材料和试剂

1.5 ml Eppendorf 管（Eppendorf，目录号：11.3817.01）
玻璃移液管
显微镜载玻片（Thermo Scientific，目录号：11950657 ）
盖玻片小号（VWR，目录号：43211.KG）
塑料滴管（VWR，目录号：AMP-30）
铝箔
液体ñ itrogen
丙酮（Millipore，目录号：1.00014.1011）
罗丹明鬼笔环肽（Invitrogen，目录号：219920-04-4）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：646377-1L）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A7906-100G）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
DAPI（Invitrogen，目录号：D1306）
琼脂糖（Promega，目录号：V3125）
M9缓冲液（小号EE食谱）
洗涤缓冲液（见配方）
M9 中的 2 µg/ml DAPI（参见配方）
2 % (w/v) 琼脂糖（见配方）

设备

蠕虫培养的标准设备（见Brenner ，1974）
离心机（Eppendorf，Centrifuge 5424）
SpeedVac 真空浓缩器（Labogene，Speed Scan 40）
实验室通风柜
Leica SP8 共聚焦显微镜（支架：立式 Leica DM6 CS；照明：Lumencor Sola SM II LED，激光；软件：LAS-X；相机：DFC 7000 GT（黑白）；物镜：HC PL APO，63 × /1.40油, DIC POL 0.14)

软件

斐济（Schindeli Ñ等人。，2012 ）

程序

在 NGM 琼脂板上培养 50 条蠕虫。每盘 50 个蠕虫作为一个复制品
注：该协议将任意数量的50和100之间的蠕虫工作，我们建议我们荷兰国际集团2个重复每个实验条件。

从琼脂平板中取出蠕虫
洗涤蠕虫关的使用1板毫升M9的缓冲液，然后放置一个1.5溶液毫升Eppendorf管中。
注：我们建议retriev荷兰国际集团使用玻璃吸管，从而降低对吸管的墙壁虫的附着板M9的解决方案。
在离心机中短暂旋转以沉淀蠕虫而不是细菌（不要超过 400 × g ）；10秒是足以沉淀成虫。
使用微吸液管尽可能多的上清液尽可能除去（1 ，000微升和200微升）。
注意：C. elegans 倾向于游泳，所以颗粒不稳定；避免将移液器的尖端太靠近颗粒，以防止吸入任何蠕虫。
从1至3再一次重复步骤连接确保所有的蠕虫从板检索。
将 Eppendorf 管浸入液氮中，快速冷冻蠕虫。
注意：在这个阶段，蠕虫可以在 -80°C 下储存数月。

蠕虫透化
打开 Eppendorf 管并将其放入 SpeedVac 真空浓缩器中，在 20°C 下干燥蠕虫颗粒。此步骤通常需要约10分钟，但可以根据变化的量是从左上清液小号TEP B3。
在干燥的蠕虫中加入三滴冰冷的丙酮。轻轻敲击 Eppendorf 管五次。
注：我t是重要的，以覆盖所有的蠕虫; 如有必要，可以使用额外的丙酮滴。如果蠕虫没有正确渗透，该协议将失败。
在室温下孵育 5 分钟。
使用微吸液管除去不亚于丙酮作为可能的（1 ，000微升和200微升）和空气干燥在实验室通风橱的剩余丙酮。
丙酮完全蒸发后，蠕虫可在 -20°C 下保存数月。

鬼笔环肽染色
注：我们建议的工作ING在黑暗的环境，防止毒伞素降解和协议随之失效。
地方 2 。在 Eppendorf 管中加入5 U（每个重复）罗丹明鬼笔环肽。
使用 SpeedVac 真空浓缩器去除溶解有罗丹明鬼笔环肽的甲醇。
注意：我吨花费〜5-10分钟以干燥罗丹明鬼笔环肽，但根据所使用的体积此变化。
将干燥的罗丹明鬼笔环肽重悬在 20 µl（每次重复）的 M9 中。
向干燥的蠕虫中加入 20 µl M9 重悬的罗丹明鬼笔环肽。轻轻敲击 Eppendorf 管五次。
在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。
用1 ml 洗涤缓冲液洗涤蠕虫两次。
如果不需要细胞核染色，请继续执行程序F。

DAPI染色
注：我们建议的工作ING在黑暗的环境，以防止DAPI降解。
重悬蠕虫20 μ升2的μ微克/毫升DAPI在M9。轻轻敲击 Eppendorf 管五次。
在室温下在黑暗中孵育5 分钟。
用 1 ml洗涤缓冲液洗涤蠕虫两次。

用于成像的蠕虫的制备
注：我们建议的工作ING在黑暗的环境，以防止荧光染料的降解和随之而来的failur协议电子。
将蠕虫悬浮在 10 µl M9 中。
为每个复制品在显微镜载玻片上准备2 % (w/v) 琼脂糖垫。Ť ø制备琼脂糖垫，上应用实验室胶带2个的显微镜载片，并把第三个在它们之间（图1a）。使用微量移液管 ( 1 , 000 µl )在未包裹在胶带中的显微镜载玻片中心滴入 2-3 滴琼脂糖。将另一张显微镜载玻片放在琼脂糖的顶部（图 1b）。等待1-2分钟为琼脂糖索利二Fy和除去顶部上的显微镜载玻片上。使用前将琼脂糖垫存放在潮湿的地方以防止干燥。
注意：Ó NE带的层是足以产生所需的琼脂糖垫的形成的空间中。切开微移液器尖端，以方便琼脂糖的分配。轻轻地将最后一张显微镜载玻片放在液体琼脂糖上，以避免在琼脂糖垫中形成气泡。

图 1.琼脂糖垫制备。用于制备步骤F2 中描述的琼脂糖垫的第一 (a) 和第二 (b) 步骤。

使用玻璃吸管将所有含有蠕虫的 M9 转移到琼脂糖垫上。
应用盖玻片，避免气泡的形成。M9 的表面张力将在成像过程中保持盖玻片稳定，但避免接触它。

使用共聚焦显微镜成像
注：我们建议不要我们ING倒置显微镜在成像过程中保持盖玻片稳定。

图像分析
使用斐济打开图像RECO [R与共聚焦显微镜DED 。
添加比例尺：“分析”->“工具”->“比例尺” （图2）。

图 2.鬼笔环肽染色应用以及与 GFP 标记的肌肉纤维的比较。(a) 第 1 天成年 N2 蠕虫的代表性图像；用罗丹明-鬼笔环肽染色的红色肌动蛋白丝；蓝色，细胞核被 DAPI 染色。(b)与之前描述的年轻（第 1 天）蠕虫相比（Romani等，2021），第 11 天的成年 N2 蠕虫呈现出杂乱无章的肌肉纤维，通过罗丹明-鬼笔环肽染色（红色）在此处可视化。Ť HESE结果比得上那些获得使用转基因蠕虫菌株（RW1596），其中肌纤维GFP标记（绿色）。（C）若丹明鬼笔环肽染色的可诱导的肌肉proteotoxicity模型，GMC101，揭示š相比于对照菌株CL2122改变的肌纤维形态，一致与老少蠕虫所获得的数据和之前描述为（麦科尔等人，2012 ) 。比例尺, 10 µm ; 放大倍数，63 × .

食谱

NGM 琼脂平板（见Brenner ，1974 ）
M9缓冲液（Ť能够1 ）

表1 。M9缓冲液组成。大号组分和体积为北京时间1大号的工作股票。
注：˚F ILTER使用前。
洗涤缓冲液
M9 1毫升
BSA 50 毫克
Tween-20的50 μ升
M9 中的 2 µg/ml DAPI
为了使有5毫克/米升DAPI原液溶解一个小瓶（10毫克）在2米内容升的水。对于长期储存，可以将原液分装并储存在≤ - 20 ℃。对于短期储存，该溶液可保持在 2 - 6 °C ，避光。
2% (w/v) 琼脂糖
溶解500毫克的GARO本身在25ml瓦特的亚特。
注：w ^胳膊解决接近沸点温度，以溶解琼脂糖。我们建议在此步骤中使用微波炉。

致谢

JA 实验室的研究得到了 EPFL、欧洲研究委员会 (ERC-AdG-787702)、瑞士国家科学基金会 (SNSF 310030B_160318 和 31003A_179435)、韩国国家研究基金会 (GRL 2017K1A1A2013) 和 1 de Recherche sur les Maladies Musculaires (FSRMM) 和基金会 Marcel Levaillant。达米科等人。(2019) , Romani等。(2021) 和Sorrentino等人。（2017）采用这种方法进行染色和visualiz荷兰国际集团的肌纤维在秀丽隐杆线虫。

利益争夺

该作者没有利益冲突的声明。

参考

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