材料和试剂

Whatman滤纸（Merk，目录号：WHA1001150）
移液器吸头 1,000 μl（Axygen，目录号：T-1000-CLRS）
移液器吸头 10 ml（Eppendorf，目录号：0030000781）
1.5 ml 微量离心管（Axygen，目录号：MCT-150-C-ZX）
50 ml离心管（Corning，目录号：430828）
培养皿（任何品牌，直径 47 毫米）
漏斗（任何品牌，直径 100 毫米）
Columbia-0 背景下的拟南芥ddm1-2突变体
乙醇（Merk，目录号：51976）
Triton X-100（Merk，目录号：T8787）
含有维生素的 Murashige 和 Skoog 基础培养基（PhytoTech，目录号：M519）
蒸馏水，使用 RSJ 水净化系统（Tanon，目录号：RODI-220B1）产生
液氮
Miracloth（Sigma-Aldrich，目录号：475855）
Tris 碱（Fisher Scientific，目录号：BP152-500）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221473）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：A466-250）
醋酸钾（KOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：P1190）
醋酸镁（MgOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：63052）
二硫苏糖醇（DTT）（Fisher Scientific，目录号：R0861）
壬基苯基聚乙二醇（NP-40）（Fisher Scientific，目录号：49-201）
cOmplete TM ，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：11873580001）
的RNasin ®加RNase抑制剂（Promega公司，目录号：N2615）
灭菌溶液（见配方）
半强度 MS 中板（见配方）
RG 裂解缓冲液（参见配方）

设备

吸管1000 μ升，将10毫升（的Eppendorf，产品目录号：3123000063，4720000011 ）
涡流器（任何品牌）
超净工作台（任何品牌）
冰箱（4°C）（任何品牌）
植物生长室（任何具有温度和光控制的型号）
研钵和研杵（任何品牌）
Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge（ThermoFisher，目录号：75006580 ）
微量离心机 5424R（Eppendorf，型号：5424R）
离心机 5810R（Eppendorf，型号：5810R ，目录号：022625101 ）

程序电子

概述
该协议允许从植物样品中简单快速地富集 RG 组分（尽管是原油）。简而言之，通过用 RG 裂解缓冲液连续离心来分离和溶解 RG 级分。随后可以对富集的 RG 分数进行 RNA 序列和蛋白质分析 (图 1)。

图 1. RNA 颗粒富集方案

植物准备
将 100 μl ddm1-2种子放入 1.5 ml 微量离心管中。
向种子中加入 1 ml 灭菌溶液并涡旋 4 分钟（参见配方 1）。
丢弃解决方案。
用 1 ml 100% 乙醇清洗种子。
涡旋 1 分钟并丢弃乙醇。
重复步骤 B4 和 B5。
准备一张滤纸并将种子移到纸上。
让乙醇蒸发 3 分钟。
拿起纸，将种子撒在半强度的 Murashige 和 Skoog 培养基上（参见配方 2）。
用封口膜包裹板，然后将其放入 4°C 的腔室中 2 天。
将板转移到 22°C 和 16 小时光照/8 小时黑暗循环下的生长室中，持续 10 天。
笔记：
除拟南芥幼苗外的任何植物样品均可用于该协议。
在干净的工作台上进行种子灭菌（使用前用 70% 乙醇擦拭）。

RNA颗粒富集
使用预冷的研钵和研杵将 2 克幼苗在液氮中研磨成细粉。
将样品（约 5 ml）收集到 50 ml 试管中并重悬在 5 ml RG 裂解缓冲液中（参见配方 3）。
将所得浆液通过漏斗中的四层 Miracloth 过滤到 50 ml 锥形管中，并在 4°C 下以850 × g离心5 分钟以沉淀细胞碎片。
将上清液转移到新的 50 ml 管中并加入 5 ml RG 裂解缓冲液。
在 4°C 下以 4,000 × g离心10 分钟并丢弃上清液。
将沉淀重悬在 2 ml RG 裂解缓冲液中。在 4°C 下以 18,000 × g离心10 分钟。
将沉淀重悬在 2 ml RG 裂解缓冲液中，涡旋并在 4°C 下以 18,000 × g离心10 分钟。
弃去上清液，用 1 ml RG 裂解缓冲液轻轻地重悬沉淀。在 4°C 下以 850 × g离心10 分钟。
将上清液（富含 RGs）转移到 1.5 ml 微量离心管中，不要干扰任何残留物，并将其保存在冰箱中直至使用。
注意：我们建议使用荧光标记的 RG 标记植物系来快速检查成功的 RG 富集。

RNA分析
由上述协议产生的最终 RG 部分可以进行常规 RNA 提取，随后使用 RT-qPCR 或转录组范围的分析进行靶向 RNA 分析测试。
注意：请参阅 Kim 等人。（2021）关于任何 RG 特异性标记基因的建议。

数据分析

可以按照原始论文（Kim等，2021；https://doi.org/10.1038/s41477-021-00867-4）中的详细说明分析从 RG 富集部分生成的 RNA-seq 数据。

食谱

杀菌溶液
70%乙醇
0.05% 海卫 X-100
半强度MS-中板
2.2 g/L Murashige 和 Skoog 基础培养基，含维生素
用 KOH 将 pH 值调节至 5.7
7 g/L 植物琼脂
高压灭菌
RG裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 7.4
100 mM KOAc
2 mM MgOAc
0.5% NP-40
0.5 毫米 DTT
一片（50 毫升）蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete TM ，不含 EDTA的蛋白酶抑制剂混合物）
1 U/μl RNasin Plus RNase Inhibitor

1 M Tris-HCl，pH 7.4
2.5 毫升
1 M KOAc
5毫升
1 M MgOAc
0.1毫升
10% NP-40
2.5 毫升
1 M 数字电视
25 微升
蛋白酶抑制剂鸡尾酒
一粒
40,000 U/ml RNasin Plus RNase Inhibitor
1.25 毫升
蒸馏水
最多 50 毫升

笔记：
用蒸馏水准备所有溶液和缓冲液。
使用前添加 DTT 和 RNase Inhibitor。

致谢

该工作得到了国家自然科学基金（31970518）、中国科学院战略性优先研究计划（XDB27030209）和上海市自然科学基金面上项目（21ZR1470700）的资助。EY Kim 是 CAS 总统国际奖学金计划 (PIFI) 青年员工奖学金 (2021FYB0001) 的获得者。该协议改编自我们之前报告的工作（Kim等人，2021 年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Anderson, P. 和 Kedersha, N. (2009)。RNA 颗粒：基因表达的转录后和表观遗传调节剂。Nat Rev Mol Cell Biol 10(6): 430-436。
Jain, S.、Wheeler, JR、Walters, RW、Agrawal, A.、Barsic, A. 和 Parker, R.（2016 年）。ATPase 调节的应激颗粒包含多种蛋白质组和亚结构。单元格164(3)：487-498。
Khong, A., Matheny, T., Jain, S., Mitchell, SF, Wheeler, JR 和 Parker, R. (2017)。应激颗粒转录组揭示了应激颗粒中 mRNA 积累的原理。摩尔细胞68(4)：808-820 e805。
Kim, EY, Wang, L., Lei, Z., Li, H., Fan, W. 和 Cho, J. (2021)。核糖体停滞和 SGS3 相分离引发转座子的表观遗传沉默。天然植物7(3)：303-309。
McCue, AD, Nuthikattu, S., Reeder, SH 和 Slotkin, RK (2012)。由转座因子小 RNA 的表观遗传调控介导的基因表达和应激反应。PLoS 基因8(2)：e1002474。
McCue, AD, Nuthikattu, S. 和 Slotkin, RK (2013)。全基因组鉴定通过转座因子小干扰 RNA 进行反式调节的基因。 RNA 生物学10(8)：1379-95。

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