材料和试剂
A. 耗材和试剂
1. 10×PBS（Gibco，目录号：70011044），4°C保存
2、293T培养皿；100 × 15mm TC 处理的培养皿（Corning Falcon，目录号：
353003)
3. Amicon Ultra-15离心过滤装置（Millipore，目录号：UFC903024）
4. DMEM（Gibco，目录号：11995-065），4°C 保存
5. FBS（Gibco，目录号：A31605），储存在-20°C
6. G418，遗传霉素（Invivogen，目录号：ant-gn-1），4°C 保存
7. 谷氨酰胺（Gibco，目录号：25030149），在 4°C 下储存
8. HEPES（Gibco，目录号：15630-080），在 4°C 下储存
9. Lipofectamine 2000（Invitrogen，目录号：52887），在 4°C 下储存
10. Opti-MEM（Gibco，目录号：51985-034），在 4°C 下储存
11. 青霉素 G（Sigma，目录号：P3032），储存在 4°C
12.聚凝胺（Sigma，目录号：H9268）
13.聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma，目录号：P1274），储存在4°C
14. RPMI（Gibco，目录号：11875-101），在 4°C 下储存
15. 丙酮酸钠（Gibco，目录号：11360-070），储存在 4°C
16. Valmark Ultra-Dish Petri 培养皿 100mm x 15mm（Midwest Scientific，目录号：900）
B. 质粒
1. 入口载体 pEN_TmiRc3 (Addgene Plasmid #25748)
用于克隆感兴趣基因的入口载体，使其表达由 TRE 启动子驱动。
2. 慢病毒表达载体 pSLIK_Neo (Addgene Plasmid #25735)
3次代慢病毒表达载体，其允许可诱导的基于的Tet基因表达
并包含组成型新霉素抗性盒。
3. pMDL (Addgene Plasmid #12251)
3次代慢病毒包装质粒包含gag和pol。
4. pRSV (Addgene Plasmid #12253)
3次代慢病毒包装质粒含有转。
5. pVSV (Addgene Plasmid #138479)
包含 VSV 包膜蛋白的慢病毒包装质粒。
C. 细胞系和培养基
1. HEK293T 细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
2. THP-1 细胞（ATCC，目录号：TIB-202）
3. HEK293T 生长培养基（见配方）
4. THP-1 生长培养基（见食谱）
D. 引物
见表 1

设备
1.离心机（Eppendorf，型号：5810R，目录号：022625004）
2. DNA分光光度计（Nanodrop，型号：ND-1000，目录号：THERMO-ND1000）
3.流式细胞仪（Becton Dickinson，型号：BD FACSCalibur TM）
4.凝胶成像系统（Bio-Rad，型号：ChemiDoc XRS+，目录号：1708265）
5.蛋白质凝胶罐（Invitrogen，型号：Mini gel tank，目录号：A25977）
6. 实时 PCR 系统（Applied Biosystems，型号：Quant Studio 6 Flex，目录号：
4485691)
7.热循环仪（Bio-Rad，型号：T100，目录号：1861096）
8. 转移装置（Bio-Rad，型号：Trans-blot SD Semi-Dry Transfer Cell，目录号：
1703940)
软件
1. GraphPad Prism 版本 9
程序
A. 用聚-L-赖氨酸准备板
注：Poly-L-Lysine 增强细胞粘附，降低 HEK293T 细胞脱离的可能性
在转染过程中从板中取出。
1. 将 50 μl PLL (20
mg/ml) 与 5 ml 10× PBS 和 45 ml ddH 2 O。
2. 将 4 ml 稀释的 PLL (20 μg/ml) 添加到 10 cm 293T 培养皿中。
3. 37°C 孵育 1 小时。
4. 吸出 PLL 溶液并用 5 ml 1× PBS 洗涤 3 次。存放餐具，冲洗三
在室温下，在无菌组织培养罩中使用无菌 ddH 2 O 和空气干燥板。
B. 传代 HEK293T 细胞
1. 从 HEK293T 细胞的 T75 烧瓶中以 90% 汇合度吸出培养基。一个 T75 烧瓶应该
包含足够的细胞以每盘4.5 × 10 6细胞培养三个 10 cm培养皿。
2. 用 5 ml 2 mM EDTA PBS 清洗烧瓶。
3. 加入 5 ml 温热的胰蛋白酶-EDTA 并轻轻摇动烧瓶以分离细胞。
4. 在 15 ml 锥形管中收集细胞并加入 5 ml 完全培养基以抑制胰蛋白酶。
5. 以 300 × g旋转5 分钟。
6. 吸出培养基并轻弹沉淀以松开细胞，重悬于 10 ml 培养基中并计数
细胞。
7.每个 PLL-coated 10 cm 培养皿中平板 4.5 × 10 6 个细胞；细胞应迅速粘附在培养皿上。
C. 转染细胞
1. 在转染前 1 小时用 10 ml 常规生长培养基每板更换细胞培养基。
2. 在 37°C 下加热 Opti-MEM (OM)。
3. 将 OM 中的 DNA 构建体按表 2 中所列的量稀释至总计 1.5 ml。
与1.44毫升OM脂质体2000（LF2000）的4稀释60微升。让我们在室温下静置
5 分钟。
5. 将 1.5 ml LF2000/OM 溶液加入稀释的 DNA 中，室温静置 20 分钟
温度。
6.小心添加3毫升DNA / LF2000 / OM的到10 ml培养基在板上，在每次一滴。
7. 在 37°C 下孵育过夜（12-18 小时）。
8. 吸出培养基并更换为每板 10 毫升温热培养基。
9. 再孵育 36 小时。
D. 病毒收集
1. 将培养基从 10 cm 293T 培养板转移到 15 ml 锥形管中。
2. 将上清液在 4°C 下以 500 × g离心 5 分钟。
3. 通过 0.45 μm 无热原过滤器过滤上清液。
4. 准备好 Amicon 装置时，将上清液储存在 4°C。
5. 通过向滤杯中加入 15 ml 70% 乙醇对 Amicon 装置进行消毒。让它静置10分钟。
6. 将 Amicon 装置以 2,590 × g离心 15 分钟。
7. 丢弃收集管中的乙醇。
8. 向滤杯中加入 15 毫升无菌水。让它静置 5 分钟。
9.离心的Amicon单元在2590 15分钟×克。从收集管弃水。
10.病毒上清液添加到所述的Amicon单元。
11.在 4°C 下以 2,590 × g离心 30 分钟。上清液应完全通过
过滤器，滤杯部分没有残留。
替代方法：如果的Amicon单元不可用，从等分步骤D4上清液至50ml
锥形管并设置一个过夜离心。自旋与朝外标签，知道在哪里
寻找颗粒。以 8,000 × g缓慢加速 (4) 和正常制动 (9) 旋转12
4°C 至 18 小时。
12. 向滤杯中加入 1 ml RPMI。收集粘稠的浓缩病毒并在 4°C 下储存。
替代方法：如果通过离心浓缩病毒，吸出上清液。重悬
在 1 ml RPMI 中沉淀并在 4°C 下储存。
E. 293T 细胞中的慢病毒滴定
笔记：
一种。为了实现靶细胞的最佳慢病毒感染，重要的是使用正确的比例细胞转化为感染性病毒颗粒。该比率也称为感染复数 (MOI)。确定浓缩慢病毒原液中活的传染性病毒颗粒的数量来自病毒滴定实验。病毒感染也可以通过流式细胞术进行评分以检测慢病毒构建体中共表达的荧光蛋白的存在或染色基因编码由慢病毒载体。虽然我们描述了 pSLIK-Neo 病毒骨架的使用，它共表达了一个新霉素抗性基因，一个类似的pSLIK 亲本质粒，它共表达金星黄色荧光蛋白 (Addgene# 25734)，可用。湾感染性病毒滴度是在未浓缩的培养上清液中测定的包装细胞、浓缩病毒原液和浓缩病毒原液冻融循环。比较这些不同制剂的效价有助于确定病毒损失的来源，这可能是一个重要的控制因素。
1.在12孔组织培养板从对数期培养物中收获板293T细胞
1.44 × 10 5 个细胞/孔的浓度并孵育过夜。目视确认 293T
细胞健康，分布均匀，感染时融合度为 40-50%。
2. 从 293T 细胞中吸出培养基，加入 0.9 ml 预热的 293T 生长培养基，其中含有
8微克/ ml聚凝胺。返回板到培养箱中。
3.稀释在含8微克/ ml聚凝胺293T生长培养基病毒解决方案。最终体积
每次稀释需要 100 µl，每个样品加入时会再稀释 10 倍
到细胞。对 10-10 3范围内的一组连续稀释（通常为三个）进行测试
未浓缩的病毒，10 2 -10 5的范围用于检测浓缩病毒。
4.将100μl各病毒稀释液添加到293T细胞的孔中（在0.9毫升培养基）。作为匹配
未感染的对照，添加 100 µl 不含病毒的 293T 生长培养基/聚凝胺
几口井。孵育细胞 24 小时。
5. 24 小时后，用新鲜的 293T 生长培养基更换培养基并将培养板放回培养箱。
6. 感染后 48-72 小时收获细胞用于流式细胞术分析。汇集培养基上清液，
洗涤，并将每个样品孔中的细胞移入 FACS 管中，以确保所有细胞都
包括。
7. 离心沉淀细胞（300 × g，5 分钟，4°C）。
8. 通过流式细胞术分析确定金星阳性细胞的百分比
受感染的样品未感染293T细胞。确定样品中的感染率是3-
10% 并计算感染当天感染的细胞数。这大约是
相当于每孔添加的传染性病毒颗粒的数量，假设感染率为 1:1
比率。检测到的活性病毒数量与病毒原液的体积和稀释度一起使用
计算原液中的病毒浓度。这提供了慢病毒滴度
关于 293T 细胞感染。
慢病毒滴度 = 感染细胞数 × 病毒原液体积 × 病毒原液稀释度
笔记：
一种。用户感兴趣的目标细胞的滴度可以通过并排感染来计算此类靶细胞，293T 细胞使用相同的细胞数和病毒量。许多细胞类型可能比 293T 细胞感染效率低，但我们发现相对感染细胞之间的比例相当一致。因此，如果用户的目标单元格通常显示 50%的293T感染水平的，可以假设以供将来病毒制剂这个比例。湾同样，我们发现了 pSLIK-Venus 和 pSLIK-Neo 的并排比较亲本质粒产生非常相似的病毒滴度。因此pSLIK-Venus 对照的滴定与基于 pSLIK-Neo 的病毒一起应产生可比的滴度。
我们来自该协议的平均病毒滴度是来自 1 块 293T 细胞的1.175 × 10 7病毒颗粒。虽然每个实验室都应该进行几次病毒滴定以确定水平和一致性的效价 (Kutner et al ., 2009)，我们将这个平均值用于 THP-1 细胞感染，并且仅如果我们发现感染率意外下降，请进行滴定。
F. THP-1 细胞转导
1. 用 1.175 × 10 7除以浓缩的总体积计算每毫升病毒粒子数
每板回收病毒。
2.计算在10 MOI需要感染细胞的病毒通过将5.0×10容积6由
每毫升病毒颗粒的浓度。我们通常用 0.5 × 10 6 THP-1 细胞感染
大约 MOI 为 10（293T 转导单位）。
病毒体积 (ml) = (每孔细胞数 × MOI)/每毫升病毒颗粒，即。
(0.5 × 10 6 × 10)/每毫升病毒颗粒。
这相当于 THP-1 细胞的 MOI <1，通常约为 30% 的转导效率 [其中转导效率 (%) = 转导细胞数/细胞总数]。转导效率可以通过FACS来测定计数是阳性的THP-1细胞的数目慢病毒编码的转基因或组成型表达的金星转导的表达标记作为细胞总数的一部分。我们的目标是实现这种相对较低的传染性，以确保大多数细胞没有多重病毒整合。
3. 将每孔0.5 × 10 6细胞接种到 24 孔培养皿的两个孔中。
4. 接种后 0.5-3 小时感染细胞。
5. 用无血清培养基稀释病毒至 500 μl 感染一个孔
4微克/ ml聚凝胺和100U / ml青霉素G.
6. 吸出培养基并用稀释的病毒代替。
7. 4 小时后，加入 1.5 ml 含有青霉素的常规生长培养基。
8. 第二天，分裂细胞并将1 × 10 6 个细胞加入Valmark 培养皿中。
9. 分裂后一到两天，通过在补充的完全培养基中生长来选择细胞
与 G418 (1 毫克/毫升)。
在THP-1细胞G.基因表达验证
1. 将细胞置于 6 孔板中，37°C 孵育 6 小时。
2. 向细胞中加入 DOX (1 μg/ml) 并孵育 6-18 小时。
3. 收获细胞并分离 RNA 或蛋白质。
4.验证病毒整合通过qPCR（图1B）和DOX诱导的过量表达通过qPCR，
免疫印迹，或流式细胞术（图1C-1E）。

图 1. NOD1 和 NLRP2 的慢病毒介导的条件表达。慢病毒NLR 的 DOX 诱导表达系统。3X-FLAG-tagged NLR编码的表达序列在诱导型四环素启动子的控制下转录，称为 a四环素响应元件（TRE）。为了设计慢病毒表达载体pSLIK_Neo_NOD1 或pSLIK_Neo_NLRP2，N 端 3X-FLAG 标记的 NOD1 或 NLRP2首先克隆在进入载体 pEN_TmiRc3 的 Spe1 和 Mfe1 限制性位点之间，所以它们的基因表达是由TRE启动子驱动。然后重组入口载体使用慢病毒表达载体 pSLIK_Neo，通过 Gateway LR 克隆反应。这个重组反应将 TRE 驱动的 NOD1 和 NLRP2 基因盒穿梭到慢病毒骨架，导致产生 pSLIK_Neo_NOD1 和 pSLIK_Neo_NLRP2慢病毒表达载体。慢病毒质粒与 pMDL、pRSV 和pVSV 进入 HEK293T 细胞以生成用于感染 THP-1 细胞的慢病毒。( B ) qPCR 显示构建体：条件表达的 NLR 的染色体比率。THP-1细胞被感染慢病毒感染性低。特定于内源性或 FLAG 标记的 qPCR 探针NLR（表 1）用于确定 NLR 转基因（构建体）与内源基因（染色体），作为每个基因组整合数的估计。一种构建体：染色体比率为 0.5 表示每个细胞有一个整合，比率为 1 表示每个单元有两个集成。（C）qPCR 显示添加DOX后NLR 的过度表达。THP-含有 DOX 诱导型NOD1或NLRP2 的1 个细胞未经处理或用 DOX 处理6 小时。收获 RNA，并通过 qPCR 确定 NLR 表达。NLR表达在没有 DOX 的情况下设置为 1。 DOX 诱导的 NLR 过表达是相对测量的在没有 DOX 的情况下。( D和E ) 免疫印迹 (D) 和流式细胞术 (E) 显示蛋白质添加或不添加 DOX 的指定 THP-1 系中 FLAG 标记的 NLR 的表达6 小时。“载体”是指用空载体转导的细胞，“对照”是指 THP-1 细胞没有慢病毒转导。数据表示为平均值±SEM。统计分析使用GraphPad Prism 中的学生未配对t检验（双尾）进行。P值 <0.05被认为是重要的。**** P < 0.0001。

食谱
1. HEK293T 生长培养基DMEM 补充有 10% FBS、10 mM HEPES 和 2 mM 谷氨酰胺。
2. THP-1 生长培养基RPMI 补充有 10% FBS、10 mM HEPES 和 2 mM 谷氨酰胺

致谢
这项工作由 ISB、美国 NIH 向 NS 和校内研究提供 R21-AI138258 资助NIAID、NIH（RNG 和 IDCF）的计划。ASA 得到了美国协会的支持免疫学家 (AAI) 免疫学奖学金职业。我们感谢 S. Porcella 和 Genomics落基山实验室的单位，用于引物设计和 qPCR 支持。该协议是改编自 Shin等人的微小修改。(2006) 和 Rommereim等人。(2020)。

利益争夺
Leah Rommereim 是 SEngine Precision Medicine 的员工和股东。其他都没有作者有任何相互竞争的经济利益。

参考
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Boezio, GLM, Takacs, CM, Lai, SL, Fukuda, R., Gerri, C., Giraldez, AJ 和 Stainier, D.
年（2019 年）。由突变 mRNA 降解触发的遗传补偿。自然568（7751）：193-197。
4. Kutner, RH, Zhang, XY 和 Reiser, J. (2009)。的生产、浓缩和滴定基于假型 HIV-1 的慢病毒载体。国家协议4(4)：495-505。
5. Li, MJ, Kim, J., Li, S., Zaia, J., Yee, JK, Anderson, J., Akkina, R. 和 Rossi, JJ (2005)。通过慢病毒载体递送长期抑制原代造血细胞中的 HIV-1 感染抗 HIV shRNA、抗 CCR5 核酶和核仁定位 TAR 的三重组合
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6. Naldini, L.、Blomer, U.、Gallay, P.、Ory, D.、Mulligan, R.、Gage、FH、Verma、IM 和 Trono，D. (1996)。慢病毒载体对非分裂细胞的体内基因传递和稳定转导。科学272（5259）：263-267。
7. Reiser, J., Harmison, G., Kluepfel-Stahl, S., Brady, RO, Karlsson, S. 和 Schubert, M. (1996)。使用假型缺陷高滴度 HIV 1 型颗粒转导非分裂细胞。Proc Natl Acad Sci USA 93(26): 15266-15271。
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