材料和试剂

锥形离心管（15 ml）（例如，Thermo Scientific TM Nunc TM 15 ml，目录号：339650，或类似物）。
微量离心管（1.5 ml）（例如，Thermo Scientific TM Nunc TM ，目录号：3451，或类似物）。
无针注射器（1 ml）（例如，BD ® 1 ml Insulin Syringe U-100 Slip Tip with BD PrecisionGlide TM Needle 25G × 5/8（0.5 mm × 16 mm，目录号：329651，或类似物）
塑料培养皿（直径 90 毫米）（例如，Thermo Scientific TM Sterilin TM Petri 培养皿 90 mm，目录号：101R20 或类似物）
注射器过滤器（0.45微米）（例如，新型Millex，的Millex ® -HV，目录号：SLHV033RB，或类似的）
塑料方形培养皿（10 × 10 cm）（例如，Thermo Scientific TM Nunc TM Lab-Tek TM ，目录号：4021，或类似物）
移液器吸头（例如AIBIO，目录号：T1040000 或类似物）
纸巾
分光光度计塑料比色皿（例如，BRAND，目录号：759015 或类似物）
标准盆栽土壤（例如Pindstrup，目录号：1034593214 或类似物）
蛭石（例如，上海春莹园艺有限公司，蛭石 2-4 毫米，或https://www.amazon.com/s?k=Professional+Grade+Vermiculite+by+Plantation+Products&ref=nb_sb_noss_2或类似）
花盆（例如，https://www.amazon.com/HOMENOTE-Plastic-Outdoor-Planters-Multiple/dp/B08HCX2D9V/ref=sr_1_42?dchild=1&keywords=flowerpot&qid=1621586733&sr=8-42或类似）
N.benthamiana植物（见图 1）
大肠杆菌（DH5α株）自制或购买的感受态细胞（用于商业感受态细胞，例如北京TransGen Biotech，目录号：CD501，或类似的）
A. tumefaciens （菌株 GV3101）自制或购买的感受态细胞（用于商业感受态细胞，例如Weidi Bio，目录号：AC1001，或类似的）
氢氧化钾（KOH）（例如，国药化学试剂有限公司，SCR ® ，目录号：10017018，或类似的）
pGWB-NLuc 载体（图 2A，GenBank 登录号：MW557526；Addgene：174050）
pGWB-CLuc 载体（图 2B，GenBank 登录号：MW557527；Addgene：174051）
pDONR TM 207（Thermo Scientific，目录号：PVT11146 ）或等效的克隆载体
Gateway ® BP反应试剂盒（Thermo Scientific ，目录号：11789-013）或等效的克隆酶
Gateway ® LR 反应试剂盒（Thermo Scientific ，目录号：11791100）或等效的克隆酶

注意：传统克隆也是可能的。在这种情况下需要适当的限制酶和 T4 DNA 连接酶（例如 Thermo Scientific，目录号：EL0011 或类似物）。

兔多克隆抗荧光素酶（Sigma，目录号：L0159）
抗生素（卡那霉素、庆大霉素和利福平）
1 mM XenoLight D-荧光素（PerkinElmer，目录号：122799）
75％乙醇（例如，国药化学试剂有限公司，SCR ® ，目录号：801769610，或类似的）
酵母提取物（例如，OXOID，目录号：LP0021，或类似物）
琼脂（例如，国药化学试剂有限公司，SCR ® ，目录号：10000561，或类似的）
胰蛋白胨（例如，OXOID，目录号：LP0042 或类似物）
氯化钠（NaCl）（例如，国药化学试剂有限公司，SCR ® ，目录号：10019318，或类似的）
3',5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮（AS）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：2478-38-8，或类似物）
六水氯化镁 (MgCl 2·6H 2 O）（例如，国药化学试剂有限公司，SCR ® ，目录号：10012818，或类似的）
MES 游离酸一水合物（MES）（例如，Amresco，目录号：Amresco E169 或类似物）
二甲基亚砜（DMSO）（例如，Diamond，目录号：A100231-0500，或类似物）
蒸馏无菌水（例如，Thermo Scientific TM Gibco TM ，目录号： 15230204，或类似）
Luria-Bertani (LB) 培养基（见食谱）
农杆菌浸润缓冲液（见配方）

设备

剪刀
Nanodrop 分光光度计（例如，Thermo Scientific，型号：NanoDrop 2000c，或类似的）

注意：这不是必需的——任何其他量化 DNA 的方法（例如，在常规分光光度计中或通过在琼脂糖凝胶中可视化）也是有效的。

Vortexer（例如，Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2，目录号：S1-0246 或类似物）
28°C 培养皿培养箱（例如松下，型号：MIR-262-PC，或类似）
37°C 培养皿培养箱（例如松下，型号：MIR-154-PC，或类似）
高压釜（例如，SANYO，型号：MLS-3780，或类似的）
流罩（洁净台）（例如，上海上京有限公司，模式：CA-1390-1，或类似）
植物生长空间（例如，Percival 生长室，型号：I-36VL；24°C，16 小时光照/8 小时黑暗，或类似的）
电子天平（例如，Sartorius，型号：BSA224S 或类似产品）
离心机（例如Eppendorf，型号：离心机 5424，或类似的）
pH计（例如，Sartorius，型号：PB-10，或类似的）
28°C 管式培养箱（摇床）（例如Eppendorf、New Brunswick TM ，目录号：I26 M1324-0006，或类似）
37°C 管式培养箱（振荡器）（例如，Eppendorf，New Brunswick TM ，目录号：I26 M1324-0006 或类似物）
CCD 成像设备（例如NightShade LB985、Berthold Technologies 或类似设备）

软件

靛蓝软件
Graphpad Prism 7（GraphPad，http://www.graphpad.com），或用于统计分析的等效程序
文本处理器（例如，Microsoft Word 或类似的）
电子表格（例如，Microsoft Excel 或类似的）

程序

本氏烟草植物的制备（4 周）

在盆栽土和蛭石的 1:1 混合物中播种本氏烟草种子，用塑料薄膜覆盖盆，然后在 25 ℃的长日条件（16 小时光照/8 小时黑暗）下将它们种植在受控生长室中°C ，湿度为 70%，光强度为 130 mE m -2 s -1 （图 1）。
将 10 天大的幼苗转移到单独的盆中（例如10 × 10 厘米），让它们生长到 4 周大（图 1）。

注意：根据需要给植物浇水并控制害虫以保持植物健康。必要时可添加肥料。健康的植物材料对于 POI 的有效瞬时表达是必不可少的，因此对于实验的成功也是必不可少的。

图 1.用于瞬时表达实验的本氏烟草植物的培养。

箭头表示适合渗透的叶子。标明了所用植物的年龄。

矢量构造

网关兼容二元载体（PGWB-NLuc和PGWB-CLuc）从原始pCAMBIA1300-NLuc / CLuc矢量生成（陈等人利用Gateway盒（图2）（王，Y.积分。，2008）等。 , 2019; Yu等人, 2020)。为了生成编码融合 POI 的构建体，这些载体可以与 Gateway 克隆结合使用（或者，原始载体可以与传统克隆结合使用）。Gateway 克隆过程概述如下。

克隆编码的POI到网关进入载体（基因例如，的pDONR TM 207，Thermo Scientific的）通过BP反应物（Thermo Scientific，网关TM BP克隆酶TM按照制造商的说明书酶混合物）（www.thermofisher.cn）及变换将每个反应溶液注入大肠杆菌感受态细胞。进行菌落 PCR 以选择阳性克隆并通过测序进行确认。
通过LR反应（Thermo Scientific，Gateway TM LR Clonase TM Enzyme mix），按照制造商的说明（www.thermofisher.cn），将克隆的基因亚克隆到目标载体pGWB-NLuc和pGWB-CLuc中，并转化每个反应溶液到大肠杆菌感受态细胞中。进行菌落 PCR 以选择阳性克隆并通过测序进行确认。

图 2. 用于植物中 Split-LUC 成像测定的网关兼容载体。

示意图显示 pGWB-NLuc (A) 和 pGWB-CLuc (B) 载体（在 Snapgene 中可视化）。指示了以 bp 为单位的质粒大小。启动子、终止子、开放阅读框、attR1、attR2 和 T-DNA 显示在图中。CaMV：花椰菜花叶病毒；LB：左边界；RB：右边框；ccdB：控制细胞死亡 B（基因）；HygR：潮霉素抗性（基因）；KanR：卡那霉素抗性（基因）；CmR：氯霉素抗性（基因）。(C) 表达融合蛋白的盒的示意图。POI，感兴趣的蛋白质。

农杆菌-介导的本氏烟草中的瞬时表达

准备和高压灭菌 LB 培养基（103 kPa/121°C/15 分钟）。用琼脂冷却 LB 培养基，直到可以赤手触摸瓶子（但仍为液体形式），加入适当的抗生素（50μg/ml卡那霉素、50 μ g/ml庆大霉素和25 μ g/ml利福平），然后将培养基倒入培养皿中。
将 B（载体构建）中生成的质粒以及适当的对照转化为根癌农杆菌细胞通过化学转化。根癌农杆菌感受态细胞 (GV3101) 可以购买（参见上面的材料和试剂）或使用标准协议制备（例如，Kaman-Toth等人，2018 年）。
使用特定引物进行菌落 PCR 以检测阳性克隆。将每个板中的一个阳性单个根癌农杆菌菌落接种到 5 ml LB 液体培养基中，该培养基含有抗生素（50 µg/ml 卡那霉素、25 µg/ml 利福平和 50 µg/ml 庆大霉素），置于 15 ml 试管中，用在 28°C 下以 220 × g振荡16-24 小时，直到 OD 600 = 0.5-1.5。

注意：体积取决于要接种的叶子数量。通常，根癌农杆菌从 5 ml LB 培养基培养的细胞应该足以用于以后接种至少三片本氏烟草叶子。

可选步骤：在管（例如，1.5 ml 微量离心管）中为单个根癌农杆菌克隆制备甘油储备液（甘油的最终浓度为 30% ）并储存在 -80°C。使用前，用相应的抗生素（50 µg/ml 卡那霉素、25 µg/ml 利福平和 50 µg/ml 庆大霉素）在固体 LB 培养基上划出携带所需质粒的根癌农杆菌克隆，然后孵育它们在 28°C 下保持 24-48 小时。在 28°C下将每个根癌农杆菌克隆的液体培养物培养12-16 小时，使 OD 600 = 0.5-1.5。如果不需要此步骤，请继续执行步骤 5。
将细菌以 4,000 × g室温离心10 分钟，然后弃去上清液。

注意：应完全去除上清液，因此建议使用微量移液器。

将根癌农杆菌细胞重新悬浮在浸润缓冲液中（参见配方 1），使其最终浓度为 OD 600 = 0.1-0.5。

注意：最终的 OD 600对于瞬态转换很重要。最佳 OD 应通过实验确定。

混合等体积的根癌农杆菌克隆携带所需的质粒来表达蛋白 A-NLuc 或 CLuc-蛋白 B，以制备浸润溶液（图 3A）。需要适当的控制（阳性和阴性）。

注意：为了排除非特异性相互作用和人为信号，用作负相互作用控制的蛋白质应具有与 POI 相同的亚细胞定位。

图 3.渗透过程的图示。

将渗透溶液保持在室温和黑暗中 2-6 小时。

注意：在孵育过程中，渗透缓冲液中的乙酰丁香酮会诱导根癌土壤杆菌毒力基因的表达，从而促进 T-DNA 区域的转移和整合到宿主植物基因组中。因此，此步骤对于有效转换是可取的。

选择 4 周龄的本氏烟草植物的完全展开的叶子进行渗透（图 1、图 3B）。
使用 1 ml 无针注射器将A. tumefaciens接种物小心地渗入选定的叶子中。在远轴侧进行浸润（图 3B），并在近轴侧用指尖施加压力（图 3C）。

笔记：

本氏烟草的渗透在干燥的叶子中效果更好，没有因冷凝或与其他叶子接触而产生的水滴。在叶的背面，用针头（例如，从 1 毫升注射器）轻轻刺入有助于缓解浸润。
为避免损坏植物叶子，请在没有太大压力的情况下缓慢进行渗透。
选择大小相似的健康叶子。来自不同植物的至少三个独立的叶子需要用于生物复制。

在同一片叶子中并排渗透携带 POI 和阴性对照的A. tumefaciens接种物（图 3D），以避免叶间变异。

注意：在渗透过程中移动到另一个接种物之前，请使用 75% 乙醇清洁手套，以避免交叉污染。

使用永久性记号笔标记渗透区域（图 3E）。用纸巾轻轻擦拭叶子的湿表面。
在测量荧光素酶活性之前，将植物放入生长室 36-48 小时（例如2 天）。通常可以在接种后 36-60 小时 (hpi) 检测到瞬时表达的蛋白质的积累。

用 CCD 成像系统测量荧光素酶活性

在根癌农杆菌浸润后 2 天，将1 mM 荧光素溶液（在 H 2 O 中）渗入接种的叶子中。
分离整片叶子并在成像前将它们保持在黑暗中 10 分钟，以避免叶绿素发光的干扰。
使用 CCD 成像设备（例如NightShade LB985）和 IndiGO 软件捕获发光图像，并按照制造商的说明测量相对荧光素酶活性（发光强度/cm 2叶面积），如图 4 所示。

笔记：

由于冷光会很低，所以必须将相机冷却到默认温度，并且必须在黑暗中拍摄冷光图像。根据信号强度调整曝光时间（图 4E）。
由于发光检测依赖于重组荧光素酶蛋白的丰度，因此必须使用抗荧光素酶抗体（兔多克隆抗荧光素酶，Sigma，Cat# L0159）通过蛋白质印迹法评估所有测试蛋白质和对照的积累，该抗体可识别两者NLuc 和 CLuc。

图 4. Split-LUC 成像测定中相对荧光素酶活性的测量说明。

该示例显示了由双生病毒番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV，GenBank 登录号：AJ489258）编码的病毒蛋白 V2 的自相互作用。“1”表示共表达 V2-NLuc 和 CLuc-SlWRKY75 的区域（阴性对照）；“2”表示共表达 V2-NLuc 和 CLuc-V2 的区域（实验）。

通过单击“导出图像”（图 4I）从 IndiGO 软件导出 Split-LUC 成像检测的图像（.png 格式）。
通过单击“RichText 报告”（图 4I），导出 IndiGO 软件中所有样本和控件的定义感兴趣区域（ROI）中相对荧光素酶活性的值。使用文本处理器（例如Microsoft Word 程序）打开 RichText 报告 (.rtf) 文件，并将相关荧光素酶活动的分析详细信息复制到电子表格（例如Excel）（表 1）。

注：ROI 中相对荧光素酶活性的平均值等于 ROI（总体）的总信号值除以像素数。

表 1. 图 4H 中描述的实验中每个 ROI 的相对荧光素酶活性值示例

数据分析

图 5 显示了在本氏烟草中通过 Split-LUC 成像检测检测到的 PPI 示例。

图 5. Split-LUC 成像分析检测到的 PPI 示例：来自 TYLCV 的病毒蛋白 V2 与来自本氏烟草的Argonaute 4 (AGO4) 蛋白相互作用。

“1”表示共表达V2-NLuc和CLuc-NbAGO4-1的区域（实验）；“2”表示共表达V2-NLuc和CLuc-NbAGO4-2的区域（实验）；“3”表示共表达 V2-NLuc 和 CLuc-SlWRKY75 的区域（阴性对照）。渗透后 2 天对来自本氏烟草叶子的荧光素酶生物发光成像。显示了代表性叶子的图像。Cps：每秒计数。

表 2. 图 5 中描述的实验中 ROI 的相对荧光素酶活性的平均值 (cps) 示例，所有生物复制品均在本氏烟草叶中

将实验中 ROI 的相对荧光素酶活性的平均值 (cps)（图 5）与所有生物学重复（表 2）一起复制，并将它们转移到适当的程序（例如，GraphPad Prism7）以进行数据表示和统计分析（图 6））。执行适当的统计分析，将 POI 与其负控制进行比较（图 6）。

图 6. NbAGO4-1 和 NbAGO4-2 在 Split-LUC 检测中与 V2 相互作用。

显示了共表达 V2-NLuc 和 CLuc-NbAGO4-1（实验）或 CLuc-NbAGO4-2（实验）或 CLuc-SlWRKY75（阴性对照）的本氏烟草叶中 ROI 的相对荧光素酶活性的平均值。误差棒代表与四个生物学重复平均值的标准偏差。星号表示实验样品和阴性对照之间的统计学显着差异（根据单向方差分析和 Dunnett 多重比较，**：P < 0.01）。

食谱

农杆菌浸润缓冲液

1 M MES (pH 5.7) 100 μl

1 M 氯化镁2 100 微升

150 mM 乙酰丁香酮10 μl

加入 9.890 毫升水至 10 毫升

用 KOH 将 MES 调节至 pH 5.7。

将 MES 和 MgCl 2溶解在无菌水中，并用 0.2 μm 注射器过滤器过滤每个溶液以避免污染。将此储备溶液储存在 4°C。将乙酰丁香酮溶解在 DMSO 中，等分，并将该储备溶液储存在 -20°C。

LB培养基

10 克胰蛋白胨

5 克氯化钠

5 克酵母提取物

用 NaOH 将 pH 值调至 7.5，并加水至 1 L。要制备固体培养基，将 15 g 琼脂加入 1 L 培养基并高压灭菌。

致谢

感谢王元征在生成网关兼容载体（pGWB-NLuc 和 pGWB-CLuc）方面的帮助，感谢简新宇提供的技术和行政协助，感谢 Aurora Luque 在这项工作中提供的技术支持，以及 Lozano- Duran 和 Macho 实验室不断改进该协议并进行有益的讨论。这项工作得到了战略优先研究计划中国科学院（XDB27040204 和 XDB27040206）和上海植物胁迫生物学中心（中国科学院）。使用该协议的原始论文是 Wang, L.等人。（2020 年；DOI：10.7554/eLife.55542）。

利益争夺

作者没有要声明的竞争利益。

伦理

本协议中不使用人类或动物受试者。

参考

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Kaman-Toth, E.、Pogany, M.、Danko, T.、Szatmari, A. 和 Bozso, Z.（2018 年）。一种简化高效的根癌农杆菌电穿孔方法。3 生物技术8(3): 148。
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