第一部分：假分层培养材料和试剂的分化

A.3T3-J2饲养细胞
1.低代3T3-J2细胞（Kerafast，目录号：EF3003）

2.3T3-J2生长培养基

a、 DMEM（康宁，目录号：MT10013CV）
b、补充小牛血清铁（补充小牛血清编号：7202）
3.0.05%胰蛋白酶EDTA（康宁，目录号：MT25052CI）

4.二甲基亚砜（费希尔，目录号：BP231-100）

5.100 mm组织培养板（Greiner，目录号：664160）

6.150 mm组织培养板（Greiner，目录号：639160）

B.原代鼻咽细胞乔治敦培养基（见配方）
1.DMEM高糖（Gibco，目录号：11965092）

2.火腿的F-12营养组合（Gibco，目录号：11765054）

3.100×谷氨酰胺（Gibco，目录号：25030-081）

4.胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：16140071）

5.青霉素链霉素（Gibco，目录号：15140122）

6.氢化可的松（西格玛，目录号：H0888）

7.EGF（Invitrogen，目录号：PHG0311）

8.胰岛素（西格玛，目录号：I5500）

9.两性霉素B，250微克/毫升（费希尔，目录号：BP264550）

10.庆大霉素，10毫克/毫升（Gibco，目录号：15710064）

11.Sigma编号C52霍乱毒素

12.Y-27632（Tocris，目录号：1254）

UNC/USG媒体（见配方）

13.DMEM/F12（Gibco，目录号：11320-033）

14.青霉素链霉素（Gibco，目录号：15140122）

15.FeSO4·7H2O（西格玛，目录号：F8633-250G）

16.MgCl2·6H2O（西格玛，目录号：M2393-100G）

17.CaCl2·2H2O（西格玛，目录号：C7902-500G）

18.ZnSO4·7H2O（西格玛，目录号：Z0251-100G）

19.亚硒酸钠中的硒（西格玛，目录号：S5261-100G）

20.Manganese from Manganese Chloride tetrahydrate (Sigma, catalog number: M8054-100G)

21.Silicon from Sodium Silicate nonahydrate (Sigma, catalog number: S4392-250G)

22.Molybdemun from Ammonium Molybdate tetrahydrate (Sigma, catalog number: M1019-100G)

23.Vanadium from Ammonium Metavanadate (Sigma, catalog number: 398128-50G)

24.Tin from Tin Chloride dihydrate (Sigma, catalog number: 243523-5G)

25.Transferrin (Sigma, catalog number: T8158-1G)

26.Hydrocortisone (Sigma, catalog number: H0888)

27.Insulin (Sigma, catalog number: I9278-5ML)

28.Epinephrine (Sigma, catalog number: E4250-10G)

29.T3 (Sigma, catalog number: T6397-100MG)

30.EGF (Corning, catalog number: 354052)

31.BSA (Sigma, catalog number: A9647-100G)

32.Retinoic Acid (Sigma, catalog number: R2625-50MG)

33.BPE (Pel-Freez, catalog number: 57136-3)

34.Phosphorylethanolamine (Sigma, catalog number: P-0503)

35.Ethanolamine (Sigma, catalog number: E9508-500ML)

36.Ultroser G (Pall, catalog number: 15950-017)

37.Amphotericin B, 250 µg/mL (Fisher, catalog number: BP264550)

38.0.25% Trypsin (HyClone, catalog number: SH3004201)

39.0.05% Trypsin/EDTA (Corning, catalog number: MT25052CI)

40.Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) 1× with calcium and magnesium (Gibco, catalog number: 14025076)

41.Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) 1× without calcium and magnesium (Lonza, catalog number: 17512F)

42.Collagen IV (Sigma, catalog number: C7521)

43.Glacial Acetic Acid (Fisher, catalog number: BP2401-212)

44.Transwell Inserts, 24 well plate, polyester membrane, 0.4 µm pore size (Corning, catalog number: 3470)

45.Sterile Cytology Brush (Medical Packaging Corp, catalog number: CYB-1)

Equipment

1.Gamma-irradiator. We used the Gammacell 1000D model (Atomic Energy of Canada Ltd).

2.Humidified incubator at 37°C and 5% CO2, for cell culture

3.Biosafety cabinet Class II Type A2, for sterile cell culture work and biocontainment

Procedure

A.Preparing Irradiated 3T3-J2 Feeder Cells
1.Defrost 1 vial of 3T3-J2 cells (frozen at ~1 × 106 cells per vial) into a 100 mm dish in 3T3-J2 growth media. Do not centrifuge the cells prior to plating, as this will greatly decrease the recovery of viable cells. Change growth media the next day.

TIP: Do not heat inactivate bovine calf serum. It is best to use low-passage cells (≤ 20

passages).

2.Expand 3T3-J2 cells by seeding at a density of ~3.3 × 103 cells/cm2. Do not allow 3T3-J2 cells to grow beyond 80% confluence, or they will begin to senesce and will no longer expand. Cells should reach no more than ~5 × 106–6 × 106 cells per 150 cm2 of culture.

3.Passage cells by trypsinizing and seeding at a density of 1:5–1:4.

4.Cells can be irradiated at each passage. For irradiation, prepare ~ 2.5 × 107–3 × 107 cells in 20–25 mL of 3T3-J2 growth media, and irradiate with 30 Gy.

5.Plate approximately 1 × 106 cells in a 100 mm dish and monitor for growth, to ensure successful irradiation. Successfully irradiated cells will not expand and will lift off within 5–6 days.

6.Freeze stocks of irradiated cells at 1.5 × 106/mL, in 3T3-J2 growth media plus 10% DMSO.

B.Conditional Reprogramming of Primary Nasal Epithelial Cells
1.Coat 100 mm tissue culture plates with collagen IV stock solution diluted 1:10 in 0.1 M Na2CO3 at 37°C for 2 h, or at 4°C overnight. Prepare 2× 100 mm plates per donor.

2.The day prior to receiving donor cells, seed 5 × 105 irradiated 3T3-J2 cells from frozen stock in DMEM plus 10% FBS to each 100 mm dish (if using freshly irradiated 3T3-J2 cells, seed 2

× 105 per 100 mm or 5 × 105 per 150 mm dish); leave overnight. The irradiated fibroblasts can be seeded as soon as 3 h before seeding donor cells, and will still attach. To maximize recovery of viable cells, plate directly into growth media without centrifuging cells, and change media the next day.

Tip: Aim for 1/3rd confluence, but no more than 50%. If the fibroblasts are too light, you can

top up with more irradiated fibroblasts, as long as you add them 3 h before seeding the donor cells.

3.Before beginning the procedure, appropriate institutional approval for research with human subjects and consent forms must be in place. Collect nasopharyngeal cells by scraping the nasopharynx with a cytobrush—ten times to the left and ten times to the right. We scrape cells from the Fossa of Rosenmüller, where NPC most often arises. Transport cells on cytobrushes to the lab immediately, in a tube with 10 mL of PBS on ice (DO NOT FREEZE). At the lab, vortex the cytobrush briefly (15–20 s), and scrape it on the edge of the tube to dislodge cells. Remove the cytobrush with autoclaved sterile forceps and discard it.

注：鼻咽细胞取自全身麻醉患者

正在接受头颈外科手术。我们收集了接受鼻窦手术或颅底手术的患者的细胞。应制定纳入和排除标准，以排除任何有头颈癌病史的捐赠者。潜在的捐赠者应在手术前对COVID-19进行预处理。也可以从未接受手术的健康捐赠者的下鼻甲收集细胞。如果在没有麻醉的情况下从捐赠者那里收集下鼻甲细胞，其产量通常足以种植两盘24个大小良好的跨孔细胞，但不足以进行大规模冷冻保存。我们没有尝试在没有全身麻醉的情况下收集鼻咽细胞，但可能会产生少量不足以进行冷冻储存的细胞。

4.将取出的细胞在500×g和室温下离心10分钟。

5.当细胞离心时，从含有辐照成纤维细胞的培养皿中吸取DMEM培养基。用PBS冲洗。每100毫米培养皿中加入5.5毫升乔治敦培养基。

6.从离心细胞中提取上清液。不要倒出上清液。如果颗粒中有一个大的上部白色/粉红色层（由淋巴细胞和上皮细胞组成），它可能很容易从颗粒的下部（即红细胞）脱落。没有必要溶解红细胞。

7.将细胞重新放入预热至37°C的新鲜乔治敦培养基中。每100 mm培养皿的体积应为2.5 mL。给整个小球播种。在接下来的几天里，淋巴细胞和红细胞将死亡并被洗掉。将板通道标记为0。

8.每天抽吸液。加入5毫升（100毫米培养皿）的1×PBS，轻轻摇动培养皿，以洗去淋巴细胞和血细胞。抽吸PBS，清除尽可能多的淋巴细胞和

尽可能增加血细胞，并添加8毫升乔治敦培养基。每天刷新介质以防止污染很重要。

9.监测细胞生长，并在细胞融合时继续传代。成纤维细胞在接种后大约5-6天会脱落，因此在第6天传代细胞很重要。理想情况下，此时应能看到30%或更多的平板上生长出分散的上皮细胞集落（图1）。原代细胞向外生长的岛称为条件性重编程细胞（CRC）。

图1。不断增长的CRC和植入伪阿里文化的CRC的图像。

左侧，在胶原涂层组织培养板上生长的鼻咽CRC图像，与辐照的3T3-J2饲养层成纤维细胞共同培养（用相差显微镜捕获）。右图为假ALI培养的图像，其中CRC被植入一个24孔板大小的transwell的顶端。

C.通过初级CRC
1.传代前一天，每个供体分别在1×100 mm培养皿和1×150 mm培养皿上覆盖胶原，并像之前一样对3T3-J2成纤维细胞进行种子辐照（种子1.5×106个细胞/150 mm培养皿）。

2.从盘子中抽出介质。

3.用PBS轻轻冲洗。

4.在PBS中将0.25%胰蛋白酶的储备稀释至0.1%。

5.在每个培养皿中加入2.5毫升0.1%的胰蛋白酶，并在37°C培养箱中培养1-2分钟，使培养皿中的成纤维细胞胰蛋白酶化。在显微镜下观察细胞，至少每分钟一次，成纤维细胞应容易从培养板上分离；等待太久会导致原代上皮细胞分离。如果2分钟后成纤维细胞没有分离，轻轻拍打平板的侧面。胰蛋白酶开启时间不要超过3分钟。

6.通过抽吸和丢弃去除胰蛋白酶和成纤维细胞。向每个培养皿中添加2.5 mL 0.05%胰蛋白酶，并在37°C下培养，直到所有细胞分离。

7.以500×g离心10分钟，使细胞颗粒化。造粒细胞时，从带有新辐照3T3-J2饲养细胞的培养皿中吸取培养基，用PBS冲洗一次，然后添加乔治敦培养基（每100 mm培养皿5.5 mL，每150 mm培养皿12.5 mL）。

8.将细胞颗粒重新放入10毫升乔治敦培养基中。将2.5毫升种子放入100毫米培养皿中，将7.5毫升种子放入150毫米培养皿中（分割比为1:4）。无需计算细胞密度，因为主要目的是恢复所有细胞。

9.第二天，更换媒体。在第1段及之后，每2-3天更换一次介质。

10.监测细胞生长，当细胞汇合或成纤维细胞开始脱落时（5-6天），分裂成跨孔或冷冻。在乔治敦培养基中加10%二甲基亚砜以150万个细胞/毫升的速度冷冻保存。获得的小瓶数量因捐赠者而异，从2瓶到10瓶不等。最好在第1代冷冻，但我们已经成功分化出在第2代冷冻的细胞。

D.将CRC提升并分化为假分层培养物
新扩增或冷冻保存的CRC可分化为假ALI培养物。

1.如上所述，胶原涂层康宁3470转运孔，每个插入物使用100µL IV型胶原溶液。接种细胞前用PBS冲洗。

2.当细胞准备传代时，像以前一样重复收获过程。使用5毫升胰蛋白酶

150毫米的盘子。将两个平板（150 mm和100 mm）的细胞合并到一个试管中。

3.在10毫升乔治敦培养基中重新培养细胞，并使用血液细胞计计数。

4.向每个transwell的基底外侧添加400µL乔治敦培养基。

5.在200µL乔治敦培养基中将2×105个细胞播种到每个transwell的顶面。

6.任何剩余的细胞都可以在乔治敦培养基加10%二甲基亚砜中以1.5×106个细胞/毫升的速度冷冻。

7.一旦形成汇合单层（这需要1-2天），在顶端和基底外侧抽吸培养基。

8.用200µL的HBSS（顶端）和400µL的HBSS（基底外侧）冲洗孔一次，然后抽吸。富含钙和镁的HBSS有助于防止细胞丢失。

9.向基底外侧添加400µL UNC/USG培养基。

10.继续监测培养，每周更换三次基底外侧培养基，持续4周（28天），以使细胞分化。3周后开始可见旋转纤毛（视频1）。

提示：碎屑和粘液可能会积聚在根尖表面。如果发生这种情况，用HBSS轻轻冲洗培养基，注意不要损坏培养基。

视频1。假阿里培养中的纤毛搏动。

提升后第15天，在倒置相差显微镜上拍摄视频。原代鼻咽细胞取自颅底手术时的供体。

11.28天时，成熟的假ALI培养物可固定在4%多聚甲醛（PFA）中，并进行全套免疫荧光染色或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织学染色（图2，Ziegler等人，2021），以控制向纤毛、基底和粘液分泌细胞的分化。

注：分化的假阿里培养物在提升后28天内成熟。虽然

UNC/USG培养基可以维持支气管来源的假ALI培养数月，我们发现鼻咽来源的假ALI培养物在成熟一周后开始泄漏。这可以通过观察液体培养基是否泄漏到假阿里培养基的顶端来监测。在根尖侧观察到厚厚的粘液是常见的，但这明显不同于泄漏的液体介质。因此，最好在鼻咽源性假性肌成熟后立即进行实验。一些商业气道分化培养基（如Stemcell Technologies PneumaCult-Ex）可能延长成熟假ALI培养物的寿命，但我们尚未测试不同类型的商业培养基。

图2。假ALI培养的代表性组织学染色和荧光成像。

A.典型鼻咽假阿里培养物的组织学染色。图中显示的是一个未感染的假ALI培养物，该培养物来自颅底手术时收集的捐赠者。H&E、苏木精和伊红染色显示假复层上皮，有柱状纤毛细胞。Ki67，核蛋白Ki67是一种增殖标记物，标记位于基底层的循环细胞。AB/PAS，阿尔西安蓝/高碘酸希夫染色酸性和中性粘蛋白，标记不同类型的粘液分泌细胞。B.假ALI培养中EBV感染细胞的荧光Z-stack图像显示GFP阳性（绿色），用DAPI（蓝色）复染。伪ALI培养物感染了一株嗜上皮性重组EBV株（M81，Tsai等人，2013），该株共表达GFP，在感染后4天（p.i.）固定在4%多聚甲醛中，并通过共聚焦显微镜成像。三维渲染在尼康NIS元素中组装。EGF处理（10 ng/mL）可增强无细胞病毒感染（Wang等人，2015年）。如果首选活细胞成像，则必须在transwell中直接捕获图像（无需安装切除的膜），并且最终用户必须确定具有延长焦距的合适物镜。请注意，B细胞共培养感染法会因输入B细胞的GFP阳性而蒙上阴影，因此不建议将其作为评估感染的方法。

第二部分：假分层ALI培养物和试剂的EBV感染

A.EB病毒感染
1.生产者B细胞系。我们使用感染重组EBV的Akata B细胞，这里称为“rAkata”（Maruo等人，2001年），这是George Tsao博士（香港大学）在高田贤三博士（日本大学医学院）许可下赠送的。

2.RPMI（HyClone，目录号：SH30027FS）加10%胎牛血清（Seradigm，VWR，目录号：97068-085）

3.10 mg/mL的α-人IgG山羊抗血清（Fisher，目录号：ICN55087）用于制备B细胞源性病毒

4.用于无细胞病毒感染的重组人EGF（Sigma，目录号：E9644）

5.T-25组织培养瓶（Greiner，目录号：690175）

6.T-75组织培养瓶（Greiner，目录号：658175）

B.组织学
1.多聚甲醛（西格玛，目录号：P6148）

2.细尖镊子（电子显微镜科学，目录号：78149-SS）

3.#11 scalpel (Aspen Surgical, Thermo Scientific, catalog number: 02-688-79)

C.Quantitative PCR
1.Turbo DNase 2 units/µL (Fisher, catalog number: AM2238)

2.Proteinase K (Thermo, catalog number: EO0491)

3.Plasmid containing segment of EBV genome and primers. We use a pUC57 plasmid with a

BALF5 fragment (Akata strain, NCBI Accession, catalog number: KC207813.1)

4.Primers (Eurofins MWG Operon): qBALF5-F (5′ GAGCGATCTTGGCAATCTCT 3′), qBALF5R (5′ TGGTCATGGATCTGCTAAACC 3′)

5.PowerUp SYBR-green 2× master mix (Thermo, catalog number: A25780), or preferred qPCR reagent

Equipment

1.QuantStudio 3实时PCR系统（应用生物系统），或首选实时PCR仪器

程序

A.从EBV感染的细胞中制备/收获病毒储备
1.对于B细胞共培养感染：

a、扩增EBV感染的B细胞。每个待感染的孔使用2.5×106个细胞。当细胞密度约为1×106–1.5×106/mL时，分裂B细胞培养基；不要让它们超过这个密度，否则它们会重新激活并死亡。
提示：rAkata细胞中的重组EBV具有新霉素抗性基因和插入非必需BXLF1（病毒胸苷激酶）位点的EGFP表达盒。用新霉素选择（0.8 mg/mL）保留细胞，以在连续传代期间维持重组EBV。

注：所有与EBV感染细胞培养有关的工作应在BSL-2条件下进行。

b、用1×106个细胞/mL的T-75烧瓶接种种子。
c、每毫升细胞添加5微升（50微克）α-人IgG抗体，以重新激活EBV。

d、在37°C下培养2天。
2.对于无细胞病毒感染：

a、通过用表达EBV斑马（又名Zta）和gp110（单纯疱疹病毒gB同源物）蛋白的质粒转染细胞，从生产细胞系（例如293-M81 EBV，Tsai等人，2013）中重新激活病毒。转染后5-6天收集上清液以获得最佳病毒产量。将细胞旋转至500×g，收集上清液作为接种物。
b、或者，如上所述，从EBV感染的b细胞中重新激活病毒，但在添加α-人IgG后，将细胞培养5-6天。将细胞旋转至500×g，收集上清液作为接种物。

B.通过B细胞共培养法感染假分层ALI培养物
B细胞共培养法使用重新激活的B细胞作为接种物，因为细胞间的接触会鼓励上皮细胞感染（Imai等人，1998年）。上皮细胞的无细胞病毒感染是可能的，但效率要低得多（Imai等人，1998年）。

1.重新激活48小时（500×g）后，将重新激活的B细胞培养物向下旋转（从步骤A.1.d开始）

5分钟）。

2.在PBS中以1.25×107/mL的浓度重新培养B细胞。每个孔与2.5×106个B细胞共培养。注：可通过制备类似于在PBS中再悬浮（1.25×107个细胞/mL）的平行再活化B细胞培养物，并在24孔培养皿中再生长2天，以匹配去除接种物的时间点，包括再活化控制。按照第二部分程序F所述，对澄清上清液进行qPCR。

3.从阿里文化中抽取基底外侧中膜。

4.向每个孔的顶端侧添加200µL PBS，向基底外侧添加400µL PBS。在37℃下培养5分钟。

提示：不要超过5分钟，否则细胞连接会被破坏，细胞会脱落。

5.吸PBS。用PBS冲洗基底外侧和根尖侧两次，小心抽吸以去除。每次清洗时，在根尖使用200µL PBS，在基底外侧使用400µL PBS。

向基底外侧添加400µL PBS，并向每个培养物的顶面添加200µL重新激活的B细胞悬浮液（PBS）。感染的多重性（MOI）无关紧要，因为在B细胞共培养感染方案中，重新激活的B细胞不断产生病毒。然而，对于无细胞病毒感染方案，可在接种时计算MOI，由EBV基因组当量的qPCR确定（参考第II.F部分）。

注意：我们只尝试过根尖感染，但伪ALI培养的基底外侧感染可能是可能的。

提示：

a、如果需要模拟感染，使用EBV阴性的Akata细胞，类似地用抗人IgG处理。
b、作为qPCR的输入控制，请使用：
i）固定EBV阳性B细胞。在室温下用4%PFA固定重新激活的B细胞10分钟，通过在500×g下旋转细胞5分钟，用PBS清洗两次，并在每个孔中重新使用200µL PBS。
ii）或将活的活化EBV阳性B细胞接种物应用于固定的ALI培养物。在室温下用4%PFA固定ALI培养物10分钟，在顶端侧用200µL PBS清洗两次，在基底外侧用400µL PBS清洗两次，然后继续用活的活化B细胞接种物进行接种，如上步骤6所述。
6.在37°C下培养2小时。然后，从培养物的基底外侧部分去除PBS，并用400µL UNC/USG培养基替换。

7.将培养物放回37°C培养箱中培养2天。

8.轻轻抽吸，从ALI培养物中去除B细胞和基底外侧培养基。

9.在室温下，用1×HBSS轻轻冲洗孔（顶端和基底外侧）三次。非常小心地吸气以拆下HBSS。在这一点上，培养物会有些脆弱，所以小心不要用尖端接触膜。每次清洗时，应将HBSS添加到transwell的不同一侧，以确保对细胞培养的破坏最小。

10.用400µL新鲜UNC/USG培养基替换基底外侧培养基，并在37°C下培养，直至固定/收获。每两天补充一次新的UNC/USG培养基。

提示：收获时间通常在感染后2-5天之间，从B细胞共培养开始。随着感染的进行，transwells可能开始泄漏到根尖侧。在收获时间点之前，不要移除任何泄漏的介质。

11.此时，如果使用表达GFP的重组病毒，你每天都可以在倒置荧光显微镜上目测感染情况。

C.通过无细胞病毒感染法感染假分层ALI培养物
1.感染前用10 ng/mL EGF在UNC/USG培养基中稀释24小时，在心尖部用200µL培养基，在基底外侧用400µL内侧培养基处理ALI培养物。EGF的加入促进了EBV上皮细胞受体Ephrin受体A2的表达（Zhang等人，2018）。

2.通过抽吸从培养物中去除含有EGF的培养基。

3.用PBS冲洗一次，然后抽吸。

4.在PBS中加入1 mM EDTA（顶端200µL，基底外侧400µL），以削弱细胞间的连接。这有助于无细胞EBV接种物在整个培养过程中的扩散。将细胞放回37°C的培养箱中5分钟。

5.用三次PBS冲洗EDTA。

6.向每个孔的顶端表面添加200µL病毒原液，向基底外侧添加400µL UNC/USG培养基。应用100–1000个EBV基因组拷贝的目标MOI（由qPCR确定）。

7.在37℃下培养24小时。

8.通过抽吸去除病毒和基底外侧培养基。

9.用HBSS冲洗培养物三次。

10.更换基底外侧培养基，并在37°C下培养，直到固定/收获。

D.固定假分层ALI培养物，进行整体免疫荧光染色或组织切片（FFPE）
值得注意的是，一些感染细胞没有可检测到的GFP荧光。根据所使用的重组EBV分子克隆，引入的GFP通过各种外源启动子表达，如pCMV和pSV40（Maruo等人，2001年；Tsai等人，2013年）。因此，虽然可以监测GFP荧光（图2B），但它不是评估传染性的首选方法。全套免疫荧光染色和FFPE切片免疫染色是首选方法。

1.在开始之前，将转移孔固定到新的24孔组织培养板上。

2.用HBSS冲洗培养物三次。

3.（可选）对于整体染色，如果需要WGA-488染色（显示纤毛和细胞膜轮廓），在第一次洗涤后，在室温下，在黑暗中用稀释至1µg/mL的WGA-488抗体在HBSS中培养10分钟。

注：如果在添加WGA-488（PFA固定前）后使用PBS，WGA将解开并

不会有染色。固定前用HBSS清洗三次。

提示：对于FFPE切片，由于脱蜡过程中使用的溶剂使膜脱皮，WGA染色不能保留。

4.对于将用于整体染色的孔：

a、添加4%的PFA（顶端200µL，基底外侧400µL）。在37°C下固定10分钟。
b、移除PFA（通过倾翻而不是吸气），并将微孔转移到新的康宁24孔transwell培养板上。
c、用PBS清洗细胞三次。但不要从根尖表面吸取液体。
d、将固定细胞储存在4°C的70%乙醇、0.1%PFA或PBS中0.02%叠氮化钠中。该步骤取决于培养的预期用途。将用于RNA原位杂交的孔应在70%乙醇中储存最多1周。用于全套免疫荧光染色的孔应储存在0.1%PFA或0.02%叠氮化钠的PBS中。
注：冷冻切片保留荧光蛋白（如GFP）的荧光，通常不需要进一步优化免疫荧光染色程序。

然而，我们发现，与可靠的FFPE切片不同，冷冻切片在假ALI培养物上的成功率是可变的。有时假分层细胞被冷冻切片撕裂，看不到残留的细胞。因此，我们不建议冷冻切片。

e、继续进行免疫染色。全套免疫染色的例子见
图3。

5.对于FFPE加工和切片：

a、添加4%的PFA（顶端200µL，基底外侧400µL）。在4°C下过夜固定。
b、在4°C条件下，将固定电池储存在0.1%PFA或0.02%叠氮化钠的PBS中，直到进行FFPE处理（图4）。
6.继续对EBV或细胞类型特异性标记物进行染色（Ziegler等人，2021年）。

注：3-D细胞培养也可以通过单细胞RNA测序分析宿主和病毒转录物（Ziegler等人，2021年）。通过0.05%胰蛋白酶EDTA处理，单个细胞可以从转运孔中分离出来。我们发现，单细胞RNA测序在识别感染细胞方面比免疫染色更敏感。请注意，少量EBV转录本的存在并不能确定为潜伏感染或裂解感染。相反，需要进行全局转录组分析，以区分潜伏感染和裂解感染与流产感染。我们发现，利用10×基因组学单细胞RNA测序，在EBV感染的假ALI培养物中可以识别出潜在的和裂解的转录特征。使用10×基因组学进行单细胞RNA测序的成功取决于每个细胞转录本的丰度（EBV转录本可能低至总转录组的0.01–0.1%）。这还取决于参考基因组的准确外显子注释。许多EB病毒（和疱疹病毒）转录本重叠。因此，与这些重叠区域对齐的读码是无法区分的，并且只有当这些重叠转录本被注释为“融合”外显子时，才会被映射。合并的EBV+hg38（人类）基因组注释文件可在NCBI基因表达综合（GEO）GSE157243中获得。GEO提交文件中提供了过滤标准和数据处理步骤。Akata EBV基因组（NCBI KC207813.1）及其最新注释可在Github上获得(https://github.com/TangLabGOT/Reference-Genomes).

图3。EBV重组感染的鼻咽伪ALI的整体免疫染色。

共焦图像的最大强度投影。图中显示了从冷冻库CRC培养的两个供体（NP-H10-A和NP-H15-A，Ziegler等人，2021年）的代表性结果。EBV裂解蛋白（斑马）的免疫染色。荧光原位杂交（EBER-ISH）检测到EBV编码的RNA在潜伏期内大量表达。在没有斑马染色的情况下，EBER阳性表示潜伏感染。斑马和羚羊位于细胞核内。直方图显示模拟样本（蓝色）或感染EBV的样本在第5天p.i.（红色）时斑马或EBER信号的像素强度。参见第四部分：图像数据分析，A部分，了解如何创建叠加直方图。

图4。假分层ALI培养物和器官型筏的石蜡包埋和切片。

A.伪分层ALI的FFPE处理。（1）在transwell倒置的情况下，使用#11手术刀切除transwell膜，而不干扰细胞侧。在边缘处理薄膜

使用细尖镊子。（2）一旦移除，膜在解剖板上倒置（细胞面朝上）。用手术刀将薄膜平分。（3）将切割膜的两半放在组织活检垫上，并小心地用另一个垫覆盖，注意不要在与膜接触后移动垫。将垫子放入组织学组织盒中，并加载到组织处理器上。（4）按照缩短的（40分钟）常规处理时间表，打开磁带盒，轻轻地卸下顶部衬垫。将半膜从衬垫上提起，并以一定角度嵌入石蜡模具中，切割边缘朝下。（5）冷却后，用切片机将石蜡块切成4µm厚的薄片，并将切片放在44°C的水浴上。使用带正电荷的载玻片从水浴中取出切片。载玻片在60°C的烤箱中烘焙60分钟。干燥/熔化后，载玻片准备染色。B.器官型筏的FFPE加工。（1）用细尖镊子握住器官型筏的外缘。将救生筏平放在组织盒里的活检垫上。轻轻地将另一个垫子放在木筏顶部，注意不要移动垫子。（2）在进行常规组织处理后，用#11手术刀将木筏从暗盒中取出并切成条状。（3）使用温暖干燥的嵌入模具，在模具冷却时，将每条带边缘放入模具中，以将带固定到位。然后用石蜡填充模具并冷却。从模具中取出石蜡块时，在加热板上轻轻摩擦表面，以去除表面气泡。冷却后，按照面板A第5步中所述的剖切指南进行操作。

E.从假分层培养物中收集病毒DNA
1.移除接种物时，收集背景洗涤液。这将告诉你有多少EBV基因组没有成功地从你的培养基中清除。请注意，必须对每一口用于收获的井进行这项操作，因为这对于显示病毒滴度的增加至关重要。

a、从顶端表面吸取病毒。
b、用HBSS清洗三次，每次清洗后小心吸出液体。
c、第三次洗涤后，用移液管将100µL HBSS移到培养物的顶面上。轻轻上下移液数次，以收集任何剩余的病毒基因组，并将收集的HBS储存在4°C下，直到准备好收集细胞外和细胞相关病毒。
d、更换基底外侧培养基并孵育至所需时间点以收获基因组。让顶端保持干燥。
2.在所需时间点，用移液管将50µL HBSS移到培养物的顶面上。

3.使用200µL大小的移液管尖端，在膜上来回刮取细胞。连续上下移液管，使细胞与膜分离。

4.当细胞悬浮在HBSS中时，转移到微离心管中储存。

5.向根尖表面再添加50µL HBSS，重复步骤4-5，小心收集第二次清洗中的所有剩余细胞。细胞悬浮液的最终体积应为100µL。

6.以500×g离心5分钟，使细胞形成颗粒。

7.将上清液转移到标记为顶端病毒的新试管中，并在4°C下储存——该上清液含有培养物产生的任何未结合的细胞外病毒。不要丢弃！

8.在有盖冰桶中，通过填充干冰并喷洒乙醇制备乙醇干冰浆，并确保水浴温度设置为37°C。

9.通过添加100µL新鲜HBSS并旋转，重新悬浮细胞颗粒。

10.将含有细胞悬浮液的试管置于干冰乙醇浆中，并覆盖冰桶3分钟，以冷冻。

11.将试管转移到水浴中3分钟，以解冻。

12.重复步骤11-12两次，共三次冻融循环。

13.以1000×g的速度旋转试管5分钟，使细胞碎片形成颗粒。

14.将含有裂解细胞释放的病毒基因组的上清液转移到标记为细胞相关病毒的新试管中，并在4°C下储存1周或-20°C下储存更长时间，直到定量。

提示：在无菌条件下，收集的GFP+病毒可以通过

Green Raji单位（GRU）分析（Caves等人，2018年）。在这种情况下，收获的病毒应在4°C下储存最多1周。

F.使用SYBR绿色检测通过qPCR定量EBV DNA
1.将2单位DNA酶I直接添加到50µL病毒上清液中，并在37°C下培养30分钟。

提示：如果需要重复，可以使用25微升的病毒上清液。

2.在70°C下加热灭活10分钟。

3.在50°C条件下，添加蛋白酶K（储备量：20 mg/mL）至最终浓度0.1 mg/mL，持续30分钟。

4.在75°C下加热灭活20分钟。

5.如果需要，在进行qPCR之前，将样品在dH2O中稀释1:10。

6.通过制备10倍系列稀释的BALF5质粒（每个反应109×100拷贝）来创建标准。使用DNA拷贝数和稀释计算器。下面提供了一个例子：

碱基对质量：650（g/mol）/bp片段（质粒）长度：2786 bp

摩尔质量（特定于质粒大小）：1810900 g/mol 332541830拷贝/ng

7.根据表1中的量，制备2µL模板DNA（已知BALF5质粒或经DNA处理的上清液）的主混合物，每次反应的总体积为10µL。

表1。qPCR反应组成

1×反应体积（µL）

底漆1:qBALF5-F（10µM），[最终]=0.3µM

0.3

底漆2:qBALF5-R（10µM），[最终]=0.3µM

0.3

通电SYBR绿色（2×）*

5

模板DNA（未稀释或1:10稀释）

2

二氧化二氢

2.4

*如果需要，用首选品牌的qPCR试剂替代。

8.通过qPCR进行绝对量化。

第三部分：鼻咽器官型筏和EBV感染材料及试剂的产生

A.3T3-J2饲养细胞（未辐照）
1.低代3T3-J2细胞（Kerafast，目录号：EF3003）

2.3T3-J2生长培养基

a、 DMEM（康宁，目录号：MT10013CV）
b、补充小牛血清铁（补充小牛血清编号：7202）
3.0.05%胰蛋白酶EDTA（康宁，目录号：MT25052CI）

B.胶原蛋白塞
1.I型胶原蛋白，鼠尾高浓度（康宁，目录号：354249）

2.I型胶原蛋白，鼠尾低浓度（康宁，目录号：354236）

3.10×重组缓冲液（62 mM NaOH，260 mM NaHCO3，200 mM HEPES，pH 8.2），过滤消毒

4.10 M NaOH

5.10×DMEM（由粉末DMEM制成，Fisher，目录号：12-00-061），新鲜，过滤消毒

C.木筏文化（来源：Temple等人，2017年）
电子介质，过滤消毒（在4°C的黑暗中储存最多1个月）（见配方）

1.粉末DMEM（费希尔，目录号：12-00-061）

2.火腿粉培养基（费希尔，目录号：21-700-075）

3.制霉菌素（Fisher，目录号：BP29495）

4.青霉素-链霉素100×溶液（Cytiva，目录号：SV30010）

5.Sigma编号C52霍乱毒素

6.腺嘌呤储备溶液，180 mM（西格玛，目录号：A2786）（见配方）

7.转铁蛋白（研发，费希尔，目录号：2914HT100MG）

8.T3溶液（费希尔，目录号：66-665-0）（见配方）

9.氢化可的松溶液（西格玛，目录号：H0888-1G）（见配方）

10.来自牛胰腺的胰岛素（Sigma，目录号：I5500）

11.胎牛血清（Seradigm，目录号：VWR 97068-085）

EGF溶液（见配方）

12.重组人表皮生长因子（西格玛，目录号：E9644-.2MG）

EB病毒感染
1.EBV感染的Akata细胞（可以是重组感染的rAkata细胞或野生型Akata细胞）

2.RPMI（HyClone，SH30027FS）加10%胎牛血清（Seradigm，VWR，目录号：97068-085）

3.10 mg/mL的α-人IgG山羊抗血清（Fisher，目录号：ICN55087），用于制备B细胞衍生病毒

E.金属格栅和可重复使用材料：
1.铬酸硫酸（费希尔，目录号：SC88-50）

2.金属格栅（麦克马斯特卡尔，目录号：2930T39），不锈钢丝布圆盘，直径3英寸，40×40目，每包10个，适合一个100毫米的盘子。弯曲三个点的边缘，形成一个“三脚架”，注意创建一个均匀的表面。每次使用前，用铬酸玻璃烧杯浸泡金属格栅1小时，然后去除酸，用自来水连续冲洗至少1小时至一夜，然后在蒸馏水中冲洗1小时。使用前进行高压灭菌。

3.9英寸勺子抹刀，不锈钢，3/4英寸宽端，5/16英寸窄端（亚马逊ASIN：

B00ARJOX16）。使用前进行高压灭菌。

程序

对原代口腔角质形成细胞的器官型筏培养和EBV感染的程序进行了详细描述（Temple等人，2017年）。在这里，我们表明，器官型筏也可以从鼻咽CRC生成。对于鼻咽源性器官型筏，CRC类似地种植在胶原塞的顶部，嵌入活体3T3-J2细胞，并在金属网格上提升至ALI。Temple等人（2017年）提供的方案如下，包括修改（下划线）和附加提示：

A.木筏文化的产生
以下程序适用于在6孔板大小的孔中制备的胶原塞。

1.为了制备3T3-J2胶原塞，使用在3T3-J2生长培养基（10%小牛血清，补充铁）中生长的低代3T3-J2细胞，如上文A节所述，用于假分层ALI。注意，对于器官型筏，不要照射3T3-J2细胞。

2.通过在冰上混合低浓度和高浓度I型胶原，从鼠尾制备1型胶原，精确至4 mg/mL。额外准备，因为一些胶原蛋白会在移液过程中丢失。

提示：需要混合高浓度和低浓度，因为按照制造商的建议，用醋酸稀释高浓度胶原蛋白会导致pH值非常低，而且由于粘度高，很难准确实现。

3.用0.05%胰蛋白酶EDTA胰蛋白酶化3T3-J2细胞。用3T3-J2生长培养基和颗粒细胞中和。对于每个筏，将6.25×105 3T3-J2细胞重新放入0.25 mL 10×重组缓冲液中。所有后续工作均应在冰上进行，以防止细胞聚集和胶原过早凝固。

4.加入0.25 mL 10×DMEM，通过移液管充分混合。

5.加入2毫升4毫克/毫升I型胶原蛋白。每2.5毫升胶原塞用6微升10 N氢氧化钠调节pH值。将试管彻底倒置搅拌。

6.将2.5 mL胶原-3T3-J2细胞混合物等分放入6孔板的一孔中，形成胶原塞。倾斜以均匀分布，并用无菌移液管尖去除气泡。

7.将胶原塞在37°C和5%CO2下培养1-2小时，使胶原塞凝固。

8.胶原栓凝固后，添加2–3毫升不含EGF的电子培养基，并在室温下平衡至少10分钟。EGF的存在可能会损伤3T3-J2成纤维细胞。电子媒体应该完全覆盖胶原塞。胶原插入式电子培养基可提前2天制备，并放置在37°C的组织培养箱中，直到准备好播种鼻咽CRC。

9.准备播种鼻咽CRC时，抽吸覆盖胶原塞的电子媒体。将3×106个鼻咽CRC接种在补充有5ng/mL EGF的1mL电子培养基中的胶原塞上。在37°C的组织培养箱中培养2-4小时，使CRC粘附。不要动摇培养基，因为这可能会导致CRC分布不均。2小时后，使用倒置相位/对比显微镜检查CRC是否粘附。粘附的CRC应填充胶原塞的整个表面。这很关键，否则产生的器官型筏会很薄。不要将CRC与添加EGF的培养基放置在胶原塞上超过4小时，因为这会损坏3T3-J2成纤维细胞。

注：在接种到器官型筏之前，可以在扩张时用慢病毒表达载体转导鼻咽CRC。不建议稳定选择转导细胞，因为增加传代数会影响器官型筏的质量。如果转导有效，短暂的选择是可能的。

10.CRC粘附后，轻轻吸出残余介质，小心地将带有粘附CRC的胶原塞从6孔板转移到高压灭菌金属网格中

一个100毫米的盘子。用无菌抹刀在周围松开塞子，将胶原蛋白塞子铺在金属网格上，避免下面出现褶皱或气泡。每个金属网格上最多可放置两个胶原蛋白塞。将不含EGF的电子媒体涂抹在平板底部，直到其到达筏底面。吸入任何气泡。为了产生气液界面，不要让筏板的任何部分被淹没（见视频2）。在37°C的组织培养箱中培养筏培养物9-12天，以允许分化。延长分化期将导致木筏变薄。每隔一天更换一次基础电子媒体（图5A）。

视频2。将器官型木筏提升到金属网格上。

图5。器官型筏的例子。

A.在金属网格上的气液界面生长的器官型筏，用基底外侧电子媒介喂养。B.收获时成熟器官型木筏的放大图像。粉红色的胶原塞顶部可见一层白色的分化细胞，其中含有嵌入的3T3J2成纤维细胞。

B.用EB病毒感染筏培养物（视频3）

视频3。器官型筏的评分和EBV感染。

1.在感染前一天（空运后第3天）制备抗人IgG活化的Akata细胞。在含有10%FBS的RPMI培养基中，将Akata细胞重新悬浮至5×105细胞/mL。添加100µg/mLα-人IgG山羊抗血清。在5%CO2和37°C下培养24小时。

2.在空气提升后的第4天，从筏中吸入电子媒体，并用无菌手术刀以网格形式对筏表面进行评分，水平和垂直各10次。刻痕是组织损伤的一种形式，使接种物能够直接接触筏中的所有上皮细胞层。

注：口腔角质形成细胞衍生的器官型筏可能在不评分的情况下感染EBV（Temple等人，2017年），尽管我们尚未尝试使用鼻咽器官型筏。

3.通过旋转活化的Akata细胞并将2.5×106细胞重新注入200µL PBS中，用步骤B1中的活化Akata细胞接种刻痕筏表面。滴加接种物，并使用200µL移液管均匀分布在筏表面。注：接种量优化为每筏2.5×106个Akata细胞。因为这是一种共培养的感染方法，所以接种物的大小可以简单地通过共培养的产生EB病毒的B细胞的数量来计算。重新激活的Akata接种物在与筏共同培养时持续产生传染性EBV。

4.让接种物吸收，然后更换基底外侧电子培养基。在37°C的5%CO2组织培养箱中放置所需时间（感染后4-7天）。不要冲洗EBV接种物。每隔一天补充一次新鲜的电子媒体。

C.通过FFPE采集筏培养物进行组织学和免疫染色（视频4）

视频4。收获固定器官型筏，用于FFPE加工。

1.从救生筏中抽出介质。

2.用PBS冲洗木筏两次，轻轻移液至100 mm板中，让木筏浸没。

3.将筏直接固定在金属格栅上，在室温下浸入4%的PFA中1小时。

4.用抹刀将固定的筏转移到浸泡在PBS中的活检海绵上。关闭纸巾盒盖并储存在70%乙醇中，用于FFPE处理（图4）。

注：与乙醇不同，叔丁醇保留荧光蛋白的荧光（Zhanmu等人，2019）。如果固定后需要显示报告荧光蛋白，在FFPE处理之前，将PFA固定筏储存在50%叔丁醇中，并在分级（50%、75%、95%和100%）叔丁醇中脱水30分钟。还应在分级（100%、95%、75%和50%）叔丁醇中进行复水。

5.进行组织学和免疫染色。图6显示了基底上层（总苞素+）细胞和EBV蛋白的代表性免疫染色，表明溶解性感染（EBV斑马+）。

图6。经EBV处理或重组感染的鼻咽器官型筏FFPE切片的免疫染色。EBV感染的筏通过与Akata B细胞共培养的方法感染。

所示为细胞或EBV标记蛋白的代表性FFPE切片，并用DAPI或麦胚凝集素（WGA）复染。A.细胞标记蛋白（角蛋白5[K5]、总苞蛋白[Inv]和人IgG[hIgG]）的代表性FFPE切片染色。基底细胞对K5呈强阳性，但对Inv呈弱阳性。基底上细胞对Inv呈强阳性，对K5呈阳性。绿色虚线表示基底层和超基底层之间的边界。B.EBV（斑马）蛋白和hIgG染色的代表性FFPE切片。斑马+细胞可以量化，并绘制每幅图像中斑马+细胞核的百分比（见第四部分：图像数据分析）。在所示图像中，抗hIgG染色未观察到污染的B细胞（Akata接种物）。H&E、苏木精和曙红。箭头，角蛋白珍珠。比例尺

=50µm。

第四部分：图像数据分析

A.使用CellSens Dimension软件生成叠加直方图（可从奥林巴斯获得CellSens Dimension软件）
生成叠加直方图的目的是显示信噪比。一个典型的例子是将感染EBV的假ALI培养物中的斑马染色信号与模拟对照进行比较，如图3所示。

1.打开CellSens维度中的多通道Z-stack感染和模拟图像。

2.通过选择Process->maximum intensity生成z堆栈的最大强度投影，并另存为新图像。

3.选择图像->单独->通道，这样每个颜色通道现在都显示为单个图像。

4.通过选择image->Combine->Channels，创建一个包含显示染色的通道的新图像，并选择要比较的图像。有多种选择可以改变

每个通道的伪彩色，因此确保每个通道显示为不同的颜色。该颜色将出现在直方图中。

5.确保两个通道都可见。每个通道的直方图现在叠加在直方图窗口中。选择图7中标有箭头的按钮，从对数视图切换到线性视图。截图并裁剪直方图窗口以根据需要显示。叠加直方图的其他示例如图3所示。

图7。使用CellSens Dimension软件生成叠加直方图，以说明信噪比。

裁剪后的图像说明了第四部分：图像数据分析（A）中描述的步骤2-5。本例比较了斑马染色图像的信号，该图像来自于感染EBV的鼻咽部假ALI培养物（供体NPH10A），该培养物在注射后5天采集，与模拟感染对照物（Ziegler等人，2021年）进行比较。A.EBV感染样本中带有DAPI（蓝色）的斑马染色z-stack图像（红色）的最大强度投影。B.分离显示斑马斑信号的红色通道，以便进一步分析。C.选择与EBV感染组和模拟对照组中斑马斑对应的两幅红色通道图像，模拟图像的颜色为假蓝色。D.显示斑马染色通道的最终叠加直方图。红色表示EBV感染样本，蓝色表示模拟感染样本。箭头指示在对数和线性显示比例之间切换的按钮，以最能显示EBV感染与模拟样本之间的信噪比的为准。

B.使用ImageJ软件和斐济插件（ImageJ软件和斐济插件可在https://imagej.net/software/)

粒子分析的目的是对Zebra+核进行评分。一个典型的例子可能显示了与模拟对照相比，EBV感染的器官型筏中斑马+DAPI+细胞核的百分比，如图3所示。

1.根据需要调整显微镜中的LUT和图像集。将单独的频道导出/保存为TIFF图像。

2.打开斐济的DAPI和TRITC图像。

3.首先旋转并裁剪到感兴趣的区域（膜/细胞）。

在DAPI图像中选择要裁剪的区域。切换到红色图像，然后选择编辑->选择

->恢复选择（或按Ctrl–Shift–E）。然后为每个图像选择裁剪（或按Ctrl–Shift–X）。这将裁剪每个通道的相同区域。

4.在DAPI图像中，选择图像->调整->颜色阈值，然后调整亮度阈值，以便在仍能观察到细胞核的情况下去除背景。

5.分析->分析粒子。调整设置以包括所有核。这个数字是DAPI阳性细胞的数量。

6.分析时，确保选择了“添加到管理器”。

7.点击ROI管理器，然后选择更多->填充，它应该以绿色填充粒子。

8.要创建一个只包含二值细胞核的图像，请选择“分割”。

9.选择编辑->选择->创建选择以选择二值图像中的细胞核。

10.在红色通道图像（斑马染色）中，按Ctrl–Shift–E或选择restore selection，仅从蓝色图像中选择细胞核区域。

11.再次设置阈值（根据需要将该值设置为最高值，以便每个细胞核区域都被计算为一个细胞），然后单击应用，生成仅包含DAPI细胞核区域内斑马染色的黑白图像。再次分析颗粒以确定斑马阳性细胞的数量。命令和图形化结果的示例如图8所示。

图8。使用ImageJ软件和斐济插件进行颗粒分析，以量化阳性染色的细胞核。

裁剪后的图像说明了第四部分：图像数据分析（B）中描述的步骤4-11。本例比较了感染EBV或模拟对照的鼻咽器官型筏的斑马染色图像的信号。所示为供体NPH17A的结果（Ziegler等人，2021年）。

A.将阈值应用于ImageJ中的DAPI通道。B.阈值DAPI图像的粒子分析结果。左列的每个数字表示一个粒子。C.斑马染色图像评估为斑马+的DAPI+细胞核百分比。斑马染色显示为DAPI核内的二值图像，并显示粒子分析结果。请注意，这些设置在模拟中检测不到Zebra+粒子，但在受EBV感染的样本中检测到许多Zebra+粒子。D.用ImageJ软件计算7天时器官型筏中斑马+细胞核百分比的示例。这个例子是根据图6B中的图像计算出来的。

食谱

1.乔治城媒体准备

准备储备溶液

a、将氢化可的松溶解在100%乙醇中，浓度为0.5 mg/mL。将1 mL氢化可的松与19 mL DMEM和2.5µg EGF混合。在-20°C下储存1.1毫升小份氢化可的松/EGF。
b、将100毫克胰岛素溶解在20毫升含有200微升冰醋酸的蒸馏水中。过滤消毒，并在-20°C下储存在1.1毫升等分液中。
c、将25 mg Y-27632（ROCKi）与无菌水溶解至5 mM的浓度。制备1-mL等分试样，并储存在-20°C下。
d、将1毫克小瓶霍乱毒素溶解在2毫升蒸馏水中，过滤消毒。储备溶液在4°C下稳定1年。
e、将5.5毫升谷氨酰胺、5.5毫升青霉素霉素和50毫升热灭活胎牛血清加入500毫升DMEM（H），制备完整的DMEM培养基。
要制作500毫升乔治敦媒体：

1）在无菌组织培养箱中，混合373毫升完整DMEM培养基、125毫升F-12营养混合物、0.5毫升氢化可的松/EGF混合物、0.5毫升胰岛素、0.5毫升两性霉素B，
0.5 庆大霉素毫升和霍乱毒素4.3微升。

2）向乔治敦培养基中加入0.5毫升Y-27632。必须最后添加此组件。
3）将乔治敦培养基在4°C下储存一个月。

2.UNC/USG媒体

储存条件：必须每1-2周新鲜一次，并在4°C下储存。过滤消毒。

准备储备溶液

a、库存4:FeSO4·7H2O（0.042 g/L）
MgCl2·6H2O（12.20 g/L）

CaCl2·2H2O（0.441 g/L）

b、库存11:ZnSO4·7H2O（0.863 g/L）
c、微量元素：
亚硒酸钠中的硒（3µM）

四水氯化锰（0.1µM）中的锰，九水硅酸钠（50µM）中的硅，四水钼酸铵（0.1µM）中的钼，偏钒酸铵（0.5µM）中的钒

二氯化锡（0.05微米）

要制作500毫升UNC/USG培养基，混合以下成分：DMEM/F12（500毫升）

青霉素/链霉素（1×1:100）

股票4（1:100）

库存11（1:1000）

微量元素（1:100）

转铁蛋白（10毫克/毫升，1:1000）

氢化可的松（200µM，1:1000）

胰岛素（10毫克/毫升，1:2000）

肾上腺素（3.3毫米，1:1000）

T3（10µM，1:1000）

表皮生长因子（5微克/毫升，1:5000）

牛血清白蛋白（0.25克/毫升，1:500）

维甲酸（5毫米，1:1×105）

BPE（0.8%v/v）

磷酰乙醇胺（500µM，1:1000）

乙醇胺（500µM，1:1000）Ultroser G（0.5%v/v）

两性霉素B（250微克/毫升，1:1000）

3.电子媒体

准备储备溶液

a、腺嘌呤储备溶液：将486 mg腺嘌呤添加到15 mL dH2O中。加入约10滴浓盐酸直至溶解，然后用dH2O将体积调节至20毫升。
b、 T3溶液：将13.6 mg T3溶解在100 mL 0.02 N NaOH中。在无菌PBS中进行两次100倍的连续稀释，以获得最终储备溶液。
c、氢化可的松溶液：将25毫克氢化可的松溶解在5毫升100%乙醇中。为了生成储备溶液，将4.8毫升氢化可的松溶液添加到55.2毫升pH值为7的1M HEPES中。

制作500毫升电子介质：

1）将5.015 g DMEM粉末（含4.5 g/L D-葡萄糖和L-谷氨酰胺的DMEM，不含丙酮酸钠和碳酸氢钠）和1.33 g火腿粉末培养基（含L-谷氨酰胺的F12营养混合物，不含碳酸氢钠）溶解在300 mL的dH2O中。
2）添加1.534 g碳酸氢钠、5 mL青霉素-链霉素溶液（10000 U/mL青霉素和10000μg/mL链霉素原液）、5μL霍乱毒素（1 mg/mL溶解在dH2O中的原液）、0.5 mL腺嘌呤原液、0.5 mL转铁蛋白（5 mg/mL溶解在PBS中的原液）、0.5 mL T3原液，0.5毫升氢化可的松储备溶液，以及
0.5 1毫升胰岛素（5毫克/毫升，溶于0.1 N盐酸）。

3）用dH2O将体积调节至470 mL，并将pH调节至7.1–7.15。
4）过滤器用0.2μm孔径的低蛋白结合过滤器灭菌，并在4°C的黑暗中储存。使用前，添加5毫升制霉菌素（10000 U/mL悬浮液）和25毫升FBS。

4.EGF溶液

在dH2O中以1µg/mL溶解，并补充1 mg/mL BSA。

致谢

我们感谢Mary Ferguson和Ian Hayman为优化器官型筏提供的帮助。K.S.获得了希尔曼基金会的资助。M. M.通过囊性纤维化研究中心细胞核心获得了囊性纤维化基金会研究开发项目（匹兹堡大学）的资助。这项工作部分由匹兹堡大学医学院院长的教师进步奖和使用希尔曼组织和研究病理服务共享资源，部分由国家卫生研究院奖P30CA07904支持。该方案基于手稿“假复层上皮的原发性鼻咽三维气液界面细胞培养模型揭示了不同的donor和细胞对EB病毒感染的类型特异性易感性”（Ziegler et al.，2021）。器官型筏中EBV感染的方案改编自手稿“Epstein-Barr病毒产生和感染器官型培养物”（Temple等人，2017）。

竞争利益

两位作者没有宣布任何利益冲突。

道德准则

这些方法是按照匹兹堡大学机构审查委员会（IRB）批准的相关指导方针和条例进行的。该研究获得了IRB:STUDY19030014的批准，并按照匹兹堡大学窦液和组织库批准的指南进行。所有相关人员均已给予书面正式同意。

工具书类

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