材料和试剂
1.细胞过滤器40 µm尼龙（Falcon，目录号：352340）
2.超低附着表面 24 孔板（Corning，目录号：3473）
3.不含钙和镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS；Corning，目录号：21-031-CV），室温下保质期为 2 年
4.0.2％胶原酶A（Roche，目录号：11088793001），从PBS中的冻干原液新鲜重构
5.°C 下24 个月的保质期
6.°C 下的 12 个月保质期
7.100 µg/mL 转铁蛋白（Sigma，目录号：T8158），-20 °C
8.20 nM黄体酮（Sigma，目录号：P8783），-20 °C
9.30 nM亚硒酸钠（Sigma，目录号：S8295），-20 °C
10.60 nM二盐酸腐胺（Sigma，目录号：P5780），-20 °C 4年保质期
11.°C 下的 1 年保质期
12.bFGF （小鼠 FGF 碱性重组蛋白；Gibco，目录号：PMG0035），-20 °C 下的 1 年保质期
13.°C 下的 1 年保质期
14.胰岛素（Sigma，目录号：I1882）在-20 °C
15.°C 2年保质期
16.大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI；Sigma，目录号：T9128）在-20 °C
17.消化缓冲液（见食谱）
18.球形培养基（见食谱）
19.2 × SBTI 解决方案（见配方）

设备

1.摇床（Thermo Scientific， MaxQtm 4000 台式轨道摇床）
2.离心机（Thermo Scientific， Sorvall ST 16R 离心机）
3.培养箱（Thermo Forma，系列 II 水套 CO 2培养箱）

程序

A.从缝合间充质中分离间充质细胞
1.解剖 2 毫米宽的颅骨组织，其中包含矢状 (SAG) 缝合线及其相邻的顶骨（图1 ）。

图1.小鼠颅骨和缝合线示意图。
F，额骨； P，顶骨； IP，顶骨。

2.提示：从脑膜中取出颅骨很容易。切口尺寸应尽可能小，以限制来自骨髓和骨膜的污染细胞的数量。
3.用两个镊子抓住顶骨的两侧，轻轻地将它们拉开（图 2）。

图 2. 示意图说明骨片分离以从缝合间充质中释放细胞。

4.注意：包含两个小顶骨片的解剖颅骨组织必须在中线分开，以暴露缝合间质。否则，骨骼干细胞的数量将显着减少。
5.提示：为避免从骨髓中污染干细胞，请勿将分离的颅骨组织切成碎片（此过程用于颅骨细胞分离）。不要将解剖的组织放在冰上，而是按照步骤 6 中的说明用消化缓冲液快速孵育。
6.将分离的片段浸入 40 mL 的消化缓冲液中，并在 200 × g （ MaxQtm 4000 台式轨道摇床）和 37°C 的摇床上孵育 1 小时。
7.通过 40 μm 过滤器过滤分离的细胞。
8.× g 和 4°C 下离心 7 分钟来离心细胞。
9.去除上清液以收集细胞沉淀。
10.提示：从一根矢状缝中可以获得大约 5 × 10 4 个细胞
11.提示：已在出生后第 10 天（P10）和 P28 从小鼠颅盖骨中成功分离缝合间充质细胞。

B.球体文化
1.用球形培养基重悬细胞沉淀并计算细胞数。
2.在 2 mL 的球体培养基中播种细胞，在超低附着表面 24 孔板上每孔10 4 – 10 5 个细胞（图 3A）。
3.每隔一天小心地更换培养物中一半的培养基，不受细胞沉降的干扰。
4.提示：球体形成将在 10 到 14 天内可见（图 3B 和 Maruyama等人，2021）。

图 3. 显示球体培养 1 天 (A) 和 8 天 (B) 后的细胞的代表性图像。比例尺，200 µm。

5.提示：大部分球体源自单个干细胞（Maruyama等人，2021 年）。
6.通过肾包膜移植和标签保留分析，已证明使用第 1 次和第 3 次球体传代可在培养中维持干细胞干细胞性，例如骨形成能力和静止（Maruyama等人，2021 年） .
7.肾包膜移植试验评估骨形成能力，然后进行 von Kossa染色和成骨细胞标志物的免疫染色。通过球培养中的脉冲追踪测定来检查静止状态。

C.传球球
1.一些球体可能很弱地附着在井底。要分离球体，请上下轻轻吸管培养基。
2.×离心收集细胞悬液 g和 4°C 7 分钟。
3.取出上清液并轻敲试管以轻轻打碎颗粒。
4.加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶重悬沉淀，然后在 37°C 下孵育 5 分钟。
5.添加 1 mL 的 2 × SBTI 溶液以停止胰蛋白酶的活性。
6.300 ×离心机 g和 4°C 7 分钟。
7.去除上清液并轻敲试管以轻轻打碎颗粒。
8.重悬球体培养基中的细胞并计数细胞数。
9.4 – 10 5 个细胞播种细胞。
10.提示：这种培养方法仅限于五个段落。

数据分析

A.球体测量
1.轻轻移液器将球体从培养板中分离出来。
2.提示：不需要特殊的移液器吸头，只需要产生少量培养基流量的通用吸头即可。
3.使用显微镜下的相机拍摄图像，例如NIKON CB-115 （图 5、6，Maruyama等人的补充图 S9、 S10，2021）。
4.通过 ImageJ 测量球体数量和大小（Maruyama等人的图 6、补充图 S9、 S10，2021）。
5.提示：ImageJ的基本功能：官方页面（ https://imagej.nih.gov/ij/index.html）“Documentation”-“Tutorials and Examples”下的“ ImageJ Basics（PDF文件）”。
6.计算直径 > 20 µm 的球体。
7.执行至少三个独立实验进行统计评估。
8.使用双面学生t检验检查球体数量和大小的统计显着性。

B.肾包膜移植后骨形成的评估
1.对移植的肾囊中的骨骼进行整体 von Kossa染色（图 4、5、6，补充图 S9、Maruyama等人的S10，2021）。
2.使用显微镜拍摄的图像，例如., NIKON CB-115。
3.通过 ImageJ 测量染色区域的大小。
4.执行至少三个独立实验进行统计评估。
5.使用双面学生t检验检查球体数量和大小的统计显着性（Maruyama等人的补充图S10，2021 ）。

食谱

1.消化缓冲液 (40 mL)
DPBS 含有 0.2% 胶原酶 A、1% 青霉素-链霉素和 10 mM HEPES
2.球体文化传媒
25 µg/mL 胰岛素
100 µg/mL 转铁蛋白
20纳米黄体酮
30 nM 亚硒酸钠
60纳米腐胺
20 纳克/毫升表皮生长因子
20 纳克/毫升 bFGF
1 × B27 补充
1% 青霉素-链霉素
3.2 × SBTI 解决方案
1 mL DPBS 中的 2 mg SBTI

致谢

作者感谢前任和现任实验室成员的技术和智力支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院 (DE15654、DE269369) 和 NYSTEM (C029558) 对 WH 的支持。该协议源自发表在《科学转化医学》上的原始研究论文（丸山等人，2021）。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

伦理

这项工作中描述的实验动物的护理和使用符合罗切斯特大学动物资源大学委员会和福赛斯研究所 IACUC 的指导方针和政策。

参考

1.Caplan, AI 和 Correa, D. (2011)。 MSC：伤害药店。细胞干细胞9（1）：11-15。
2.da Silva Meirelles, L.、Chagastelles, PC 和 Nardi, NB (2006)。间充质干细胞几乎存在于所有产后器官和组织中。 J 细胞科学119（Pt 11）：2204-2213。
3.Friedenstein, AJ, Chailakhyan, RK, Latsinik, NV, Panasyuk, AF 和 Keiliss-Borok, IV (1974)。负责转移造血组织微环境的基质细胞。体外克隆和体内再移植。移植17（4）：331-340。
4.Maruyama, T.、Jeong, J.、Sheu, TJ 和 Hsu, W. (2016)。缝合间充质干细胞在颅面骨发育、修复和再生中的作用。国家通讯7：10526。
5.Maruyama, T.、Stevens, R.、Boka, A.、DiRienzo, L.、Chang, C.、Yu, HI、Nishimori, K.、Morrison, C. 和 Hsu, W. (2021)。 BMPR1A 在颅面发育和颅缝早闭中维持骨骼干细胞特性。 Sci Transl Med 13（583）：eabb4416。
6.Robey, PG, Kuznetsov, SA, Riminucci, M. 和 Bianco, P. (2014)。骨髓基质细胞测定：体外和体内。方法 Mol Biol 1130：279-293。
7.Sacchetti, B., Funari, A., Michienzi, S., Di Cesare, S., Piersanti, S., Saggio, I., Tagliafico, E., Ferrari, S., Robey, PG, Riminucci, M.,等人。（2007 年）。骨髓血窦中的自我更新骨祖细胞可以组织造血微环境。单元格131（2）：324-336。
8.Zeitouni, S., Krause, U., Clough, BH, Halderman, H., Falster, A., Blalock, DT, Chaput, CD, Sampson, HW 和 Gregory, CA (2012)。用于增强骨再生的人间充质干细胞衍生基质。 Sci Transl Med 4（132）：132ra155。