材料和试剂

耗材
试管（Fisherbrand，目录号：14-961-34，或同等产品）
标准无菌血清移液管（2、5、10 和 25 毫升）
微量移液器吸头（1,000-100 µl、200-20 µl、20-2 µl 和 2.0-0.1 µl）
100 × 15 mm 培养皿（VWR，目录号：25384-088 或同等产品）
15 和 50 ml 离心管（Corning，目录号：分别为 430766 和 430291，或等效物）

培养基和生长条件
标准粟酒最低谷氨酸 (PMG) 培养基，pH 5.6，必要时添加 250 mg/L 的腺嘌呤、尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸和赖氨酸（Sabatinos 和 Forsburg，2010）。Bacto 琼脂应以 2% (w/v) 的终浓度添加以制备固体琼脂培养基。Leu-PMG 培养基含有除亮氨酸外的所有补充剂。按照方法中的规定添加硫胺素。必须在高压灭菌后将培养基冷却至 45-50°C 后加入硫胺素，以制备含硫胺素的 PMG 琼脂培养基。

基本 pTIN 系统载体 pTIN 和 pTIN7m 可从以下网址获得：https ://www.addgene.org/Stewart_Shuman 。
锡编号#162885
pTIN7m 编号#162886
您的 GOI 可以克隆到这些载体中并从这些载体中过度表达。

腺嘌呤（Sigma，目录号：A2786）
尿嘧啶（目录号：U0750）
亮氨酸（Fisher，目录号：BP385-100）
组氨酸（Sigma，目录号：H5659）
赖氨酸（Fisher，目录号：BP386-100）
Bacto琼脂（BD，目录号：214010）
盐酸硫胺素（Sigma，目录号：T1270）
Bacto琼脂（BD，目录号：214010）

酵母感受态细胞和转化
Tris 碱（Fisher，目录号：BP152）
EDTA（Sigma，目录号：E5134）
醋酸锂（LiOAc）（Sigma，目录号：L4158）
PEG 3350（Sigma，目录号：P4338）
甘油（Fisher，目录号：BP229）
三文鱼精子DNA（ssDNA）（Sigma，目录号：D1626）
LiOAc-混合物（见食谱）
PEG-混合物（见食谱）
50% 甘油/LiOAc 混合物（见配方）
三文鱼精子 DNA (ssDNA) 溶液（见食谱）
2,000×硫胺盐酸盐（见配方）

设备

孵化器摇床（New Brunswick Innova 44 或同等产品）
微量移液器（1,000-100 µl、200-20 µl、20-2 µl 和 2.0-0.1 µl）
标准玻璃锥形瓶（培养体积不应超过烧瓶体积的一半）
孵化器（Nuaire IR autoflow 或同等产品）
试管滚轮（新不伦瑞克，TC-7 带 25 毫米试管架或同等产品）
微量离心机（Eppendorf 5425 或同等产品）
微量离心管（Crystalgen，目录号：L-2052 或等效物）
玻璃珠（Fisher Scientific，目录号：11-312C 或等效物）
冷却离心机（Thermo Scientific Sorvall BP8 与 HAEMAFlex 6 摆斗转子或同等产品）
离心瓶（Thermo Scientific，目录号：3120-0250 或同等产品）

程序

长期储存酵母感受态细胞的产生：
在补充有亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、腺嘌呤和尿嘧啶的 PMG 培养基中在 30°C 下培养 100 ml 亮氨酸营养缺陷型裂殖酵母菌株，直至它们达到对数中期至后期（A 600 0.5 至 0.9）。使用每分钟 220 转的振动条件。
注意：细胞必须在缺乏硫胺素的培养基中生长。不要在含有硫胺素的 YES 培养基（Sabatinos 和 Forsburg，2010）中培养细胞。
将细胞转移到 250 ml 离心瓶中，并在室温下以 4,500 × g离心细胞5 分钟。去除上清液，重悬于 5 ml 无菌水中，并将悬浮液转移到 15 ml 离心管中。以 4,500 × g旋转细胞3 分钟。
去除上清液并重悬在 2 ml LiOAc 混合物中。
注意：使用 5 ml 血清移液管（或更大体积）重悬。
将样品分成两个 1.7 ml 微量离心管，并在室温下以 4,500 × g离心2 分钟。
重悬细胞在 LiOAc 混合物中，最终体积（细胞 + LiOAc 混合物）为每等分 1 毫升。
为每个等分试样加入 0.5 ml 50% 甘油/LiOAc 混合物，并通过倒置管或轻柔移液混合。
将样品分成 300 µl 等分试样，并在 -80°C 下储存在标准的 1.7 ml 微量离心管中。
注意：每 300 µl 等分试样足以进行四次转化。可以制作更小或更大的等分试样。每个等分试样都可以解冻（在冰上）并重新冷冻最多两次。限制解冻和重新冻结之间的时间以保持能力。在此期间，可使用干冰冷冻细胞，然后转移至 -80°C。转化效率随着每个冻融循环（经验观察）而降低。

酵母转化
解冻感受态细胞（在冰上）、ssDNA 和质粒 DNA（浓度约为 1-2 毫克/毫升）。
对于每次转化，混合 3 µl ssDNA、2 µl 质粒 DNA 和 70 µl 细胞。在为每次转化制作等分试样之前，可以混合 ssDNA 和细胞。
在室温下孵育 10 分钟（不需要摇晃）。
加入 290 µl PEG 混合物，轻轻颠倒试管多次直至均匀。
在 30°C 下孵育样品 1 小时（不需要摇晃）。
42°C 热激 5 分钟。
在室温下冷却样品 5 分钟（不需要摇晃）。
在室温下以 4,500 × g旋转 1 分钟。
去除上清液并在室温下将细胞重悬在 100 µl 无菌水中。
使用玻璃珠将样品轻轻涂抹在选择性琼脂板上，并在 30°C 下孵育直至出现单菌落（3-4 天）。亮氨酸去除或 Leu-PMG 琼脂培养基用于选择 pTIN 系统质粒。
在 Leu-PMG 琼脂上修补单个转化体并在 30°C 下孵育 1-2 天。最好使用新鲜生长的转化体，但琼脂平板可以在 4°C 下储存长达 5 天。

酵母中 pTIN 系统的诱导和表达
在 Leu-PMG 培养基中接种修补过的转化体，并在 30°C 下生长 5-6 小时。
用 15 µM 硫胺素液体培养基稀释 Leu-PMG 或 Leu-PMG 中的细胞，并在实验所需的时间里生长。mRNA 在 1 小时内表达至峰值水平，通过 Pho1（细胞表面酸性磷酸酶）报告基因活性测定的半数最大蛋白质表达在 5.6 小时内达到（Garg，2020）。为了实现较低的目标基因表达，硫胺素浓度可以在 0.01 和 0.3 µM 之间变化。浓度 ≥ 0.3 µM 会导致目标基因的最大程度去抑制 (Garg, 2020)。[15 µM 硫胺素已被广泛用于抑制nmt1 +启动子 (Forsburg, 1993)，因此用于最大限度地抑制 pTIN 系统]。在所需的过表达期后，细胞可用于选择的测定。
对于生长分析，从步骤 1 继续。将细胞稀释至 0.1 A 600并在 Leu-PMG 培养基中进行系列稀释（例如，5 倍稀释系列）。在含有 15 µM 硫胺素的 Leu-PMG 琼脂或 Leu-PMG 琼脂上点 3 µl 连续稀释液。在所需温度下孵育板。可以调整孵育时间，直到达到所需的菌落大小。孵化持续时间必须标准化，以允许在不同温度下生长时形成类似的野生型细胞集落大小。

数据分析

代表性数据：用于验证系统的代表性数据和实验细节在该方法的原始发表研究文章（Garg，2020）中提供。这些可以通过以下链接访问：https : //rnajournal.cshlp.org/content/26/11/1743.long。

食谱

酵母感受态细胞和转化
通过高压灭菌对库存溶液（10×TE [Tris-EDTA 缓冲液]、1 M LiOAc、50% PEG 3350、62.5% 甘油和 ssDNA）进行消毒。硫胺素盐酸盐溶液应过滤除菌。
LiOAc-混合物
（10 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA、100 mM 醋酸锂）
1毫升10×TE
1 ml 1M LiOAc
8 毫升水
PEG-混合物
（40% PEG 3350、10 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA、100 mM 醋酸锂）
8 毫升 50% PEG 3350
1毫升10×TE
1 ml 1 M LiOAc
50% 甘油/LiOAc 混合物
（50% 甘油 (v/v)、10 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA、100 mM 醋酸锂）
80 毫升 62.5% 甘油
10毫升10×TE
10 ml 1 M LiOAc
三文鱼精子 DNA (ssDNA)
水中 10 毫克/毫升
2,000×硫胺盐酸盐
10 mg/ml 水溶液（30 mM 原液）

致谢

感谢 Drs 的支持。斯图尔特·舒曼 (SS) 和 Beate Schwer (BS)。这项工作由国家普通医学科学研究所资助 (SS 和 BS 的授权号 R01-GM52470; SS 的 R35-GM126945)。该方法最初发表在 RNA 期刊（冷泉港实验室出版社）（Garg，2020 年）上。

利益争夺

专利申请号：PCT/US21/40051；国际申请日期：2021 年 7 月 1 日；题目：lncRNA调控的基因表达系统；申请人：纪念斯隆凯特琳癌症中心；发明人：Garg、Angad

参考

Forsburg, SL (1993)。粟酒裂殖酵母表达系统的比较。核酸研究21(12)：2955-2956。
Garg, A.（2020 年）。在裂殖酵母粟酒裂殖酵母中具有快速诱导动力学的 lncRNA 调节的基因表达系统。RNA 26(11)：1743-1752。
Maundrell, K. (1990)。裂殖酵母的nmt1 。一种高度转录的基因，完全被硫胺素抑制。J Biol Chem 265(19): 10857-10864。
Sabatinos, SA 和 Forsburg, SL (2010)。第 32 章 -粟酒裂殖酵母的分子遗传学。在：酶学方法。470：759-795。学术出版社。

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