材料和试剂

注意：如有必要，可以使用这些材料的其他品牌。
甲乙酮萃取
1.蛇皮TM d ialysis吨ubing，3.5K MWCO 35毫米（赛默飞世尔科技TM ，Thermo Scientific的TM ，目录号：88244）
2.频谱TM d ialysis吨ubing Ç losures：光谱/ POR TM标准型（赛默飞世尔科技TM ，Fisher Scientific公司TM ，目录号：08-750-24C）
3.的Amicon ®超15 Ç entrifugal ˚F ILTER ù尼特（Millipore公司Sigma，目录号：UFC900308）
4.带有锥形插入物的HPLC 小瓶（Thermo Fisher Scientific TM目录号：03-375-17CA）
5.玻璃分液漏斗
6. 15 ml Falcon TM管（Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：05-527-90）
7. 50 ml Falcon TM管（Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：14-432-22）
8. 9”巴斯德玻璃p ipets，FISHERBRAND TM （赛默飞世尔科技TM ，Fisher Scientific公司TM ，目录号：13-678-20C）
9.吸取b水下定位信标，FISHERBRAND TM （赛默飞世尔科技TM ，Fisher Scientific公司TM ，目录号：03-448-21）
10. Eppendorf ® UVette ® （Millipore Sigma，目录号：Z618683）
11. Tris盐酸盐（Millipore Sigma，目录号：10812846001）
12.甲乙酮，HPLC 级。JTBaker TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：02-003-445）
13. 12 N HCl（Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：A144-500）
14.三氟乙酸，Optima TM LC/MS Grade，Fisher Chemical TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：A116-05AMP）
15.乙腈 Optima TM ，用于 HPLC 和 GC，Fisher Chemical TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：A996-4）
16. MEK 提取缓冲液（见配方）
17.恢复缓冲液（见食谱）

酸-丙酮沉淀
1. FISHERBRAND TM高级米icrocentrifuge吨ubes：1.5米升（赛默飞世尔科技TM ，Fisher Scientific公司TM ，目录号：05-408-129）
2.幻灯片-A-Lyzer TM MINI d ialysis d evice，10 ķMWCO，2.0M升（Ť hermo Fisher Scientific公司TM ，目录号：8840 4 ）
3. Eppendorf ® UVette ® （Millipore Sigma，目录号：Z618683）
4.的Amicon ®超15 Ç entrifugal ˚F ILTER ù尼特（Millipore公司Sigma，目录号：UFC900308）
5.丙酮（HPLC），Fisher Chemical TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：A949-4）
6. 12 N HCl（Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：A144-500）
7.磷酸二氢钠二水合物（Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：S381-500）
8.氯化钠，非碘化，颗粒状，FCC，99 - 100.5％，Spectrum TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：18-606-420）
9.咪唑，99％，ACROS Organics TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：AC122025000）
10.阿法埃莎TM克uanidine盐酸盐，98％（热Fisher Scientific公司TM ，Fisher Scientific公司TM ，目录号：AAA1354301）
11.三氟乙酸，Optima TM LC/MS Grade，Fisher Chemical TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：A116-05AMP）
12.乙腈 Optima TM ，用于 HPLC 和 GC，Fisher Chemical TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：A996-4）
13.酸性丙酮（见配方）
14.变性缓冲液（见配方）

柱上血红素前牵引
1. Thermo Scientific的TM的Nalgene TM快速流量TM小号terile小号英格尔-u本身v acuum ˚F ILTER ù尼特（Thermo Scientific的TM ，目录号：09-740-28C）
2.试管
3. DWK生命科学金布尔TM Kontes TM FlexColumn TM Ë conomy Ç olumn（赛默飞世尔科技TM ，Fisher Scientific公司TM ，目录号：K420400-2520）
4.带有锥形插入物的HPLC 小瓶（Thermo Fisher Scientific TM目录号：03-375-17CA）
5. Parafilm ® M（Millipore Sigma，目录号：P7793）
6.烧杯
7. Eppendorf ® UVette ® （Millipore Sigma，目录号：Z618683）
8. HisPur TM Ç obalt ř ESIN（赛默飞世尔科技TM ，Thermo Scientific的TM ，目录号：89966）
9. HisPur TM Ñ ickel的Ni-NTA ř ESIN（赛默飞世尔科技TM ，Thermo Scientific的TM ，目录号：88221）
10.磷酸二氢钠二水合物（Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：S381-500）
11.氯化钠，非碘化，颗粒状，FCC，99 – 100.5％，Spectrum TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：18-606-420）
12.咪唑，99％，ACROS Organics TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：AC122025000）
13.乙醇，200标准，用于分子生物学（Millipore Sigma，目录号：E7023-4L）
14.三氟乙酸，Optima TM LC/MS Grade，Fisher Chemical TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：A116-05AMP）
15.乙腈 Optima TM ，用于 HPLC 和 GC，Fisher Chemical TM （Thermo Fisher Scientific TM ，Fisher Scientific TM ，目录号：A996-4）
16.平衡缓冲液（见配方）
17.组氨酸标签 Ulp1 SUMO 蛋白酶溶液（见食谱）
18.变性b uffer（见配方）
19.血红素洗涤缓冲液（见配方）
20.高咪唑缓冲液（见配方）

设备

通用设备
Clay Adams Nutator Mixer 1105（Cambridge Scientific，目录号：17847）
Uvette ®适配器；包括在所述UVette ®起动机集仪（Eppendorf，目录号952010077）
分光光度计（岛津制作所，米Odel等：UV-1800）
HPLC（安捷伦TM 1100系列配备有一个G1315B二极管阵列UV / Vis检测器）
C4 反相 HPLC 柱（Waters TM 、Symmetry300 TM C4 5 μ m 4.6 × 150 mm，目录号：186000288）

甲乙酮萃取
离心机（贝克曼库尔特，型号：Allegra X-14R）
SX4750A 摆斗转子（贝克曼库尔特，型号：SX4750A ARIES TM ）
pH 计（Thermo Fisher Scientific TM 、Thermo Scientific TM Orion Star A111）

酸-丙酮沉淀
微量仪（Eppendorf TM ，米Odel等：5424 R）
微量离心机转子（Eppendorf TM ，目录号：FA-45-24-11）

软件

GraphPad棱镜9

程序

通过甲基乙基酮 (MEK) 提取去除血红素
该协议最适合相对浓缩的蛋白质样品（〜0.1 - 1 mM的血红素的基础上），并且当样品体积为至少1米升。后一要求能够轻松分离萃取过程中产生的有机相和水溶液相。图 1 中的流程图描述了通过甲基乙基酮 (MEK) 提取从血红素蛋白中去除血红素。纯化的蛋白质用 MEK 提取，导致有机、含血红素层和含水、含蛋白质层的相分离。收集水层并将蛋白质拯救到恢复缓冲液中。

图1 。中号乙基乙基酮萃取。血红素蛋白是缓冲-交换，并转移至分液漏斗或50 -米升锥形。样品用 MEK 提取，经过短暂的孵育后，在含有载脂蛋白（灰色球体）的水层（紫色）上方形成含有血红素（红色方块）的有机层。水层被收集，通过打开分液漏斗或通过使用移液管，以从50下层转移- mL锥形，和获救进入恢复缓冲。残留的 MEK 通过缓冲液去除-更换样品。该图是使用BioRender.com创建的。

交换的血红素蛋白溶液到MEK提取缓冲液，并调整所述浓度为1 - 10毫克/米升由任一稀释在MEK提取缓冲液的样品或缓冲液-交换的样品通过离心浓缩浓缩器（Amicon ®超15 Ç entrifugal ˚F ILTER ù尼特）或透析（蛇皮TM d ialysis吨ubing）。甲实际最终体积为5 - 10毫升。
预冷15米升每2升表达培养MEK （或约1m升MEK每2 mg蛋白质）和一个〜3倍的样品体积恢复在冰上分别缓冲。
在纳米纯水中将12 N HCl稀释到 2 M HCl 的最终浓度。
调节冷冻血红素蛋白溶液的pH至2.25 -用2M HCl 2.45。使用 pH 计监测 pH 值的变化。
结合冰冷MEK和血红素蛋白溶液在1：1的比例在玻璃分液漏斗或15 - 50米升Falcon管。轻轻混匀，彻底最大化的血红素提取效率。
允许约15分钟的结果ING乳液充分进行相分离。由于溶剂化血红素的存在，上 MEK 层应呈红粉色。
如果使用分液漏斗，通过小心洗脱收集含有载脂蛋白的较低水层。如果使用Falcon管，我nsert玻璃巴斯德吸管到管的底部，并且将水层小心吸管到一个新的试管中。某些样品可能需要额外的提取和洗涤步骤。
将蛋白质水溶液以1:1 的体积比转移到冰冷的恢复缓冲液中，并将样品在冰上孵育约 10分钟，以使感兴趣的蛋白质重新折叠。
缓冲-交换的蛋白通过透析（蛇皮TM d ialysis吨ubing）针对新鲜恢复缓冲，以除去所述过量的溶解MEK 。
浓缩液和缓冲液-在其最终储存/分析缓冲液或适当的缓冲液中交换蛋白质以进行额外的色谱步骤。
如数据分析部分所述分析血红素提取的功效。例如吸收光谱和所述的UV /可见光HPLC色谱小号taphylococcus黄色葡萄球菌血红素蛋白IsdH（铁表面行列式H，残基326 - 660）由MEK提取示于图5。

酸-丙酮沉淀
用时，此提取方法提供了最好的脱辅基蛋白质回收一个高浓度（〜1毫米的血红素的基础上）的蛋白和小体积。此协议是专为卷设计≤ 1.5米升。图 2 中的流程图描述了酸-丙酮沉淀法提取血红素的工作流程。第h emoprotein沉淀在冷酸-丙酮，并将结果荷兰国际集团的脱辅基蛋白沉淀，用另外的酸-丙酮，冷冻干燥，完全除去溶剂，并再溶解。

图 2. 酸-丙酮沉淀。感兴趣的蛋白质与冷酸-丙酮一起温育以沉淀蛋白质。结果荷兰国际集团脱辅基蛋白-含有固体沉淀，和含血红素的除去上清液。将沉淀冻干并重新溶解在选择的缓冲液中。将样品缓冲液-交换以除去任何残余的丙酮。使用BioRender.com创建的图形。

将酸-丙酮溶液预冷至 -20°C，将微量离心机转子预冷至 -10°C。
等分试样100 - μ升纯化血红素蛋白的级分1到5 -米升FISHERBRAND TM高级米icrocentrifuge吨ubes和在冰上孵育。保存15μ升全息-蛋白用于比较的前和后的酸含量血红素-丙酮沉淀。
添加1米升酸-丙酮到每个100 - μ升血红素蛋白和孵化的等分试样在-20℃下20分钟。孵育后应可见蛋白质沉淀。
离心机在微量的血红素蛋白/酸-丙酮混合物在21 ，000 ×克（RCF）为20分钟以沉淀沉淀的蛋白，并且然后滗析或移液管关闭的supernatan吨（见注8）。
重悬沉淀额外1米升酸-丙酮和重复小号TEPS乙3和乙4。
空气-干燥在室温下将蛋白质粒料30分钟。
将蛋白质重新溶解在 100 µl选择的缓冲液中。如果蛋白质不重新溶解到溶液中，继续小号TEPS乙8 -乙9 。如果在容易蛋白溶解，进行到小号TEP乙10。
滴定变性缓冲液到蛋白沉淀悬浮液，直到该沉淀不再可见。
透析针对所选择的缓冲器内的变性的脱辅基蛋白，在4℃下使用滑动-A-Lyzer最少4小时TM MINI d ialysis d evice，3.5 ķMWCO，0.5M升。
缓冲-交换的样品引入所述选择的缓冲器使用由离心过滤的Amicon ®超15 Ç entrifugal ˚F ILTER Ù NIT或对透析的选择FO的缓冲器为r的最小的4小时使用滑动-A-Lyzer，以除去过量的丙酮TM MINI d ialysis d evice，3.5 ķMWCO，2.0M升。
分析的血红素含量的萃取前后血红素蛋白，如在数据中所述甲nalysis部。通过酸-丙酮沉淀提取的 IsdH 的示例吸收光谱和 HPLC 色谱图如图 5 所示。

组氨酸标签血红素蛋白的柱上血红素去除
该协议是通用性高的，因为它可以在纯化组氨酸标记的血红素蛋白来执行，或者集成到粗的IMAC纯化，重组表达在澄清组氨酸标记的血红素蛋白Ê sherichia大肠杆菌BL21 （DE3）溶胞产物。在有利的情况下，其中全蛋白解折叠实现使用离液序列高的试剂，这种方法是最简单的执行，需要用于除去血红素与重折叠APO-蛋白的最高产量最少离散的步骤（表1）。图3描绘的必要从组氨酸除去血红素的步骤的方案-标记的血红素蛋白伴随纯化通过固定化金属亲和层析（IMAC）。柱子被平衡，六组氨酸标签的蛋白质粘附在树脂上，使缺乏组氨酸标签的蛋白质与感兴趣的蛋白质分离。血红素蛋白在仍与色谱柱结合的同时发生变性，破坏了形成血红素-蛋白质界面的二级和三级结构特征，从而使血红素分子通过离液剂和乙醇的二元混合物从感兴趣的蛋白质中剥离出来。最后，载脂蛋白在柱子上重新折叠并被洗脱。

图 3. 固定化金属亲和层析和血红素去除。描述了从异质蛋白质样品（棕色、黄色和绿色球体）中分离出带有 His 标签的血红素蛋白（红色球体）。去除血红素（红色方块）后，浅棕色溶液从柱中洗脱，载脂蛋白（灰色球体）重新折叠并洗脱以获得均质样品。该图是使用BioRender.com创建的。

通过在Thermo Scientific过滤所有缓冲器TM的Nalgene TM快速流量TM小号terile小号英格尔-u本身v acuum ˚F ILTER ü具有0.2μm的孔尺寸NIT ; 冷却至 4°C。
转印2.5米升HisPur TM Ç obalt ř ESIN或HisPur TM ñ ickel ř每升细胞培养物ESIN到DWK生命科学金布尔TM Kontes TM FlexColumn TM Ë conomy Ç olumn，或者，如果所述靶蛋白浓度是已知的，转移的最小量的树脂要充分结合的蛋白质。
平衡的用最少10个柱体积（CV）的平衡缓冲液的树脂。
将含有感兴趣蛋白质的澄清细胞裂解物转移到重力柱。
帽的色谱柱和密封它用Parafilm ®中号，以确保其不会发生泄漏。平衡，在4℃下在斯粘土的树脂和细胞裂解物Ñ utator米ixer 1105最少15分钟以最大化组氨酸标记的血红素蛋白与树脂结合。
将色谱柱放回站立位置，并在烧杯或试管中收集流经色谱柱的裂解物。
用 10 CV 平衡缓冲液清洗树脂。

作准备一个没有提取阴性对照（全息蛋白）测定血红素提取的功效，一个转移部分（12米升树脂结合的血红素蛋白的），然后跳到小号TEP Ç 12 。
暂停树脂在10 CV变性缓冲液使蛋白质变性，并允许一个5 -分钟的温育时间，以确保任何脱落蛋白的重新结合，通过该导入变性缓冲液（小号EE注9）。
洗脱变性缓冲液。由于溶剂化血红素的存在，这应该是浅棕色的。使用分光光度计记录血红素 Soret 峰的吸光度。从5的洗脱液的例子吸收光谱-米升IsdH的Ni-NTA柱制备示（“初始变性，”图4）。
洗用4树脂× 10 CV血红素洗涤缓冲液和监视ELU吃通过记录的这些步骤血红素含量的吸光度的血红素索雷峰使用分光光度计。重复洗涤步骤，直至ELU的血红素含量吃被最小化（见注10）。例如吸光度从5洗脱的血红素洗涤的光谱-米升IsdH的制备示（“血红素洗1 - 4”，图4）。

图 4. 洗脱血红素组分的紫外/可见光谱分析示例。从2 His-标记IsdH - L处的表达式培养物结合至5米升Ni-NTA树脂和柱上血红素去除率为p erformed 。初始变性用 50 ml变性缓冲液进行，血红素洗涤用 4 × 50 ml血红素洗涤缓冲液进行。显示了每个血红素去除洗脱的 UV/Vis 光谱，血红素逐渐减少（λ Soret = 385 - 405 nm）。

通过将树脂重新悬浮在 10 CV 平衡缓冲液中并孵育浆液 5 分钟，重新折叠结合的蛋白质。
洗脱平衡缓冲液并用额外的 10 CV 平衡缓冲液清洗树脂。
用 2 × 5 CV 高咪唑缓冲液清洗仍与树脂结合的任何蛋白质，并通过记录 A 280检查洗脱液的蛋白质含量。将≥ 50 µl 样品转移到UVette ®适配器内的Eppendorf ® UVette ® 中，并使用分光光度计记录280 nm 处的吸光度。
合并所需的洗脱蛋白质组分，并使用数据分析部分中描述的方法检查洗脱蛋白质的血红素含量。图 5 显示了通过柱上萃取制备的apo - IsdH 的示例吸收光谱和 HPLC 色谱图。
浓缩和缓冲-将蛋白质交换到其最终存储/分析缓冲液或适当的缓冲液中以进行额外的色谱步骤。

数据一nalysis

紫外/可见光对血红素去除效果的评价
将≥ 50 µl载脂蛋白转移到 UVette。
使用 UVette 适配器，在分光光度计中测量 A 280和 A Soret处的样品吸光度。在任一波长下，样品吸光度不应超过 1.5 AU。稀释的用缓冲液样品，如果超过该阈值。
紫外线/可见光数据的解释。
如果该对血红素的摩尔消光系数吸光度的特定蛋白结合的血红素的Soret（特异于结合于血红素，所述蛋白ε索雷以M -1厘米-1 ）和蛋白质骨架（实验确定的或由下式计算的蛋白质一级序列通过ε 280计算）已知：
QUANTI泰特的由A总血红素含量索雷使用比尔定律和蛋白质结合的血红素索雷的已知摩尔消光系数（小号EE注11）。b对应于比色皿的光程长度（以厘米为单位）：

孔定量泰特的由A总蛋白含量280使用比尔定律和感兴趣的蛋白质的理论或实验确定的摩尔消光系数。该等式使用上述步骤中计算出的浓度（见注释 12）说明了血红素在 280 nm 处的吸光度贡献：

计算的绝对血红素负载荷兰国际集团通过比较所述血红素含量萃取前后（图5甲，表1）：

如果在为消光系数的蛋白质结合的血红素和蛋白支架是未知的，血红素去除的相对效率能够通过比较来近似的脱辅基蛋白S与相应的全息蛋白（图5的ORET吸光度甲）。
测量的Soret用于全息蛋白和索瑞最大吸光度波长的脱辅基蛋白上的两个λ索瑞。
测量280针对全息蛋白和脱辅基蛋白正常化两者的索雷吸光度：

HPLC 对血红素去除的评价
孔定量泰特的由A HPLC样品的蛋白质浓度280使用Beer定律和所关注的蛋白质的理论或实验确定的毫摩尔消光系数。
稀释的样品以5 - 500μM中的选择和传输15的缓冲器微升至一个HPLC小瓶。
设置二极管阵列检测器来监视的吸光度用于蛋白质检测的280nm和在血红素的Soret波长（385 -对游离血红素405nm）的血红素的检测。如果需要，可以添加额外的波长。见注13 和 14。
将 C4 反相 HPLC 柱连接到 HPLC 并通过流动 12 ml 65:35 缓冲液 A：缓冲液 B（缓冲液 A =含有 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 的纳米纯 H 2 O）进行平衡；缓冲液 B = 含有 0.1% TFA 的乙腈）以 1 ml /min 的速度通过柱子。
将 10 µl样品注入C4 柱并使用针对您的蛋白质优化的方法进行分析。对于IsdH分析（图5乙），样品通过分析梯度洗脱在1.0米升与/分钟一个梯度程序（0 - 1分钟，35 - 35％B ; 1 - 30分钟，35 - 47.3％B ; 30 - 35 分钟，47.3 - 100% B ；35 - 36 分钟，100 – 100% B）。该方法改编自Samuel等人。( 2017) 。
确定了通过比较血红素去除相对程度的405nm的色谱图的蛋白质（图5B的载脂蛋白和holo-形式，表1 ）。整合的色谱图，并确定所述使用血红素除去功效的下面的等式（见注15）：

图5的测量的血红素含量。一个。的评价的通过UV / VIS血红素去除效力。显示了全息-IsdH （无提取）和载脂蛋白-IsdH（使用每个协议制备）的归一化吸收光谱，揭示了通过比较 A 405 /A 280确定的每个协议的相似程度的血红素去除。乙。使用HPLC评估血红素去除效果。在280nm（顶部）HPLC吸光度色谱用于评估的蛋白质含量和那些在405nm（底部）被用于确定所述样品的血红素含量。我们观察到与血红素相关的负 A 280峰。将R血红素的etention时间是类似于报道萨穆埃尔等人。( 2017) 。

表1. COMPA RIS邻˚F血红素é XT外消旋蒂奥Ñ米等豪d š至p重新p一个重新APO -Isd ħ
1个产量和％血红素去除被确定为2 L-规模大肠杆菌BL21（DE3）在Luria-BERTANI肉汤培养物的制剂补充有50 μ克/米升硫酸卡那霉素和1mM异丙基β-d-1硫代半乳糖苷（IPTG ) 。

验证的通过性测量APO-蛋白完整性
我们鼓励读者以确保该蛋白活性和褶皱都在保留重建或重折叠下列血红素提取中ñ 。鉴于酶活性的测量是蛋白特异性的，而不是概述了特定的程序，我们提供例如数据的compari的儿子由MEK萃取（原始公开的方法）制备的脱辅基IsdH活性和柱上血红素萃取。我们之前曾报道过 apo-IsdH 的停流活性测定，它可以从铁 (III)-血红蛋白中快速转移铁 (III) 血红素。该反应监测，因为在405nm处血红素吸光度的减少，血红素是从血红蛋白传送。IsdH的血红素转移活性以这种方式比较了通过 MEK 提取或柱上血红素提取制备的F365Y /A369 F （图 6）。既血红素提取方法得到的脱辅基IsdH与几乎相同的活动，并拟合速率常数（插图，图6），与先前公布的值是一致的（Sjodt等人。，2018）。这证明了新描述的用于制备活性载脂蛋白的柱上方法的可行性，其具有与通过更传统程序产生的相似的高保真度。

图6.测定来验证所述脱辅基IsdH的活性制备MEK或柱上血红素萃取。停流 UV/Vis 光谱测量监测在 5 µ M 血红蛋白突变体 0.1 与 50 µ M apo-IsdH F365Y/A369 F在 20 mM NaH 2 PO 4 、150 mM NaCl、0.45 中快速混合后 405 nm 处样品吸光度的相对变化M 蔗糖，pH 7.5 在 25℃。在一个bsorbance变化是使用监测的短0.2 -上厘米光程长度的设定的停止SX20 -流分光光度计（应用光物理TM ）。曲线代表的4次技术重复的平均值，与在用阴影部分表示标准误差。使用Graph P ad Prism 中的方程从曲线的二指数拟合计算速率常数（插图）。

笔记

保存裂解液和所有的流过位于HisPur洗TM ç obalt或ñ ickel [R ESIN。如果超过树脂的结合能力，一部分感兴趣的蛋白质将流过重力柱而没有结合。此外，在洗涤步骤中，具有不同特性的蛋白质可能会意外地从色谱柱上洗脱下来。
缓冲液可能需要针对感兴趣的蛋白质进行优化。如果蛋白质不不完全如此b在d到HisPur TM树脂，减少在平衡缓冲液的咪唑浓度的可补救该问题。镍-次氮基乙酸具有一个增加的耐受性，以更高的还原剂结合能力和展览。改变变性剂浓度或在变性缓冲液改变变性剂和血红素洗涤缓冲液可导致更完全的血红素除去与某些蛋白质。醇浓度和身份的优化（即，异丙醇）在变性血红素洗涤缓冲液也可导致更完全的血红素除去与某些蛋白质。
柱上血红素去除方案已成功用于以下组氨酸标签蛋白：肌红蛋白、S 。金黄色葡萄球菌IsdH、IsdB、IsdC 和 IsdA。对离液剂变性具有内在抗性的蛋白质可能需要对该方法进行修改。
血红素 Soret 峰波长根据铁的氧化态和配体而变化；因此，应小心以确保所述血红素含量在适当的波长监测。有关血红蛋白和肌红蛋白的 Soret 峰值波长列表，请参阅Antonini 和 Brunori ( 1971) 。
建议在合并馏分之前对通过 A 280确定含有蛋白质的任何色谱洗脱液进行 SDS-PAGE 分析，因为并非所有含蛋白质的馏分都含有感兴趣的蛋白质。
如果缓冲液交换或透析不充分，则在去除血红素后可能需要额外的蛋白质重折叠程序。有关重折叠协议的示例，请参阅Gennadios等人。( 2009) 。
运行的附加大小-甲基乙基酮萃取后排阻色谱法步骤，建议，因为聚集体可在提取和甲基乙基酮表现出相对高的混溶性含水缓冲液形成。
对于酸-丙酮沉淀，理想情况下离心机转子应冷却至 -20°C，但如果离心机无法冷却至 -20°C，则可以使用可用的最冷转子设置。
P rior prepara蒸发散表明更高的产率当柱被静置约5分钟用盐酸胍溶液，而不是允许其立即流过该柱。我们推测其这可能是由于在突然引入与氯化抗衡高离子强度溶液的是，虽然具有用于镍低亲和力2+ -NTA和Co 2+ -NTA ，米AY仍可能出现在足够高的浓度的竞争带有用于结合Ni 2+ -NTA 或 Co 2+ -NTA的六组氨酸标签。另一个合理的解释可能是盐酸胍溶液溶解了非特异性粘附在 IMAC 珠上的蛋白质。
执行在程序段C，步骤4中的四个离散洗涤描述的洗涤产率更有效的血红素去除比相同体积的单次洗涤（即。，4 × 50米升VS 。1 × 200米升）。
该计算假设样品中的血红素与其天然配位环境中的蛋白质及其原始三价铁（铁 III）氧化态结合。在变性和复性提取后，情况可能不再如此，非天然配位模式和替代氧化态会改变结合血红素的预期光谱特征。
血红素本身在 280 nm ( ε 280 = 18± 3 mM -1 cm -1在 20 mM NaH 2 PO 4 、0.15 M NaCl、pH 7.5 中）。A 280测量的蛋白质浓度应针对结合血红素的吸光度贡献进行校正，尤其是在 >10% 的蛋白质与血红素结合的情况下。
此处描述的 HPLC 方法在足够高的乙腈百分比下运行，以使Isd H变性；因此，单独的脱辅基IsdH和血红素峰在翻转观察-相色谱（图5乙）。这可能不是所有血红蛋白的情况。
在给定的分析条件下，我们能够可靠地检测低至 ~160 pmol (~100 ng) 的血红素。
定量的所述样品中的绝对血红素和蛋白质含量需要实验响应曲线绘制皮摩尔样品注入与积分吸光度在任280nm处（对于蛋白质主链）或λ索瑞（为血红素）。

食谱

平衡缓冲液
50 mM NaH 2 PO 4 (pH 7.5)
300 毫米氯化钠
10 mM 咪唑
组氨酸标签 Ulp1 SUMO 蛋白酶溶液
1毫克/米升组氨酸标记的ULP1蛋白酶
平衡缓冲液中的 50% v/v 甘油
高咪唑缓冲液
50 mM NaH 2 PO 4 (pH 7.5)
300 毫米氯化钠
300 mM 咪唑
MEK提取缓冲液
50 mM Tris HCl (pH 6.0)
恢复b uffer
500 mM Tris HCl (pH 8.0)
酸性丙酮
5 mM HCl 的丙酮溶液
变性缓冲液
50 mM NaH 2 PO 4 (pH 7.5)
300 毫米氯化钠
10 mM 咪唑
6 M 盐酸胍
血红素洗涤缓冲液
80% 变性缓冲液
20%乙醇

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院 (AI52217) 的资助；国家科学基金会（MCB-1716948）；和能源部科学办公室、生物与环境研究办公室，奖励编号为 DE-FC02-02ER63421。JS 得到了美国国立卫生研究院 NIGMS 资助的博士前奖学金 (T32 GM136614) 的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

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