材料和试剂
1.小鼠（至少 10 周龄）
2.异氟烷
3.快速流动瓶顶过滤器，0.2 μ m （ ThermoFisher ，目录号：291-4520）
4.封口膜 (Bemis)
5.1 mL滑动尖端注射器（BD，目录号：309659）
6.凝胶加载尖端（Fisher，目录号：02-707-138或 Bio-Rad，目录号：223-9915 ）
7.铜钟线
8.35 mm组织培养皿（BD，Falcon Easy Grip，目录号：353001）
9.1.5 mL管（Eppendorf，目录号：022363204）
10.50 mL锥形离心管（BD，目录号：352098）
11.无水乙醇
12.KCl （Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
13.Noble Agar，Ultrapure（ ThermoFisher ，目录号：AAJ1090736）
14.次氯酸钠，5%（Clorox 氯漂白剂）
15.NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
16.CaCl 2 ·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）
17.MgCl 2 ·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M2393）
18.葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
19.HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
20.赖氨酸-Cl（Sigma-Aldrich，目录号：L8662）
21.天冬氨酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：A6683）
22.甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M9647）
23.道康宁高真空润滑脂
24.湿或干600粒度超细砂纸（3M，目录号：1077259）
25.超锋利的无涂层单刃剃须刀片（GEM，目录号：121-2）
26.5% CO 2 /95% O 2医用级气体混合物
27.DMSO，组织培养级（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
28.重组鼠TNFα（R&D Systems，目录号：410-MT）
29.3 M KCl (100 mL)（见配方）
30.琼脂溶液（100 mL 在 3 M KCl中）（参见食谱）
31.70%乙醇（见配方）
32.10 M NaOH 溶液（100 mL）（见配方）
33.1 M HEPES (100 mL) （见食谱）
34.林格氏盐水（500 毫升）（见食谱）
35.林格甘露醇（500 毫升）（见食谱）
36.稀释的林格氏盐水/甘露醇 (1:4)（见食谱）
37.Ringer's Lysine-Cl (500 mL)（参见食谱）
38.林格氏天冬氨酸钠 (500 mL)（参见食谱）
39.1,000 × TNFα (50 μg /mL) （见配方）

设备

1.鼠标解剖套件（World Precision Instruments，目录号：MOUSEKIT）
2.解剖盘，铝，带乙烯基解剖垫（Carolina Supply，目录号： 629004)
3.硅胶解剖垫套件（World Precision Instruments，目录号：501986）
4.奥林巴斯 SZX12 解剖显微镜或同等产品
5.双通道、独立的Ussing室（Warner Instruments，目录号：U2500）
6.定制的插件盒，插槽尺寸：宽175 μm ，长 1,500 μm （Emory Department of Physics Machine Shop），外部尺寸可与 Warner Instruments 盒式磁带相媲美，目录号：U9924C-05。
7.电极组（2 个 Ag/AgCl 颗粒和 2 个 Ag 线）（ ADInstruments ，目录号： U9975A ）
8.电极桥接头套件（12 个接头和 6 个适配器）（ ADInstruments目录号：U9565SC ）
9.本生灯
10.500 mL Erlenmeyer 烧瓶连接到内部真空管
11.万用表欧姆表/电压表（ Kosmos FKV-1025 或同等产品）
12.带3 爪夹的实验室支架
13.多通道电压/电流钳控制器（Physiological Instruments，目录号：VCC-MC2）
14.循环水浴（ Haake DC10 或同等产品）
15.费雪布兰德 accumet AB315 pH 计带电极 (13636AB315A)
16.章动平台（VWR，目录号：82007-202）

软件

1.Acquire & Analyze 软件 2.3 版（生理仪器）
2.Excel（微软）

程序

A.使用室电极制备

1.氯化银线
a.接头的筒端为内螺纹，可连接外螺纹 Ag/AgCl（电压）电极和 Ag 线（电流）电极。请注意，Ag 线电极也可以用作电压电极，但 AgCl 颗粒电极只能用作电压电极。制作大量备用电极，以防它们在实验过程中失效。
b.用 100% 乙醇清洁电极丝。
c.要去除旧的氯化物涂层，请快速将电线穿过火焰。小心不要熔化塑料接头。正确燃烧的电线将呈亮银色。
d.要将 Ag 线氯化，将 ~ 20 mL 新鲜的全强度普通家用漂白剂 (Clorox) 放入 50 mL 塑料管中，并将电线浸入 15 至 30 分钟，直到观察到紫灰色。通过将导线浸入装有蒸馏水的管中进行冲洗，并在电极组装前摇干。如果电线看起来不是均匀的灰色/紫色，或者在欧姆表测试中失败，请使用超细砂纸（600 粒度）对其进行清洁，然后重新处理。
e.AgCl 颗粒电极不需要漂白处理，但如果它们被腐蚀，用超细砂纸轻轻打磨，然后用蒸馏水冲洗。
2.桥接配件和琼脂填充
a.准备琼脂桥溶液（参见配方），使其在约 65 – 75°C 下熔化。
b.电极桥接头是改良的凝胶加载微量移液器吸头，带有与Ussing室的插入端口（图 1 中的端口 2 和 3）相匹配的Luer锥形。
c.切掉吸头的顶部，使适配器接头紧贴吸头顶部（图 2）。

图 1.使用腔室端口连接。经 Warner Instruments 许可使用，©2022。

图 2. 电极准备。
一种。显示的是两个 Ag 线电极，一个是清洁的（顶部），另一个是完全氯化的（底部）。 B. Ag 颗粒电极。 C. 尖端准备。对角线表示用安全剃刀刀片切割尖端的位置和方向。切割顶部以使尖端与电极适配器很好地配合，在电极填充琼脂并组装后切割底部。 D. 完全组装的电极。比例尺：3 厘米。

d.用大约 0.4 mL 的融化琼脂溶液填充 1 mL 注射器。
e.KCl溶液缓慢注入桥接头的尖端，确保尖端和接头完全充满并且没有气泡形成。
f.将电极连接到配件上并将它们拧入到位。让溶液在配件内冷却和固化。琼脂溶液将在凝固过程中正确封装 Ag/AgCl 颗粒或 Ag 线。
g.冷却和凝固后，以 45° 角切割尖端的底部，使最大可能的尖端区域暴露在膜上。
3.测试电极
a.的正极端子 ( VΩmA ) 连接到包含 Ringer 盐水缓冲液的 50 mL 管中的铜线（图 3）。
b.将要测试的电极连接到公共 (com) 端子，然后将其放入 Ringer 的盐水缓冲液中。仅将电极尖端置于缓冲液表面下方，不要完全浸没电极。
c.将欧姆表设置为 20KΩ。电阻应该在一分钟左右内稳定到一个正值。如果读数为负数或显示没有小数位的“1”，则电极有故障，不应重新组装。
4.实验期间不使用时，将备用电极放在林格盐水中（室温下）。
5.实验完成后拆卸电极。颗粒电极很容易被腐蚀并碎裂，因此重要的是要对其进行清洁，在蒸馏水中彻底冲洗并小心干燥。

图 3. 测试电极。
A. 电极测试装置示意图。红线是将伏特欧姆表连接到林格盐水的铜线，黑线包含组装的桥电极。 B. 显示功能电极的装置和测量的照片。

B.分离肠系膜小动脉和小静脉

1.用二氧化碳或异氟醚 (2.5%)麻醉至少 10 周龄的小鼠，并通过颈脱位处死它们。安乐死后尽快取出整个肠系膜。
2.将鼠标固定在解剖板上，并使用 70% 乙醇水溶液对其进行消毒。
3.使用手术解剖剪刀在皮肤上做一个切口，从胸骨下方开始。继续沿中线切割到骨盆。然后在两侧进行横向切割，并将皮肤固定在解剖板上。
4.用镊子夹住腹壁，用手术剪剪开。
5.轻轻地将肠子抬出腹腔，并在直肠上方和胃下方用缝合线缝合，以避免泄漏。
6.切开刚刚经过缝合部位的肠子。用 Ringer's Saline 缓冲液冲洗。
7.转移到含有弹性体解剖垫的培养皿中，用冷林格氏盐水缓冲液润湿，并将空肠末端固定形成一个圆圈，传播空肠拱廊，从而更容易可视化和隔离各个血管分支（图 4A）。

图 4. 为血管研究分离肠系膜小动脉。
弹性计并充满生理盐溶液的培养皿中。 B. 放大的明场图像显示肠系膜中不同类别的血管和组织之间的区别。比例尺：1 毫米。 C. 放大图像，说明在去除脂肪组织、静脉、淋巴管和结缔组织后选择用于插管的 5 级动脉。图 3A 和 3C 由大学细胞生物学和生理学系的Perenkita Mendiola 提供。新墨西哥州，阿尔伯克基，NM，并经许可使用（ Wenceslau 等。 , 2021)。图 3B 经 Sabine等人的许可使用。（2018 年）。

8.使用 10 ×解剖显微镜来识别组织内的小动脉和小静脉。两者都有清晰的内腔。
a.因为它们被血管平滑肌包围，小动脉壁光滑，比小静脉更坚硬。与小静脉相比，淋巴管往往更不透明，瓣膜更频繁和突出（图 4B）。
b.通过 Q-RT-PCR 或免疫组织化学，可以使用小动脉 ( GJA5 ) 或小静脉 ( CLDN11 )标记物进一步验证血管身份（ Buschmann等人，2010；Maier -Begandt 等。 , 2021)。
9.去除不相关的组织以显示感兴趣的血管（图 4）。
10.取出长度为 2 – 3 mm 且直径为 100 μm或更小的 2级和 3级动脉或静脉，然后纵向切割，并转移到含有林格氏盐水缓冲液的 35 mm 组织培养皿中。
a.此时，隔离的容器已准备好安装到Ussing室中。静脉和动脉都可以使用这种方法进行分析。
b.Ussing室之前，可以用不同的试剂或细胞因子对容器进行预处理。
i.将新鲜分离的容器放入含有 800 μL林格氏盐水缓冲液的 1.5 mL Eppendorf 管中，其中含有预热至 37°C 的 TNFα (50 ng/mL) 或对照载体 0.1% 二甲基亚砜 (DMSO)。
ii.在 37°C 下孵育 30 分钟，同时在章动平台上摇动。
iii.将容器装入Ussing室。

C.使用室组件

1.初步腔室准备
a.确保您有足够的 Ringer's Saline 缓冲液并将其预热至 37°C。腔室组件的初始填充将需要大约 36 mL 的缓冲液。需要额外的体积来补充通过正常蒸发损失的液体，以及在实验过程中为取样或缓冲液交换而去除的任何液体。
b.用真空润滑脂轻轻涂抹内室的 O 形密封圈（图 5）。

图 5.使用腔室装置。
A. 分解图，经 Warner Instruments 许可使用，©2022。 B. 显示完全组装和连接的Ussing室的照片。

c.将水循环源连接到腔室，然后打开循环浴。开始水循环，使腔室达到所需的工作温度（通常为15-30分钟）。
d.使用两个夹紧螺钉将两个半电池松散地组装在腔室底座上，以便有足够的间隙用于插入墨盒。
e.将所有电极桥接头插入各自的端口。轻轻推动，直到它们靠在内部挡块上。确保电压/钳装置设置为“零”，并将电极的 2 mm 引脚直接连接到电压钳的头部。确保 V1 和 I1 连接到腔室的同一侧，以及 V2 和 I2（参见图 1 和图 5）。
f.通过将手柄转动到垂直于阀体的位置，确保排放口中的 2 通旋塞阀已关闭。实验完成后，这些端口提供了一种在分离两半之前从腔室中排出缓冲液的便捷方式。
2.容器安装和腔室组装
a.在组织盒的两半之间定位容器（图 6）。在组织周围的区域使用一层薄薄的真空润滑脂，以提供紧密的密封。跟踪顶端/基底外侧方向。血管略微弯曲。当放置在凹面方向向上的表面上时，顶端方向在顶部。

图 6. 专为血管分析而设计的组织盒。
A. 组织盒示意图，经 Warner Instruments 许可使用，©2022。样品被放置在盒子的两半内。 B. 箭头表示照片中暗盒的水平开口。比例尺，1 厘米。 C – D. 卡带的放大图像，显示开口面积约为 0.26 mm 2 （红线；C），可完全覆盖纵向切片血管（静脉边界标记为蓝色；D）。比例尺，750 μ m (C) 和 650 μ m (D)。 C 和 D 中的数字标记反映目镜放大率。图 BD 来自Maier -Begandt等人。（2021），经许可使用。

b.通过用封口膜制成的垫圈将它们包围来密封盒式磁带。如果组织盒泄漏或导致短路测量，请在组装前在内表面涂上一层真空油脂薄膜。
c.将墨盒插件放入松散组装的半腔中（图 4）。请注意，大孔位于底部，插入时将与腔室的中心对齐。插入墨盒后，牢固地拧紧螺丝夹，但不要过度拧紧。夹子必须同样拧紧，O 形圈才能正确地固定在墨盒插件的侧面。如果未对准或未正确拧紧，腔室将泄漏。目视观察半腔室每一侧的间隙大小，并调整夹紧螺钉使该间隙间距相等。
d.使用温控水浴，在 37°C 下用林格盐溶液平衡腔室 5 – 10 分钟。在实验过程中，溶液使用 5% CO 2 /95% O 2医用级气体混合物进行充气。
e.Ussing室的引线连接到多通道电压/电流钳控制器。

D.电生理测量

1.校准
a.将 FUNCTION 切换到 OPEN 并将 METER 切换到电压 (V)。电压读数反映了系统中的所有不对称性。为了对此进行补偿，如果它不等于零，请将 OFFSET 开关置于正或负位置，然后调节 OFFSET 控制旋钮，直到仪表上的电压读数为 0.00。
b.将流体阻力补偿 (FLUID RES COMP) 设置为 0.0。
c.将 METER 切换到电流 (I) 并按住 PUSH TO ADJ 测试按钮。仪表上的电流应为 60 – 68 μA 。如果不是，请调整 FLUID RES COMP 直到它在范围内。
d.将 MODE 设置为远程 (REM)，并使用Acquire & Analyze 软件控制电压/电流钳装置。
e.校准只需在每个 Ussing 室会话中进行一次，除非需要更换电极。
2.TEER 和Isc测量
a.要测量电压电位 (mV)，请将电流钳位到 0 μA ，然后收集 2 分钟的平衡数据。持续一致的电压测量表明系统和样品工作正常。如果系统不提供电压测量值，则表明一个或多个电极不起作用，应更换。
b.要测量电阻（欧姆），请将电压钳位（设置）为 20 mV，周期 = 10.0 秒，持续时间 = 0.30 秒，极性为正（+）。收集数据至少 10 分钟，确保测量已达到平衡状态。将电阻乘以面积以获得跨内皮电阻 (TEER; Ohm × cm 2 )，如下所述。 TEER 值应大于零；如果不是，则组织样本已受损，应更换。
c.要测量短路电流 ( Isc ; μA )，请将电压钳位到 0 mV，然后收集 10 分钟的平衡数据。
3.稀释电位测量
a.将电流钳位到 0 μA并收集 10 分钟的平衡数据，测量林格氏盐水中的电压电位 (mV) 。
b.用预热的稀释林格氏盐水/甘露醇 (1:4) 替换腔室顶端的林格氏盐水。
c.测量电流钳制到 0 μA 的电压电位 (mV) ，然后收集 10 分钟的平衡数据。
d.所述计算稀释电位 (V DP ; mV)。
4.林格赖氨酸-Cl 中的测量（可选）
a.用预热的 Ringer's Lysine-Cl 替换两个腔室。
b.如上所述，在电流钳位到 0 μA 的情况下测量电压电位。
5.林格氏天冬氨酸钠的测量（可选）
a.用预热的林格的天冬氨酸钠替换两个腔室。
b.如上所述，在电流钳位到 0 μA 的情况下测量电压电位。

数据分析

对于所有分析，将数据从 Acquire & Analyze 导出到 Excel。当样品达到稳态平衡时，以 20 – 100 个值的平均值计算时，测量结果最为准确。
1.经内皮电阻 (TEER; Ohm x cm 2 ) 通过平均在时间过程中收集的多个值并乘以样本面积（定制容器组织盒为0.26 mm 2 ）来计算。 TEER 是衡量整体组织阻力的指标，反映了跨细胞和细胞旁离子转运途径的贡献。
2.短路电流 ( Isc ; μ A ) 直接在电压钳位在 0 mV 时获得。 Isc表示将电压电位钳制为零所需的外部电流，并提供了对主动传输引起的总离子运动的测量。
3.电压电位 (V; mV) 直接在电流钳位在 0 μA时获得。
4.稀释电位 (mV) 由 V DP = V undil – V 1:4 dil计算，其中V undil和 V 1:4 dil是从未稀释的林格盐水和稀释的林格盐水/甘露醇 (1:4) 获得的电压电位测量值。离子梯度对电压电位的影响受对阳离子和阴离子的渗透性差异的影响，并提供了一种测量相对离子渗透性的方法。
5.选择性渗透率的计算基于 Hou等人的方法。 (2005)，这是从 Goldman-Hodgkin-Katz 方程推导出来的。要从稀释电位测量值计算相对渗透率 ( P Na / P Cl ) ，请使用以下等式：
a.ν = V DP / qkT
q=1，对于 NaCl； q = 电荷
kT = 8.617 × 10 -2 mV/deg K × 310.1 deg K = 26.72 mV，T=37 ° C
k = 玻尔兹曼常数； T = 温度
b.P Na / P Cl = – (ε – e ν ) /( 1 – ε · e ν )
ε = 4（稀释因子）
e = 欧拉数
6.示例实验
°C的50 ng/mL TNFα 或载体对照中孵育30 分钟。如图 7 所示，在 TNFα 治疗后 30 分钟，静脉的 TEER 降低了约 2.4 倍，这与这种促炎细胞因子对血管屏障功能的影响一致。当电流被钳位到 0 mA 时，通过测量血管跨内皮电位来检查由 TNFα 引起的血管离子选择性渗透性的变化。在正常林格氏盐水缓冲液中 -1.1 mV 的对照条件下， TNFα 诱导静脉极性从 1.3 mV 变化。当用天冬氨酸代替Cl -或赖氨酸代替Na +时，静脉电位显示出相当的TNFα依赖性极性变化，这表明TNFα对跨内皮电位的影响涉及Na +和Cl -通透性的变化。稀释电位测量表明，TNFα 处理特异性地增加了静脉 Cl -通透性，这反映在P Na /P Cl的降低上。离子渗透性的这些变化表明 TNFα 对内皮屏障功能的影响不是由于紧密连接的明显破坏而产生了无阻力的扩散路径。确定这些 TNFα 依赖的离子通透性变化是否是由于离子通道或密蛋白调节的改变可能提供潜在的靶点来防止血管渗漏以响应炎症。

图 7. TNFα 对静脉电生理的影响。
离体二级和三级肠系膜静脉用载体（PBS 中的 0.1% DMSO）或 TNFα（50 ng/mL）处理 30 分钟，并安装在生理林格溶液中的Ussing腔盒上。 A – B.如上所述测量和计算跨内皮电阻 (TEER)，其中 A 是示例迹线（DMSO，蓝色；TNFα，红色），B 代表汇总数据。 *** P = 0.0005 (B) 通过未配对的双尾 t 检验，n = 3 – 5 个小静脉。 C. 用 TNF α (50 ng/mL)处理 30 分钟，然后在林格氏盐水（NaCl，红色）、林格氏天冬氨酸钠（ NaAsp ，绿色）和林格氏赖氨酸-Cl （LysCl ，蓝色）。 D. 汇总数据表明静脉显示响应TNF α 的离子渗透性变化增加。空心圆圈代表载体对照，实心圆圈代表用TNF α (50 ng/mL) 处理的血管。 # P =0.064 和 ** P =0.0093，通过双向 ANOVA 和 Fisher 的 LSD 检验进行分析。在这两种情况下 (D)，每次治疗 n = 5 个小静脉。 E。 _如上所述计算离子选择性渗透率。 * P = 0.034，通过单向方差分析 Fisher 的 LSD 检验，n=4 – 5 个小静脉。 B、D 和 E 中的图表示平均值 ± SD，并从Maier-Begandt等人再现。（2021），经许可使用。

笔记

1.等人提供了一段视频，显示了对小鼠 4级肠系膜小动脉的解剖。（2015 年）。此处描述的协议是为使用 2 nd和 3 rd顺序小静脉和小动脉的Ussing腔室测量而设计的。
2.桥电极需要在实验当天新鲜制作。无法获得可重复的电流或电压测量值表明电极出现故障。为了计划这种可能性，最好制作备用电极，以便随时更换。
3.林格溶液应在制成后一个月内使用。它们应冷藏储存，并在使用前预热至 37 °C 。
4.使用林格氏天冬氨酸钠和林格氏赖氨酸-Cl 的测量（Alexandre等人，2005 年）提供了一种验证P Na / P Cl测定的方法，通过用相对不渗透、带相当电荷的氨基酸代替 Cl -和 Na +来验证 P Na / P Cl 测定分别分离Na +和Cl -对跨内皮电流的贡献。
5.此处描述的协议侧重于屏障功能测量以及它们如何受到 TNFα 的影响。然而，这种方法可以很容易地适应其他测量。例如，可以使用这种方法研究转基因小鼠的血管，以确定特定蛋白质在内皮屏障功能中的作用。由于离子渗透性是通过细胞旁途径（通过紧密连接）和跨细胞途径（通过质膜离子通道）的通量的组合，因此可以使用特异性抑制离子通道的药物来解释通过跨细胞途径的转运（ MacAulay， 2021；Schultz等人，1999； Verkman和Galietta ，2009）。

食谱

1.3 M氯化钾（100 毫升）
22.37 克

2.琼脂溶液（100 mL 在 3 M KCl中）
琼脂 3.3 克
要溶解，琼脂需要双锅，不要直接用微波炉加热。取而代之的是，将 200 毫升水放入一个大烧杯中，然后将水单独微波至接近沸腾。将烧杯放在热板上（设置 = ~7 - 8），将装有琼脂的瓶子放入其中，盖子稍微松开。加热直到琼脂溶液均匀融化，然后降低到 4 - 5 的设置，让琼脂部分冷却。请注意，这与琼脂糖不同。琼脂溶液可提前制备并储存在 4 °C。

3.70%乙醇
用 30 mL 的 H 2 O稀释70 mL 的无水乙醇

4.10 M NaOH 溶液 (100 mL)
40.0 克

5.1 M HEPES (100 毫升)
将 23.8 克 HEPES 溶解在 80 毫升 H 2 O中
用 10 M NaOH 溶液调节到 pH 7.5
稀释至 100 mL 总体积

6.林格氏盐水 (500 mL)
140 毫米氯化钠：4.09 克
2 mM CaCl 2 · 2H 2 O：147 mg
1 mM MgCl 2 · 6H 2 O：102 mg
10 毫米葡萄糖：901 毫克
10 毫米 HEPES：1.19 克
用 1 M HEPES 调节至 pH 7.3，然后过滤 (0.2 μm )。该溶液可提前一个月配制，冷藏保存，使用前预热至 37 °C 。

7.林格氏甘露醇 (500 毫升)
280 毫米甘露醇：25.5 克
2 mM CaCl 2 · 2H 2 O：147 mg
1 mM MgCl 2 · 6H 2 O：102 mg
10 毫米葡萄糖：901 毫克
10 毫米 HEPES：1.19 克
用 1 M HEPES 调节至 pH 7.3，然后过滤 (0.2 μm )。该溶液可提前一个月配制，冷藏保存，使用前预热至 37 °C 。

8.稀释的林格氏盐水/甘露醇 (1:4)
在使用当天将 25 mL 的 Ringer's Saline 与 75 mL 的 Ringer's Mannitol 混合。使用前预热至 37 °C 。

9.林格氏赖氨酸-Cl (500 mL)
140 mM 赖氨酸-HCl：12.8 克
2 mM CaCl 2 ·2H 2 O：147 mg
1 mM MgCl 2 ·6H 2 O：102 mg
10 毫米葡萄糖：901 毫克
10 毫米 HEPES：1.19 克
用 1 M HEPES 调节至 pH 7.3，然后过滤 (0.2 μm )。该溶液可提前一个月配制，冷藏保存，使用前预热至 37 °C 。

10.林格氏天冬氨酸钠 (500 mL)
140 mM 天冬氨酸钠：12.1 克
2 mM CaCl 2 ·2H 2 O：147 mg
1 mM MgCl 2 ·6H 2 O：102 mg
10 毫米葡萄糖：901 毫克
10 毫米 HEPES：1.19 克
用 1 M HEPES 调节至 pH 7.3，然后过滤 (0.2 μm )。该溶液可提前一个月配制，冷藏保存，使用前预热至 37 °C 。

11.1,000 × TNFα (50 μg /mL)
溶解在 DMSO 中并提前一个月冷藏保存。使用当天，用林格氏盐水稀释并预热至 37 °C 。

致谢

这项工作得到了 R01-HL137112（至 BEI 和 MK）、R01-AA025854（至 MK）、R01-HL120840（至 BEI）和 DFG SFB914 A02（至 DM-B.）的支持。 Maier- Begandt等人使用了该协议。 , (2021) 由 Pannexin 1 启动的静脉特异性嘌呤能信号级联调节 TNFα 诱导的内皮通透性增加，Sci Signal 14(672 ):eaba 2940。

利益争夺

作者声明我们没有相互竞争的利益。

伦理

样本来自根据美国国立卫生研究院 (NIH) 的实验动物护理和使用指南，根据弗吉尼亚大学和埃默里动物护理和使用委员会的规定进行护理的小鼠。

参考

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Alexandre, MD, Lu, Q. 和 Chen, YH (2005)。在 LLC-PK1 细胞中，claudin-7 的过表达降低了细胞旁 Cl-电导并增加了细胞旁 Na +电导。 J 细胞科学118（第 12 部分）：2683-2693。
Anderson, JM 和 van Itallie , C. (2009)。紧密连接的生理和功能。冷泉港_ 透视生物学 1(2 ):a 002584。
Buschmann , I., Pries, A., Styp-Rekowska , B., Hillmeister , P., Loufrani , L., Henrion , D., Shi, Y., Duelsner , A., Hoefer, I., Gatzke , N .，等人。（2010）。脉动剪切和 Gja5 在流动驱动的动脉生成过程中调节动脉特性和重塑事件。发展137（13）：2187-2196。
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