材料和试剂

A. 土柱准备
1. 3D 打印塑料柱/聚氯乙烯 (PVC) 或高密度聚乙烯 (HDPE) 排水管
2. 双面胶带（Radabar 双面薄膜胶带 4000GA，10 × 50 毫米）
3. 布背胶带（Gaffa 胶带，Kitepackaging，英国）
4. 20升塑料储物盒
5. 风干和过筛（<2 mm）的田间土壤（砂壤土和粘壤土）
6. 抹刀（A2Z SciLab，32 毫米 × 8 毫米），7 英寸锥形端抹刀
7. 水稻、拟南芥种子

B. 牙根解剖成像
1. 载玻片（BS70011/2，1.0-1.2 mm，Thermo Scientific）和盖玻片（22 × 50 mm，No.1，SLS Ltd. UK）
2. Calcofluor white（M2R，荧光增白剂28）（Polysciences，目录号：4359）
3. 4% 多聚甲醛（默克公司，CAS 号：30525-89-4）
4. PFA电源（Sigma-Aldrich，目录号：P6148-1Kg）
5. 琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
6. 木糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：W507930-1Kg）
7. 脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：SRE0046-500g）
8. 尿素（Sigma-Aldrich，目录号：U5128-1Kg）
9. 4% PFA（见配方）
10. ClearSee（根清液）（见食谱）

设备

1. 手锯或切管机（RS Pro 150 毫米钢锯，英国）
2. 细网布（尼龙连衣裙网布，Fabric Land，英国）
3. 不锈钢剪刀（115 毫米）（弹簧虹膜剪刀，SS，N828/01，SAMCO）
4. 数字天平（HF4000，A&D Company Limited）
5. 微波炉
6. 精致的画笔
7. 镊子（Fisherbrand TM Dumont #5 细尖镊子，Z3）和镊子（Bochem TM不锈钢尖头镊子，1133）
8. GE Phoenix v|tome|x M 240 kV X 射线断层扫描系统（GE 检测技术公司，Wunstorf，德国）
9. 共聚焦显微镜 (Leica SP5/SP8)
10. Leica 振动切片机（Leica Microsystems，型号：VT1000s）
11. RS PRO 热板 (700W)（RS Components，Corby，英国。RS 库存号：490-1036）
12. 高性能工作站计算机
13. 推荐的系统要求：Intel Core i7 与 2.9 GHz 和 32-64 GB RAM（或更高）

软件

1. Volume Graphics VGStudioMax 2.2（Volume Graphics GmbH，德国）
2. Datos|REC 软件（GE 检测技术公司，Wunstorf，德国）
3. 折线追踪（VGStudioMAX V2.2（Volume graphics GmbH，德国）
4. 徕卡LASX（徕卡微系统）
5. Fiji/ImageJ (NIH)（Schneider等人，2012 年；Rueden等人，2017 年），版本 1.53c

程序

A. 土柱准备
1. 根据植物种类以及植物的生长时间，可能需要不同的柱尺寸。在我们的实验中，水稻在 10 厘米高 × 3 厘米直径的柱子中生长 10 天，每个处理至少四次重复。
注意：随着植物根部的生长，它们最终会到达柱子的边界。这将对根角和深度的测量产生影响。在根角的情况下，急剧向下的轨迹是常见的，因此我们建议仅测量与柱壁接触点的角度。应在初生根到达柱底之前测量初生根长度。建议对您正在处理的植物物种的根部的生长速度进行初步评估。
2. 为了便于在 X 射线 CT 扫描后从土壤中轻松移除植物，设计了一个柱子，该柱子可以很容易地纵向拆分并打开成两半。该柱还具有锥形底板和单独的固定夹具，便于在每次扫描时在 X 射线 CT 扫描仪内进行相同的放置。柱子和固定夹具均使用聚乳酸 (PLA) 中的熔融沉积建模 3D 打印机制造（图 1）。3D 模型的源文件和建议的打印设置可在https://github.com/UoNMakerSpace/ 获得。
3. 如果 3D 打印机不可用，请切割 10 厘米长、直径为 3 厘米的塑料排水管（图 2C），然后使用粗级（80 目）砂纸去除末端的任何毛刺。
注意：务必以 90° 角切割排水管，以确保立柱垂直直立。这有助于最小化 CT 扫描后重建数据体积的大小，因为不直（即倾斜）的列需要更大的体积视野来捕获扫描中的完整列。

图 1. 用于 CT 成像的 3D 打印柱示例。

4. 使用黑色记号笔在尼龙织物网（白色）上画一个半径为 2.5 厘米的圆圈，然后按照圆形标记用剪刀将其剪下来。
5. 切一条 0.5 cm 宽 × 8 cm 长的双面胶带并将其固定在塑料柱周围，使胶带边缘与柱底边缘齐平（图 2D）。在柱子底部拉伸尼龙织物网（图 2E），让胶带以均匀的张力将材料固定到位。在材料边缘缠上 10 厘米长的布背胶带，以牢固地固定柱（图 2F）。

图 2. 为在土壤中种植植物以进行 CT 成像准备柱的示例方法。
(A) 起始材料，(B) 标记 10 厘米排水管长度，(C) 用手锯切割排水管 (D) 贴在柱子上的双面胶带（倒置）和尼龙网圈（直径 5 厘米），（ E) 在去除双面胶带背衬后将尼龙网固定到柱子上，(F) 添加了布背胶带以将网格牢固地连接到柱子上，(G) 填充有土壤的成品柱子（正确向上）。

6. 计算柱的体积到 9 厘米的土壤填充高度。我们使用的直径为 3 cm 的色谱柱的体积为 63.62 cm 3 。测量空柱的半径、高度和重量以计算体积密度。
7. 为了使土壤容重 (BD) 达到 1.1 g/cm 3和 1.6 g/cm 3 ，分别向柱中添加 69.98 g 和 101.78 g 过筛（<2 毫米）的风干土壤。
笔记：
a. 进行非压实土壤处理（1.1 g/cm 3 ），称取69.98 g土壤，加入柱子，然后轻轻敲击柱子底部（填土过程中2-3次）使土壤沉降至9 厘米的柱高。
b. 进行压实土处理（1.6 g/cm 3 ），称取50.89 g土壤，压至占柱子高度4.5 cm，再加入剩余的50.89 g土壤，压至9 cm高度列。
8. 对于两种体积密度处理，添加 7.77 克土壤以创建一个非压实区域，最终土壤填充高度为 10 厘米。
注意：这有助于在柱子顶部建立预发芽的种子，否则大多数种子将无法在压实的土壤中生长。
9. 将色谱柱放在装有灭菌水的托盘中，深度为 3 厘米。在室温下放置过夜，使土壤从柱子底部向上饱和。
10. 8-12 小时后，确保土壤表面完全饱和，从水盘中取出柱子，让它们自由排水 48 小时，然后记录它们的质量。柱子的质量相当于土壤的名义田间持水量。
11. 将预先发芽的水稻种子放入土壤表面，轻轻覆盖土壤，将胚根放入顶部未压实的土壤中。小心不要损坏新兴的胚根。
注意：简而言之，去壳的水稻种子用 10% 的漂白剂溶液消毒 5 分钟，然后用消毒的反渗透 (RO) 水洗涤 5 次。将消毒过的种子在黑暗中放在湿的 Whatman 纸上两天，然后将发芽的种子轻轻地放在两列顶部的 1.1 BD 土壤中。
12. 将水稻幼苗在合适的生长室（30°C，12 小时光周期和300 μmol·m -2 ·s -1光照，70% 相对湿度）中生长4 天。通过检查每根柱子的重量并在需要时将水加到土壤的顶部表面，以保持每根柱子的田间容量的水分含量。应每天检查柱子的重量（图 3）。
注意：对于我们的土壤，1.1 g/cm 3和 1.6 g/cm 3 BD 处理的体积含水量分别为 18% 和 14% 。土壤含水量取决于土壤质地和有机质状态，因此根据您自己的特定实验条件计算这一点很重要。

图 3. 用于解剖尺度成像的根的识别和选择。
水稻 (A) 和拟南芥根 (B) 在 3D 打印（半开）柱中生长，生长在压实的土壤中。红色圆圈和黄色矩形分别显示水稻和拟南芥根的根尖区。(C) 在非压实土壤中生长的水稻根尖的纵向图像。
注意：对于压实研究，使用的是通过土壤而不是在土壤表面上生长的根尖。

13. X射线CT扫描前一天不要加水，因为土壤含水量高会降低根分割的效率。
注意：我们在扫描前将柱子在薄纸上扫描 12 小时，以减少土壤水分含量（大约 80% 的田间容量）。

B. X射线计算机断层扫描
1. 打开 CT 扫描仪后，首先通过按照制造商的指南调节和居中 X 射线管来优化 CT 扫描仪。为选定的 X 射线能量和探测器设置收集偏移（黑色）和增益（白色）探测器校准图像。此过程通常需要 20-30 分钟。
2. 表 1 中提供的扫描参数适用于使用 GE Phoenix v|tome|xm 240 kV CT 扫描仪对直径 30-60 mm 的土壤柱进行成像。将每个参数输入到 GE Datos acq 软件 (GE Sensing and Inspection Technologies GmbH, Wunstorf, Germany)。

表 1. 适用于对 30-60 毫米直径土壤核心进行成像的 X 射线 CT 扫描参数。
扫描在“快速”扫描模式下进行（样品连续旋转，无图像平均）。

3. 将带有植物的土柱放在旋转台上并确保其稳定。关闭扫描仪门，打开 X 射线，然后在监视器屏幕上选择“实时”图像。
4. 在软件中创建一个新项目用于扫描以保存图像。检查参数是否全部正确，然后按“开始”。
5. 扫描完成后，使用 GE Datos rec 软件重建数据。
6. 在 Datos rec 中打开扫描并使用扫描优化器工具计算几何中心校准，并抵消扫描过程中可能发生的任何样本移动。
7. 应用 8 的光束硬化校正 (BHC) 值，然后使用 AutoROI 功能设置感兴趣的区域进行重建，以去除通常包含锥形光束伪影的扫描体积的顶部和底部。以 16 位深度图像格式进行重建。
8. 重建的数据现在可以用于对非压实和压实土壤中的根进行折线追踪。
9. 在 VGStudioMAX 软件中打开数据，使用折线测量工具追踪根部从种子向下到土壤剖面的轨迹。记录每个根的长度（图 4）。

图 4. CT 图像显示水稻根系在 BD 为 1.6 g/cm 3 的压实土壤中的生长。
上部 1 cm 是未压实的土壤 (1.1 g/cm 3 )，以允许根部的初步建立；然后根长到柱子下部的压实 (1.6 g/cm 3 ) 土壤中。比例尺 20 毫米。

C. 牙根解剖成像（纵向）
1. 小心地打开 3D 打印列。
2. 从柱子上去除（切割）土壤，使根尖区（2 厘米）完好无损（见图 3B）。
3. 将含有根尖的 2 厘米土块放入无菌水中 5 分钟。
4. 用温和的水流冲洗土壤 3-5 次，以去除根尖上的土壤。
5. 最后，使用精细的油漆刷从根尖去除剩余的土壤颗粒。不要用力按压刷子，因为根尖很容易折断。
6. 在真空室中新鲜制备的 4% (w/v) 多聚甲醛溶液 (PFA) 中固定 (保存) 洗涤过的根尖 1 小时 (图 5A)。
7. 用 1× PBS 缓冲液清洗大米根尖 3 次，每次 2 分钟。
8. 使用 ClearSee 解决方案存储和清除根尖 15 天（图 5B）。使用共聚焦显微镜，检查是否使用 Calcoflour 染色清除根尖（图 5C）；如有必要，延长清算阶段（20-25 天）。
注意：压实土壤生长的根尖需要比非压实土壤根尖更长的时间（20-25 天）清除，因为它们具有更大的直径。

图 5. 示意图显示水稻根尖在 4% PFA 中固定 (A)、在 ClearSee 溶液中清除 (B) 和用 calcofluor 染料染色 (C)。比例尺 15 毫米。

9. 用 Yellow direct 96（二苯基亮黄素 7GFF Sigma）或 Calcofluor 染料（Calcofluor White Stain，Sigma）在真空室中以 100 µg/ml 的最终浓度染色根尖 2 小时。或者，如果没有真空室，可以在工作台上染色 3-5 天。
10. 用 ClearSee 清洗去除污渍 2 分钟。
11. 通过共聚焦显微镜对根尖进行成像，使用 405 nm 激发的氩激光和 425-475 nm 的检测（图 6）。
12. 在 ImageJ 软件中打开图像并设置比例。
13. 通过使用纵向图像选择每个表皮细胞，手动计算表皮根长度。

图 6. 水稻根尖在 (A) 非压实 (1.1g/cm 3 ) 和 (B) 压实 (1.6g/cm 3 ) 土壤条件下生长 10 天的纵向图像示例。
压实土壤中的水稻根系具有较大的根径。比例尺 100 µm。

D. 牙根解剖成像（径向）
1. 将洗过的根尖放入无菌水中 10 分钟，同时使用微波炉制备 3.5% 的琼脂糖凝胶溶液。
注意：使用微波的“脉冲”操作，每隔 5-10 秒间歇性地关闭和打开，以避免煮沸琼脂糖（煮沸的琼脂糖溶液可能会爆炸）。
2. 让琼脂糖溶液在室温下冷却 20 分钟。
3. 将根尖放入 3D 打印的嵌入模具中。
注意：您可以使用 Nottingham Maker Space GitHub 站点 ( https://github.com/UoNMakerSpace/ )获取 3D 打印文件。
4. 将融化的琼脂糖溶液慢慢倒入 3D 打印的嵌入模具中，覆盖在根尖上。
注意：在浇注过程中，根尖的方向可能会发生变化。为了减轻这种运动，首先用琼脂糖溶液完全填充模具，然后在琼脂糖凝固之前使用一对镊子重新定向根尖。
5. 在室温下保持 30 分钟直到完全固化。
6. 使用振动刀切割根尖的横截面。
注意：请遵循 Atkinson 和 Wells (2017) 中描述的详细 vibratome 协议。
7. 用 1% Calcofluor 白色染料将载玻片上的切片染色 5 分钟。
8. 将盖玻片放在根部分和图像上，使用如上所述的共聚焦显微镜（图 7）。

图 7. 在非压实土壤 (1.1g/cm 3 ) 中生长的水稻根的径向共聚焦图像。比例尺：100μ米。

9. 在 ImageJ 软件中打开图像。
10. 通过使用共聚焦显微镜中生成的径向图像测量皮质细胞的直径，量化图像中的根皮质细胞直径。

数据分析

A. 根长测量分析
1. 打开 VGStudioMAX 软件并使用折线测量工具跟踪所有 (2520) CT 图像切片的根长度。见视频 1。

视频 1. 演示如何使用 VGStudoMAX 软件中的折线工具测量根长。

2. 从种子的胚根出现开始，一直追踪到根尖的末端。
3. 折线工具将给出根的长度。
4. 这些来自非压实和压实土壤生长基因型的根长度数据将进一步用于使用 excel 或 GraphPad 棱镜软件计算平均根长度抑制百分比。
5. 使用t检验或方差分析计算显着性水平。
6. 独立重复实验至少 3 次，重复 12 次。

B. 皮质细胞直径和表皮细胞长度测量
1. 在 FIJI 软件 (Schindelin et al. , 2012) 中打开径向横截面共焦图像 (.tif 文件) (图 8)。

图 8. 说明如何 (A) 设置图像比例和 (B) 使用斐济软件量化根皮质细胞直径。
(A) 使用“线工具”测量比例尺，然后“设置比例”为 100 微米。(B) 使用线工具测量皮质细胞直径 (红色圆圈)。

2. 在分析部分选择比例尺长度并设置图像中给出的比例（例如 100 µm）。要测量比例尺的长度，请使用“直线”工具（图 8A）。
3. 放大径向共聚焦图像以更好地查看皮质细胞的边界。
4. 在覆盖其整个直径的每个皮层细胞上画一条线，并测量图像中每个皮层细胞的直径（图 8B）。
5. 对所有径向共焦图像重复此过程。
6. 使用 excel 和 GraphPad 棱镜软件分析皮层细胞直径的变化。
7. 使用t -test 或 ANOVA 计算控制和突变根之间的水平显着性。
注意：将在纵向图像中进行类似的分析，以计算在非压实和压实土壤中生长的根的表皮细胞大小。

食谱

1. 4% PFA（改编自 Ursache等人，2018 年）
PFA 粉末、磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、1 M KOH 和 1 M HCl
a. 将 4 克 PFA 粉末与 100 毫升 1× PBS 混合。要使其完全溶解，请使用磁力搅拌器在热板上将溶液加热至 65°C。
注意：不要煮沸溶液。PFA是致癌物质，非常有害！在使用这种化学品之前，您必须阅读 SOP。
b. 滴加 1 M KOH 直至完全溶解。
c. 当溶液变得完全透明时，稍微加入几滴 1 M HCl 以将 pH 值降低到 7（理想情况下为 6.9）。
注意：如果可能，请始终使用新鲜制备的 4% PFA。剩余的 4% PFA 可在 -20°C 或 4°C 下储存以供短期使用。
2. ClearSee（取自 Ursache等人，2018 年）
木糖醇（最终 10% w/v）
脱氧胆酸钠（最终 15% w/v）
尿素（最终 25% w/v）
无菌水
将所有三种成分在水中和磁力搅拌器上混合，直至完全溶解！需要更长的时间（~60 分钟）。

致谢

BKP 承认 BBSRC 发现奖学金 (BB/V00557X/1)，挑战补助金-皇家学会 (CHG\R1\170040)。BKP 和 JAA 获得了诺丁汉大学未来食品卓越灯塔的资助。作者感谢 Malcolm Bennett 和 Darren Wells 在准备这份手稿时提出的宝贵意见。该协议是对 Pandey 和 Huang (2021; DOI: 10.1126/science.abf3013) 先前发表的一项研究稍加修改后改编的。

利益争夺

作者声明没有竞争或经济利益。

伦理

根部土壤压实研究不需要伦理委员会的批准。

参考

1. Atkinson, JA 和 Wells, DM (2017)。高通量植物组织切片的更新方案。Front Plant Sci 8：1721。
2. Keller, T.、Sandin, M.、Colombi, T.、Horn, R. 和 Or, D.（2019 年）。农业机械重量的历史增加提高了土壤压力水平，并对土壤功能产生了不利影响。土壤耕作研究194：104293。
3. Pandey, BK 和 Huang, G.（2021 年）。植物根系通过限制乙烯扩散来感知土壤压实。科学371(6526)：276-280。
4. Schindelin, J.、Arganda-Carreras, I.、Frise, E.、Kaynig, V.、Longair, M.、Pietzsch, T.、Cardona, A. (2012)。斐济：一个用于生物图像分析的开源平台。Nat 方法9 (7): 67-682。
5. Ursache, R.、Andersen, TG、Marhavy, P. 和 Geldner, N.（2018 年）。将荧光蛋白与不同细胞壁成分的组织学染色相结合的协议。植物学杂志93(2)：399-412。