材料和试剂

pSMT3 质粒（Sanyal等，2015）
氨苄青霉素（AMRESCO，目录号：0339-100G）
卡那霉素（Fisher Bioreagents，目录号：BP906-5）
异丙基对 D 硫代半乳糖苷（IPTG）（Fisher Bioreagents，目录号：BP1755-10）
液体肉汤（LB）（Fisher B ioreagents，目录号：BP1426500）
甘油（费希尔- [R eagents，目录号码：BP229-4）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma - Aldrich，目录号：p7626-25g）
的Amicon超4离心过滤装置（Sigma-Aldrich公司，Ç atalog数：UFC 805024）
液氮
大肠杆菌（E.coli ）BL21（DE3）（Strategene，目录号：200131）
10％的Mini-PROTEAN ® TGXTM预制蛋白凝胶（Bio-Rad实验室，目录号：456-1033）
甲denosine -5'-三磷酸[γ- 32 P]仪（Perkin - Elmer）中
考马斯染色（AMRESCO，目录号：0472-25G）
二硫苏糖醇（DTT）（Alfa Aesar，目录号：A15797）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-10）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M 3148-250ML）
Tris（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I2399-500G）
Eppendorf Microcentrifuge（Fisherbrand，目录号：Q5-408-129）
硝酸纤维素膜（Thermo Fisher Scientific，目录号：88018）
单克隆抗多组氨酸抗体（Sigma-Aldrich，目录号：H1029-5ML）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284-500ML）
琼脂糖（AMRESCO，目录号：N605-500G）
Bacto a gar（Beckmon，Dickson and Company ，目录号：214010）
六水氯化镁（Alfa Aesar，目录号：12288）
四水氯化锰（Sigma-Aldrich，目录号：M3634-500G）
原钒酸钠（MP Biomedicals，目录号：159664）
[γ- 32 P]放射性ATP（Perkin - Elmer，目录号：BLU502A100UC）
牛血清白蛋白（Fisher Bioreagents，目录号：BP1605-100）
Tween 20（Bio - R ad Laboratories，目录号：1706531）
IRDye ® 680LT 山羊抗小鼠 IgG 二抗（部件号：926-68020）
λ蛋白磷酸酶（New England Biolabs，目录号：P0753S）
重组蛋白
使用限制酶克隆将WT海兔 cortactin 和单个酪氨酸突变体作为全长 N 端 His 6 -SUMO 融合体亚克隆到 pSMT3 表达载体中（Ren等，2019）。
注意：皮层蛋白突变蛋白被表示为YFF，FYF，和FFY其中酪氨酸其中三个推定的酪氨酸残基（Y499，Y505，和Y509），分别突变为苯丙氨酸到测试，在海兔皮层蛋白是在体外优选磷酸化位点与之前在体内神经元生长锥中观察到的相比。FFF 是三重酪氨酸磷酸化缺陷突变体。
Src2 激酶 (Src2) 和酶促失活的显性失活 Src2 (DNSrc2) 克隆到具有 N 端 His 6标签的pET-Duet 中（Ren等，2019）。
GST 标记的截短的 YopH 磷酸酶在 N 端缺失 184 个残基，并且在来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的第 235 位用Arg 代替 Ser，克隆到质粒 pT7-7（YopH）（Zhang等，1992）；由加州大学圣地亚哥分校的 Jack Dixon 提供。
注意：所有质粒均可根据相应作者的要求提供。
用于 SDS-PAGE 的蛋白质样品缓冲液（内部制造；参见食谱）
液体LB培养基
实心LB板
库存准备（见食谱）
1 M IPTG
1,000 ×卡那霉素原液
1,000 ×氨苄青霉素原液
缓冲液制备（见配方）
裂解缓冲液
洗涤缓冲液
洗脱缓冲液
证券交易委员会缓冲区
激酶缓冲液
上样缓冲液
10 ×传输缓冲器
1 × Tris 缓冲盐水，0.1% Tween ® 20 去污剂 (TBST)
5% BSA
1 ×传输缓冲器

设备

注意：可以使用替代但等效的设备。
4-L Erlenmeyer 烧瓶（Avantor VWR，目录号：10545-846）
UV / VIS分光光度计（Beckman Coulter公司，米Odel等：DU 350）
冷藏台式离心机（Beckman Coulter，型号：ALLEGRA X-14R）
ÄKTA Purifier 色谱系统（GE Healthcare，型号：ÄKTA Pure）
高-高速离心机（Beckman Coulter公司，型号：阿凡提JE）
能够旋转 250 毫升瓶子的转子（Nalgene，目录号：3120-1000）
Shaker 培养箱（New Brunswick，型号：Innova ® 43）或可设置在 37°C 的等效培养箱
冰水浴（VWR International，型号：1225PC）
移液器（Rainin）
Hiload 16/600 Superdex 200 PG 柱（GE Healthcare，目录号：28-9893-35）
PCR仪（Thermo Fisher Scientific，型号：Mastercycler）
DNA琼脂糖凝胶成像设备（紫外透照仪）
Sonicator （Branson Sonic Power Co.，型号：细胞破坏器 350）
Odyssey 成像系统（LI-COR，Biosciences，Lincoln，NE）
带电源的 SDS-PAGE 装置（Bio - R ad Laboratories）
微波
本生灯
Typhoon 磷光成像仪（FLA 9500，GE Healthcare）
ImageQuant TL 软件（GE Healthcare）

程序

将质粒转化为感受态大肠杆菌细胞
Obtai Ñ野生-型（WT）或突变型质粒和感受态BL21的解冻新鲜制备的等份（DE3）细胞，同时在冰上。
将 2 µl (75-100 ng) 的质粒 DNA 添加到 50-100 µl 的化学感受态细胞中。
通过轻弹调匀每个管和然后PLAC荷兰国际集团在冰上管10分钟。
传送管小号到水浴组在42℃下45-60秒至确保该质粒DNA通过摄取大肠杆菌细胞。
热休克后，将混合物在冰上放置 5 分钟，然后加入 800 µl 室温 LB 培养基。
注意：不应在培养基中添加抗生素。
在 37 °C 下孵育管子，同时摇晃 1小时，让细菌表达抗生素抗性蛋白。
1小时后，将 50-100 µl 转化细胞涂在补充有抗生素的固体 LB 培养基上。
通过在 37 °C 下过夜孵育板来允许菌落生长（图 2a）。

蛋白质表达和纯化
如上所述，将激酶（Src2 或 DNSrc2；pET-Duet）、yopH（pT7-7）以及 His 6 -SUMO 融合 WT cortactin 或突变体（pSMT3）转化为大肠杆菌BL21-DE3 感受态细胞。
注意：每个 pET-Duet、His 6 -SUMO 融合和 GST 融合构建体必须分别转化为感受态细胞。
挑取单菌落的大肠杆菌大肠杆菌用表达质粒转化的BL21细胞和接种10毫升含LB培养基的50微克/毫升卡那霉素（用于pSMT3）或100μg/ ml氨苄青霉素（为或pT7-7中的pET-二重奏）（图2a)。INCU贝特的在37过夜细菌培养℃，同时摇动。
第二天，将 10 ml 起始培养物转移到 1 升含有 50 µg/ml 卡那霉素 (pSMT3) 或 100 µg/ml 氨苄青霉素（pT7-7 或 pET-Duet）的 LB 培养基中。
注意：1 ml 过夜培养物可用于制作 25% 甘油原液，并用于后续的蛋白质表达，以节省时间和资源。
允许大培养物，同时以200rpm振荡在37生长℃下的光学密度（OD 600nm的0.6和0.9（3-4之间）h）中，和然后诱导表达用IPTG至0.4的终浓度MM（图2b ）。
在 37 °C摇动的同时，将诱导培养物再培养 4 小时。
为了消除细菌激酶对诱导蛋白的磷酸化，将 YopH 磷酸酶培养物与过度表达cortactin 或激酶（Src2 或 DNSrc2）的培养物分别以 1:1 和 1:2 的比例相结合（图 2b）。
通过在 7500-8 、000 × g 、4 °C下离心5-10 分钟来收获细胞。
闪光冻结并存储所述粒料在-80 ℃下直到需要。

使用 YopH 磷酸酶裂解和共纯化预磷酸化蛋白质
重悬在含50 prephosphrylated蛋白质和YopH细菌沉淀米升裂解缓冲液（见ř ecipe小号），补充有5毫PMSF蛋白酶抑制剂。
通过在冰上以 30% 的占空比（连续设置 30 秒，休息 1 分钟）超声 4 分钟来裂解细胞。
转移的裂解物以50μm的升的离心瓶中。隔离的由在纺丝可溶级分27000 ×克在4 35-40分钟℃下（图2c）。
将澄清的裂解液加载到装有 4 ml 钴树脂的n平衡重力流柱上。为了完成他的6标记蛋白与钴树脂的结合，在 4 °C 下轻轻摇动1 小时。
洗的树脂两次15-20米升洗涤缓冲液，并然后洗脱的，使用洗脱缓冲液兴趣蛋白质（见ř ecipe小号）储存在4 ℃下。
通过 10% SDS-PAGE评估蛋白质的纯度。
为确保 cortactin 纯度，进一步将洗脱的 cortain 分数置于 SEC 缓冲液中的尺寸排阻色谱 (SEC)，储存在 4 °C 。转移的洗脱的蛋白质上以1的流速使用AKTA纯系统的HiLoad一个六百分之十六的Superdex 200 pg柱米升/分钟（图4a和图4 b ）。
注意：280 nm 处的波长可用于监测使用 UNICORN 软件记录的蛋白质洗脱曲线和色谱图。
池的使用基于SEC色谱和浓缩物的峰部分Ñ的Amicon超4浓缩器（60 kDa截止）于4冷藏台式离心机℃下。
确定的分光光度法在280nm和/或通过总蛋白浓度乙雷德福测定的级分，并在595测量吸光度纳米。海兔皮层蛋白的消光系数为55 ，810中号-1厘米-1 ，和其预测的分子量为100 kDa的。
确认了通过10％SDS-PAGE和western印迹纯度婷（图3A）。快速冷冻等分的蛋白质并储存在-80 °C以进行进一步的下游实验。

图2 。Cortactin 重组蛋白表达和共纯化过程的实验概述。此过程中描述的整个实验步骤的流程图。预磷酸化蛋白（Cortactin 或 Src）在存在 YopH 磷酸酶的情况下共同纯化，然后进行顺序亲和和尺寸排阻色谱 (SEC)。

图3.野生的重组表达-型海兔皮层蛋白和Src激酶E.大肠杆菌。( A)亲和的SDS-PAGE 凝胶-纯化的WT cortactin 与 YopH 磷酸酶共纯化。在S充足显示小号皮层蛋白迁移作为对应于95千道尔顿的皮层蛋白的分子量和较低分子量的污染物的暗带的主要条带promp吨荷兰国际集团的需要为进一步普里fication通过SEC。( B) 用 4F11 单克隆 cortactin 抗体和单克隆抗 His 抗体对样品进行免疫染色证实了海兔His 6标记的 cortactin的异源表达。His6 标记的显性负性 Src2 激酶 (DNSrc2) 用作两种条件的对照。

图4 。大小排阻色谱 (SEC) 后野生型 cortactin 和突变体的纯化概况。（A）皮层蛋白的细菌表达和亲和纯化的，重组的WT和酪氨酸磷酸化的突变体的代表性洗脱色谱（YFF，FYF，FFY，和FFF）（见中号aterials和- [R eagents部约突变体的详细信息）。55 ml 洗脱体积的单峰对应于 cortactin。85 和 130 ml 处的较小峰代表低分子量污染物。WT cortactin 还在 45 ml 处显示出第二个小峰，这可能代表潜在的寡聚形式。（B）考马斯染色的WT和在A中的SEC峰该图从图适配的55毫升洗脱体积收集皮层蛋白突变蛋白的凝胶URE 5A和图5中的B我们以前的出版物（仁等人，2019 ) 。

使用特定抗体验证cortactin 表达
获得纯化的 WT cortactin 或突变体 (pSMT3)，并通过 SDS-PAGE 在 10% 凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。
白蛋白溶于TBST阻断与5％牛血清的膜（参见ř ecipe小号）中30分钟，在室温下。
探针的与所述第一抗体印迹抗皮层蛋白（4F11）（仁等人，2019）或抗His，在室温下2小时。
用 TBST 洗涤后，将膜与山羊抗小鼠 680 抗体在室温下孵育 30 分钟。
用 TBST 对膜进行大量清洗后，使用 Odyssey 成像系统检测信号（图3B ）。

通过 Src2 评估 cortactin 磷酸化的体外激酶测定
注意：此程序使用放射性物质，应小心处理。请查阅您所在机构的辐射指南，以确保您有权从事放射性工作。穿戴适当的个人防护装备 (PPE)，牢记接触会导致有害影响。
准备的加入2磷酸化反应微克SEC的共纯化的His 6 -SUMO标记的WT或用0.2突变体皮层蛋白微克SRC2或DNSrc2。此外，单独使用WT Src2 和 DNSrc2进行反应以评估作为对照的自磷酸化（见图 5）。
在冰上孵育激酶反应缓冲液中的蛋白质（20 µl 等分试样）。
发起所述加入2.5激酶反应居里[γ-32P] ATP。在 30 °C 下孵育 20 分钟。
加入 5 µl 4x SDS PAGE 上样缓冲液以淬灭反应。
分离的样品在10％聚丙烯酰胺凝胶，及图像的通过自动radiograpy或通过使用荧光体台风成像器（图样本小号5和6 ）。

图5 。用 YopH 磷酸酶处理使 cortactin的功能表征成为 Src2 的靶标。( A) 非特异性磷酸化抑制了Src2在体外磷酸化 cortactin的能力。代表放射自显影和相应的考马斯染色的凝胶在体外示出了当没有磷酸化信号激酶反应的WT皮层蛋白在30与SRC2孵育℃下。在存在和不存在磷酸酪氨酰磷酸酶抑制剂Na 3 VO 4 的情况下，同时用市售磷酸酶处理该反应；该结果表明没有磷酸化特定的信号。已知的细菌激酶（hpSEAA）用作一个阳性对照; 这里没有使用抑制剂或磷酸酶。（B）放射自显影和相应考马斯染色的代表性的凝胶在体外激酶反应表示YopH的共纯化消除从蛋白质残余ATP ，从而显示出其海兔皮层蛋白是SRC2激酶的直接底物在体外。显性阴性 Src2 (DNSrc2) 未能磷酸化 cortactin。

图6 。共纯化海兔蛋白与YopH允许所述的通过在SRC2皮层蛋白的磷酸化模式的差异可视化在体外。放射自显影的代表性的相应考马斯染色的凝胶在体外激酶反应表示的由活性SRC2或酶促死显性负DNSrc2 WT或突变体皮层蛋白的磷酸化。显示了对应于磷酸化 Src2 ( ~ 65 kDa) 和磷酸化 cortactin (95 - 110 kDa 双峰) 的条带(Ren et al. , 2019) ；看到的对材料和试剂部关于每个构建体的详细信息。与活神经元相比，Y499 的磷酸化似乎具有最显着的表型效应，体外激酶数据表明 Y505 优先被磷酸化。该图是从图适于URE 5C在我们以前的出版物（仁等人，2019）。

食谱

蛋白质表达培养基的制备
液体LB培养基
d issolv Ë 20克LB肉汤成1大号超纯水。高压灭菌，让混合物冷却，然后加入所需的抗生素。
实心LB板
d issolv Ë 15克细菌琼脂（Becton Dickinson公司公司制造）成1个大号LB肉汤。一旦培养基被高压灭菌并冷却，加入抗生素并将混合物倒入培养皿中。储存在 4 °C以备将来使用。

库存准备
1 M IPTG（IsoPropyl-1-Thio-β-D-吡喃半乳糖苷）
称取 2.38 g IPTG 并溶解在 10 ml 无菌水中。储存在-20°C
1,000 ×卡那霉素储备液（50 mg/ml 储备液）
称取 0.5 g 卡那霉素并将其溶解在 10 ml 无菌水中。储存在-20°C
1,000 ×氨苄青霉素储备液（100 mg/ml 储备液）
称取 1 g 氨苄青霉素并将其溶解在 10 ml 无菌水中。储存在-20°C

缓冲液制备
裂解缓冲液
50 mM Tris pH 8.0
300毫米氯化钠
20 mM 咪唑
5 mM β-巯基乙醇 (BME)
0.5% 海卫 X-100
10% 甘油，4 °C 保存
洗涤缓冲液
50 mM Tris pH 8.0
300毫米氯化钠
20 mM 咪唑
5 mM BME，在 4 °C 下储存
洗脱缓冲液
100 mM Tris pH 8.0
150毫米氯化钠
300 mM 咪唑
10% 甘油，4 °C 保存
证券交易委员会缓冲区
100 mM Tris pH 8.0
150毫米氯化钠
激酶缓冲液
50 mM Tris pH 7.5
5毫米氯化镁2
5毫米氯化锰2
1毫米 DTT
0.25 mM 原钒酸钠（可选）
上样缓冲液
1430 万比特币
1 M Tris-HC l pH 6.8
1.0克 SDS
0.1% 溴酚蓝
4米升100％甘油
用 H 2 O调至 10 毫升
TBS 缓冲液
24.2克 Tris 碱
80克氯化钠
溶于1 L diH 2 O
10 ×传输缓冲器
30.3克 Tris 碱
144克甘氨酸
添加 1 L H 2 O
1 × Tris 缓冲盐水，0.1% Tween ® 20 去污剂 (TBST)
100毫升 10 × TBS
1毫升吐温 20
添加900米升ħ 2 ö
5% BSA
将 2.5 g BSA溶解在 50 ml 1 × TBST 缓冲液中
1 ×传输缓冲器
200毫升甲醇
100 ml 10 ×转移缓冲液
添加 700毫升 H 2 O

致谢

SM 得到了 NIH (R01-GM10092) 的资助。SLB 得到了美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所的支持，奖励号为 T32AI148103，并获得了普渡大学生物化学系的鸟楼梯研究生奖学金。DMS 得到了美国国家科学基金会 (1146944-IOS) 和普渡研究基金会的资助。

利益争夺

笔者小号声明，没有竞争的利益存在。

参考

Abbasi, NA, Lafci, D. 和 Akan, OB (2018)。通过体内神经系统控制信息传输。科学报告8(1): 2298。
Ammer, AG 和 Weed, SA (2008)。Cortactin 分支：在调节突出肌动蛋白动力学中的作用。细胞运动细胞骨架65(9): 687-707。
Chédotal , A. 和 Richards, LJ (2010)。连接大脑：神经元指导的生物学。Cold Spring Harb Perspect Biol 2(6)：a001917。
Decourt, B., Munnamalai, V., Lee, AC, Sanchez, L. 和 Suter, DM (2009)。Cortactin 与丝状肌动蛋白共定位，并在海兔生长锥中的 IgCAM 粘附位点积累。J Neurosci Res 87(5): 1057-1068。
Dent, EW, Gupton, SL 和 Gertler, FB (2011)。轴突生长和引导中的生长锥细胞骨架。Cold Spring Harb Perspect Biol 3(3)。
恩格尔，欧共体（2010 年）。轴突引导的人类遗传病。Cold Spring Harb Perspect Biol 2(3)：a001784。
Goodman, CS 和 Shatz, CJ (1993)。产生精确的神经元连接模式的发育机制。细胞72 增刊：77-98。
He, Y., Ren, Y., Wu, B., Decourt, B., Lee, AC, Taylor, A. 和 Suter, DM (2015)。Src 和 cortactin 促进生长锥中的片状伪足突起和丝状伪足的形成和稳定性。分子生物学细胞26(18)：3229-3244。
Helgeson, LA 和 Nolen, BJ (2013)。cortactin 和 N-WASP 协同激活 Arp2/3 复合物的机制。Elife 2：e00884。
Karra, AS, Stippec, S. 和 Cobb, MH (2017)。用放射性标记的 ATP 测定蛋白激酶活性。J Vis Exp (123) : 55504。
Kolodkin, AL 和 Tessier-Lavigne, M. (2011)。神经元布线的机制和分子：入门。Cold Spring Harb Perspect Biol 3(6)：a001727。
情人，DM (2008)。大脑中的通信网络：神经元、受体、神经递质和酒精。酒精资源健康31(3): 196-214。
Lowery, LA 和 Van Vactor, D. (2009)。秘诀之行：了解生长锥机械。Nat Rev Mol Cell Biol 10(5): 332-343。
Ren, Y., He, Y., Brown, S., Zbornik, E., Mlodzianoski, MJ, Ma, D., Huang, F., Mattoo, S. 和 Suter, DM (2019)。cortactin 中的单个酪氨酸磷酸化位点对于神经元生长锥中丝状伪足的形成很重要。分子生物学细胞30(15)：1817-1833。
Sanyal, A., Chen, AJ, Nakayasu, ES, Lazar, CS, Zbornik, EA, Worby, CA, Koller, A., Mattoo, S. (2015)。Fic（由 cAMP 诱导的成丝）介导的腺苷酸化/AMPylation 与未折叠蛋白反应之间的新联系。J Biol Chem 290(13):8482-99。
Schnoor, M.、Stradal, TE 和 Rottner, K.（2018 年）。Cortactin：多面肌动蛋白结合蛋白的细胞功能。趋势细胞生物学28(2): 79-98。
Shrestha, A.、Hamilton, G.、O'Neill, E.、Knapp, S. 和 Elkins, JM（2012 年）。分析在细菌表达过程中影响人类激酶自磷酸化的条件。蛋白质 Expr Purif 81(1): 136-143。
Suter, DM 和 Forscher, P. (2000)。底物-细胞骨架偶联作为调节生长锥运动和引导的机制。J Neurobiol 44（2）：97-113。
Tehrani, S.、Tomasevic, N.、Weed, S.、Sakowicz, R. 和 Cooper, JA (2007)。cortactin 的 Src 磷酸化增强了肌动蛋白组装。Proc Natl Acad Sci USA 104(29): 11933-11938。
神经细胞通讯的原理。(1997)。酒精健康资源世界21(2): 107-108。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6826821/。
Vitriol, EA 和 Zheng, JQ (2012)。生长锥在空间和时间中旅行：细胞骨架、粘附和膜的细胞集合。神经元73(6)：1068-1081。
Zhang, ZY, Clemens, JC, Schubert, HL, Stuckey, JA, Fischer, MW, Hume, DM, Saper, MA 和 Dixon, JE (1992)。重组耶尔森氏菌蛋白酪氨酸磷酸酶的表达、纯化和理化表征。J Biol Chem 267(33)：23759-23766。
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