ETRI菜。
在补充有 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中，在培养箱（37°C，5% CO 2 ）中培养 L929 细胞7 天。
收集上清液用移液管到一个50ml的离心管中。
离心机中以1 ，962 ×克10分钟，然后用上清转移一个吸管TE到一个新的50ml离心管中。˚F reeze在-80℃下。

BMDMS 的生成
牺牲小鼠并在喷洒75％的酒精IR全身。去除后腿的皮肤和毛皮，并在髋关节后切断后腿。置于 PBS 中。
除去从腿部的肌肉组织和切断从两端的胫骨和股骨（视频1 ）。

视频 1. BMDM 的生成。（该视频是在做了中国科学院昆明动物研究所一个ccording从指引中国科学院昆明动物研究所Ø ñ动物护理和被批准的动物研究伦理委员会的中国科学院昆明动物研究所根据协议SMKX-20,6020 ）。

冲洗骨髓（BM）细胞与L929上清液含有荷兰国际集团的DMEM / F-12介质（1：3）补充有10％FBS，1％非必需氨基酸和1％青霉素-链霉素使用一个5毫升注射器一个26克针。吸出冲洗骨髓几次通过20毫升注射器的18号针，以获得单细胞悬浮液。
在培养箱（37°C，5% CO 2 ）中培养 BM 细胞5 天。我们Ë 10毫升介质每个P ETRI菜和5ml新鲜L929上清液含有的添加荷兰国际集团DMEM / F-12培养基中于P ETRI盘上3天。

细胞载玻片的制备
将高压灭菌的盖玻片放在12 孔板上。
用PBS洗涤三次，对于每次3分钟。
刮细胞从培养皿一个细胞刮刀，重悬在10毫升DMEM / F-12培养基与10％FBS ，并使用计数细胞一个细胞计数室。
将5 × 10 5 BMDM 播种到 12 孔板中，并在 37°C和5% CO 2下孵育过夜。中号确认阿克细胞融合的第二天也就是60％左右。

细胞刺激和固定
用500变介质μ新鲜DMEM / F-12培养基的升未经处理前L929上清液。
治疗的BMDM与不同的条件，如下小号，并在37°C孵育和5％CO 2 。
刺激的BMDM与2 μ升LPS的（500毫微克/毫升，4小时）和2 μ的ATP升（5毫米，20分钟）。
转染的BMDM与双链DNA（2 μ的升1.5 μ使用克载体对照质粒）的X-FECT转染试剂15分钟（X-FECT聚合物0.45微升和X-FECT缓冲器100微升）。
传染的BMDM with10 μ的升Francisella novicida U112 菌株（100 MOI，12 小时）。
传染的BMDM with10 μ l的沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌（3 MOI，1个小时）。
通过抽吸从每个孔中取出培养基，并用 PBS轻轻旋转洗涤 3 次。
通过抽吸去除 PBS，并在室温下用商业4% 多聚甲醛固定15 分钟。
用吸尘器多聚甲醛和洗上固定的BMDM的盖玻片轻轻搅拌使其与500 µl PBS 三次。

免疫荧光染色
阻断和渗透细胞250-300 µl 1% BSA 和 0.1% 皂苷15-25 °C (RT) 1 小时。
通过抽吸并轻轻旋转删除块缓冲器的用PBS三次将细胞用于每次3分钟。
将细胞在 300 µl 一抗溶液（1% BSA 中的抗 ASC、0.1% 皂苷、1:150 稀释）中在 4 °C 下孵育过夜。
清洗细胞用500μl0.1％PBST三次一个上摇摆平台，对于每次3分钟。
在 15-25 °C (RT) 下，在 PBS（1:300 稀释）中用荧光偶联二抗染色细胞1 小时。
清洗细胞用500μl0.1％PBST三次一个上摇摆平台，对于每次3分钟。
用 250-300 µl DAPI（5 µg/ml，在 PBS 中制备）在 15-25 °C (RT)下染色细胞5-10 分钟。
清洗细胞用0.1％PBST三次一个上摇摆平台，对于每次3分钟。

盖玻片固定
取下盖片从12孔板用镊子小号和空气干燥。
将抗荧光衰减密封剂放入含有细胞的一侧。
附加的含细胞的侧盖片的至显微镜载玻片（25 × 75毫米）。滴密封剂到的边缘的盖片结合的盖玻片和显微镜载玻片在一起并防止样品干燥ING 。甲空隙气泡和空气干燥10分钟，在15-25 ℃下（RT）。

共聚焦扫描和图像采集
在蔡司-LSM880 共聚焦显微镜（100 倍，油浸透镜）上扫描细胞。
执行检查与ZEISS-LSM880共聚焦激光扫描显微镜使用e以下设置：激发488nm和发射530nm处为ASC斑点检测，正常的扫描速度，和帧1024 × 1024中检测到，并在图中示出的ASC斑点形成1.图像获取被执行与软件ZEN black_2-3SP1。
分析通过使用数据的软件ZEN蓝色2.6（协议在补充材料）。

食谱

TSB 固体培养基 (1 L)
30 克 BBL TM胰蛋白酶TM大豆肉汤
15 克琼脂
121°C 高压灭菌 15 分钟。
当温度在 60°C 左右时，将 L-乙酰半胱氨酸（1% 体积比）加入到高压灭菌的培养基中。
TSB 液体培养基 (1 L)
30 克 BBL TM胰蛋白酶TM大豆肉汤
121°C 高压灭菌 15 分钟。
当温度在 60°C 左右时，将 L-乙酰半胱氨酸（1% 体积比）加入到高压灭菌的培养基中。
LB 固体培养基 (1 L)
10 克氯化钠
10 克胰蛋白胨
5 克酵母提取物
15 克琼脂
121°C 高压灭菌 15 分钟
LB 液体培养基 (1 L)
10克娜Ç升
10 克胰蛋白胨
5 克酵母提取物
121°C 高压灭菌 15 分钟
1% BSA
1 克牛血清白蛋白
100 毫升 PBS
0.1%皂甙
0.1克皂角苷
100 毫升 PBS
0.1% PBST
1 毫升吐温® 20
1升PBS

致谢

这项工作是由中国国家自然科学基金（31970896，31701134的支持，和81701578）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

本研究已获得中国科学院昆明动物研究所机构审查委员会的批准。甲nimal实验在这个协议：SMKX-20 1 6020 ; 有效期：2017年1月至2022年1月。

参考

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Beilharz, M.、De Nardo, D.、Latz, E. 和 Franklin, BS (2016)。测量 NLR 寡聚化 II：通过共聚焦显微镜和免疫荧光检测 ASC 斑点形成。方法 Mol Biol 1417：145-158。
Guo, Y., Li, L., Xu, T., Guo, X., Wang, C., Li, Y., Yang, Y., Yang, D., Sun, B., Zhao, X., Shao, G. 和 Qi, X. (2020)。HUWE1 介导炎症小体激活并促进宿主对细菌感染的防御。J Clin Invest 130(12): 6301-6316。
Hoss, F., Rolfes, V., Davanso, MR, Braga, TT 和 Franklin, BS (2018)。通过流式细胞术和化学交联检测 ASC 斑点形成。分子生物学方法1714：149-165。
Rathinam, VA 和 Fitzgerald, KA (2016)。炎性体复合物：新兴机制和效应器功能。单元格165(4)：792-800。
Sester, DP, Thygesen, SJ, Sagulenko, V., Vajjhala, PR, Cridland, JA, Vitak, N., Chen, KW, Osborne, GW, Schroder, K. 和 Stacey, KJ (2015)。一种评估炎症小体形成的新型流式细胞术方法。J Immunol 194(1): 455-462。
Stutz, A., Horvath, GL, Monks, BG 和 Latz, E. (2013)。ASC 斑点形成作为炎症小体激活的读数。方法 Mol Biol 1040：91-101。