材料和试剂

A. 海拉细胞培养

1. P100 mm 培养皿（Corning，目录号： 3262）
2. 35 mm玻璃底细胞培养皿（巢，目录号： 801002）
3. µ-Dish 35 mm，高 Grid-500 玻璃底部（IBidi，目录号： 81168）
4. Hela 细胞（ National Collection of Authenticated Cell Cultures，制造商，品牌，目录号：TCHu187）
5. DMEM （Hyclone，目录号： SH30243.01 ）
6. 胎牛血清（FBS；Gibco，目录号： 10099141）
7. 青霉素/链霉素（Gibco，目录号：10378016）
8. 磷酸盐缓冲盐水（PBS；Hyclone，目录号： SH30256.01）
9. 0.25％胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录号： 25200056）
10. Hela 培养基（见配方）

B. SH-SY5Y细胞培养

1. SH-SY5Y 细胞（ COBIOER BIOSCIENCES ，目录号：CBP60913）
2. MEM，无谷氨酰胺（Gibco，目录号： 11090081）
3. Ham's F-12 Nutrient Mix（Gibco，目录号： 11765054）
4. GlutaMAX TM （Gibco，目录号： 35050061）
5. 丙酮酸钠（Gibco，目录号： 11360070）
6. MEM NEAA（Gibco，目录号： 11140050）
7. SH-SY5Y 培养基（见配方）

C. 细胞转染和上样

1. CEPIA-3mt ( Addgene, 质粒 #58219 )
2. Parkin-mCherry（Addgene，质粒 #23956）
3. LC3-GFP（Addgene，质粒 #11546）
4. jetPRIME（Polyplus，目录号： 101000046）
5. MitoTracker TM Green（Invitrogen，目录号： M7514）
6. MitoTracker TM Red CMXRos（Invitrogen，目录号： M7512）
7. 四甲基罗丹明，甲酯，高氯酸盐（TMRM）（Invitrogen，目录号： T668）
8. MitoSOX TM Red Mitochondrial Superoxide Indicator（Invitrogen，目录号： M36008）
9. 二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，目录号： D9170）

D. 免疫荧光

1. 4％多聚甲醛固定溶液（ Beyotime，目录号：P0099 ）
2. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号： 9036-19-5）
3. 脱脂奶粉（Sangon Biotech，目录号： A600669-0250）
4. Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号： P1379）
5. 抗 PINK1 抗体（Abcam，目录号： ab216144）
6. 抗体抗兔IgG H&L （Sigma，目录号： AP307P）
7. 抗褪色封固剂（Beyotime，目录号： P0126）

设备

1. 飞秒激光（MenloSystems，类型：BlueCut OEM Seed，序列号：111；类型：BlueCut Amp，序列号：116；1030 nm， 1 MHz，220 fs ）
2. 共聚焦显微镜（Olympus，型号：FV1200）
3. 激光功率计（COHERENT，项目编号：1098297，型号：FIELDMATE，序列号：0763K14R）

软件

1. FV1200 （奥林巴斯）
2. 图像J
3. GraphPad 棱镜 7
4. Adobe Illustrator CC 2017

程序

A. 细胞培养和转染

1. Hela细胞传代
a. Hela 细胞在补充有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素（迄今称为 DMEM10）的 DMEM 中培养。
b. 当细胞密度达到大约 80% 时，从 100 mm 培养皿中取出 DMEM10 培养基。
c. 用 1.5 mL 的 PBS 清洗培养皿三次。取出 PBS。
d. 慢慢加入 1 mL 胰蛋白酶，将培养皿放回 37°C 培养箱中 1 分钟。
e. 去除胰蛋白酶。添加2-3 毫升的DMEM10 培养基。移取培养基数次以帮助细胞分离。将含有细胞的培养基转移到 15 mL 管中。
f. 将 ~ 25,000 个细胞播种到 35 mm 玻璃底培养皿中，并添加高达 1.5 mL 的 DMEM10 培养基。
g. 将含有细胞的培养皿放回培养箱中。在转染、染色或 UPLaS 实验之前，将细胞在 37°C 下孵育 24 小时。
2. 细胞转染
a. 在 200 μL 的 jetPRIME 缓冲液中稀释 1 μg DNA（CEPIA-3mt、Parkin-mCherry 或 LC3-GFP）。
b. 涡旋 10 秒并向下旋转。
c. 添加 2 μL的 jetPRIME 试剂（DNA/jetPRIME 比率 1:2）。
d. 涡旋 1 秒，向下旋转，并在室温 (RT) 下孵育 10 分钟。
e. 将转染混合物添加到 35 mm 培养皿中 2 mL DMEM10 培养基中培养的细胞中。
f. 转染后 4 小时将 DMEM10 培养基更换为 2 mL 的新鲜 DMEM10 培养基。
g. 转染后 24-48 小时检查转染效率。通常情况下，通过荧光显微镜选择多个视野 (FOV)，当 60-80% 的细胞已成功转染时，转染是理想的。

B. 设置 UPLaS 系统

该 UPLaS 系统由商用共聚焦显微镜和飞秒激光器组成。在图 2 中，光纤飞秒激光器（1,030 nm、 1 MHz、220 fs 、 1 W）被整合到共焦系统的激发路径中。
1. 打开共聚焦显微镜。
2. 将振镜固定在 FOV 的中心。
3. 打开飞秒激光。

4. 使用反射镜（RM1 和 RM2，如图 2B 所示）将飞秒激光束引导通过机械快门。打开快门。

图 2. 在飞秒激光耦合到共聚焦显微镜上建立的光刺激方案。
(A) (B) UPLaS 系统的光路。飞秒激光通过RM4和RM5对准显微镜扫描系统，形成UPLaS系统。 CCD 相机用于提供明亮的图像以对齐光路。 DM = 二向色镜，RM = 反射镜。共焦扫描激光波长为488 nm/532 nm，典型的荧光采集波长区间为<560 nm/560-625 nm/>625 nm。光纤飞秒激光器（1,030 nm、120 fs、50 MHz、1 W）可以被 Ti = Sapphire 激光器（810 nm、80 MHz、65 fs、1 W）或其他商用飞秒激光振荡器代替。

5. 转动 RM4 和 RM5，使飞秒激光束与扫描激光束重合。
6. 测量飞秒激光物镜的传输效率。

7. 关闭快门、飞秒激光和共聚焦显微镜，直到实验开始。

C. UPLaS 激活 mitoCa 2+振荡

1. 2+指示蛋白转染细胞
a. 准备转染 CEPIA-3mt 的 Hela 细胞，如步骤 A 中所述。

b. 转染后 4 小时更换培养基，在 UPLaS 实验前孵育 24 小时。
2. 激活 Ca 2+振荡。
a. 在实验开始前 30 分钟打开飞秒激光，以稳定激光能量输出并确保快门关闭。
b. 打开激光扫描共聚焦显微镜并打开显微镜软件。将激发激光设置为 473 nm。将 473 nm 激光器的功率级别设置为 0.1 mW。将图像尺寸设置为 512 × 512 像素。将每个像素的间隔时间设置为 2 μ s。将总成像帧设置为大约 100，为任何单个实验提供约 3 分钟的连续显微镜。
c. 从培养箱中取出含有用 CEPIA-3mt 转染的细胞的培养皿，将细胞放入安装在显微镜台上的 37°C 培养箱中。
d. 选择目标细胞，用 473 nm 激光获取 CEPIA-3mt 的荧光图像，如图 1 所示。
e. 选择目标线粒体并定义刺激参数。
i. 设置刺激点 (1 × 1 μ m 2 )，在单个线粒体管状结构中
ii. 将总刺激时间设置为 0.1 s。根据预定义的光刺激区域将飞秒激光的快门与共焦扫描同步，仅在激光扫描下降到刺激帧时打开，当它熄灭时立即关闭。
iii. 在样品中将飞秒激光的功率设置为 8 mW（1，030 nm）。
f. 设置扫描和刺激时间顺序。
g. 在 Pre-UPLaS CM 和 Post-UPLaS CM 期间使用 473 nm 激光扫描目标细胞。在 UPLaS 期间用飞秒激光刺激细胞。
h. 单击 XY-T 按钮开始连续显微成像进程。
i. 等到成像过程完成并保存成像数据。
j. 实验后关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。

D. 检测 MMP 和 mitoROS 的变化

1. 检测 UPLaS 刺激的细胞中的 MMP 变化
a. 按照步骤 A.1 准备 Hela 细胞。
b. 将 5 mg 的 TMRM 溶解到 200 μL 的 DMSO 中，达到 50 mM 的库存浓度。
c. 将 1 μL 的 TMRM 溶解到 1 mL 的 DMSO 中至 50 μM。
d. 准备 TMRM 染色溶液：在 1mL 的 DMEM10 培养基中稀释 1 μL 的 TMRM（50 μM），最终浓度为 50 nM。
e. 将细胞在 TMRM 染色溶液中于 37°C 孵育 20 分钟。
f. 用 2 mL 的 DMEM10 培养基替换 TMRM 染色溶液。
g. 按照步骤 C.2，使用 UPLaS 系统刺激单个线粒体并检测 MMP 的变化。

2. 检测 UPLaS 刺激的细胞中的 mitoROS 变化
a. 按照步骤 A.1 准备 Hela 细胞。
b. 将 50 μg的 MitoSOX 溶解在 6.6 μL的 DMSO 中，至 10 mM 的库存浓度。
c. DMEM10培养基中，最终浓度为 10 μM。
d. 将细胞在 MitoSOX 染色溶液中于 37°C 孵育 20 分钟。
e. 用 2 mL 的 DMEM10 培养基替换 MitoSOX 染色溶液。
f. 使用 UPLaS 系统刺激单个线粒体，并在步骤 C.2 之后检测 mitoROS 的变化。

E. 检测 Parkin 的招募

1. 帕金指示蛋白转染细胞
a. 如步骤 A 中所述，将 ~25,000 个细胞播种到 35 mm 玻璃底培养皿中，并带有网格，并用 Parkin-mCherry 转染细胞。

b. 转染后 4 小时将 DMEM10 培养基更换为 2 mL 的新鲜 DMEM10 培养基，并在 UPLaS 实验前孵育 24 小时。
2. 使用 MitoTracker 加载细胞
a. 按照步骤 E.1 准备转染 Parkin-mCherry 的 Hela 细胞。
b. 将 50 μg 的 MitoTracker Green 溶解在 74.4 μL 的 DMSO 中，至 1 mM 的库存浓度。
c. 将 1 μL 的 MitoTracker Green (1 mM) 溶解在 10 μL 的 DMSO 中，至 100 μM。
d. 准备 MitoTracker Green 染色溶液：将 1 μL 的 MitoTracker Green (100 μM) 稀释到 1 mL 的 DMEM10 培养基中，最终浓度为 100 nM。
e. 将细胞在 MitoTracker Green 染色溶液中于 37°C 孵育 20 分钟。
f. 更换 MitoTracker 绿色染色含有 2 mL DMEM10 培养基的溶液。
3. 检测由 UPLaS 诱导的线粒体对 Parkin 的募集
a. 使用 UPLaS 系统刺激单个线粒体管状结构，并按照步骤 C.2 获取 Parkin-mCherry 和 MitoTracker Green 的荧光图像。

b. 将细胞放回培养箱中。
c. 30 分钟后，将带网格的盘子放在显微镜台上。找到选定的网格和被飞秒激光刺激的细胞。
d. 开始单帧共聚焦扫描。找到由飞秒激光刺激的线粒体。保存光刺激的帕金分布荧光图片以进行进一步的数据分析。
e. 再次将细胞放回培养箱中，并在刺激 1 小时和 2 小时后重复步骤 E.3.c 和 d。
f. 实验后关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。

F. 检测 PINK 的变化

1. 细胞制备和刺激
a. 如步骤 A.1 中所述，准备播种到 35 mm 玻璃底培养皿中的 Hela 细胞。
b. 将 50 μg MitoTracker Red 溶解在94 μL 的 DMSO 中，至 1 mM 的库存浓度。
c. 将 1 μL 的 MitoTracker Red (1 mM) 溶解在 10 μL 的 DMSO 中，至 100 μM。
d. 准备 MitoTracker Red 染色溶液：在 1 mL 的 DMEM10 培养基中稀释 1 μL MitoTracker Red (100 μM)，最终浓度为 100 nM。
e. 将细胞在 MitoTracker Red 染色溶液中于 37°C 孵育 20 分钟。
f. 用 2 mL 的 DMEM10 培养基替换 MitoTracker Red 染色溶液。
g. 使用 UPLaS 系统刺激单个线粒体，如步骤 E.3 中所述。

h. 将盘子放回培养箱中。在免疫荧光 (IF) 显微镜前孵育细胞 5 分钟、30 分钟和 1 小时。
2. UPLaS 细胞中 PINK1 的免疫荧光 (IF) 显微镜检查
a. 洗涤：将含有步骤 F.1 中经过光刺激处理的细胞的培养皿从培养箱中取出。去除 DMEM10 培养基。用 PBS 清洗细胞 3 次。删除 PBS。
b. 修复：在 4°C 下将 1 mL 的 4% 多聚甲醛 (PFA) 添加到培养皿中。用 4% PFA 固定细胞 10 分钟。删除 PFA。用 PBS 清洗细胞两次，每次 5 分钟。删除 PBS。
c. 透化：在室温下将细胞在 1 mL 的 0.1% Triton X-100 中的 PBS 中孵育 15 分钟。取出 Triton X-100 缓冲液。用 PBS 清洗细胞两次，每次 5 分钟。删除 PBS。
d. 块：在室温下将细胞在 1 mL 的 1% 脱脂奶粉中的 PBS 中孵育 30 分钟。移除阻塞缓冲液。
e. 一抗孵育：在 PBS 中用 0.1% Tween-20 (1:500) 稀释抗 PINK 抗体。将细胞在 4°C 的初级抗体缓冲液中孵育 12 小时。去除一抗孵育缓冲液。
f. 二抗孵育：用 1% Tween-20 (1:10,000) 在 PBS 中稀释二抗抗兔 IgG H&L。在 RT 的二级抗体缓冲液中孵育细胞 2 小时。取出二抗孵育缓冲液。
g. 用 PBS 清洗细胞。删除 PBS。
h. 密封：在培养皿中加入抗褪色封固剂以保持荧光。
i. 将处理过的盘子放在显微镜台上。找到选定的网格和用飞秒激光处理的单元格。
j. 开始单帧共聚焦扫描。用 473 nm 激光激发 Anti-PINK 的荧光，用 543 nm 激光激发 MitoTracker Red 的荧光。
k. 保存受刺激细胞的荧光图像以进行进一步的数据分析。

G. 检测线粒体自噬的变化

1. 用荧光自噬体转染细胞指示蛋白
a. 准备播种到 35 mm 玻璃底培养皿中的 Hela 细胞，如步骤 A 中所述，用网格和 LC3-GFP 转染细胞。

b. 转染后 4 小时将 DMEM10 培养基更换为 2 mL 的新鲜 DMEM10 培养基，并在 UPLaS 实验前孵育 24 小时。
2. 使用 MitoTracker Red 加载细胞
a. 按照步骤 E.1 准备转染 LC3-GFP 的 Hela 细胞。
b. 将 50 μg MitoTracker Red 溶解在94 μL 的 DMSO 中，至 1 mM 的库存浓度。
c. 将 1 μL 的 MitoTracker Red (1 mM) 溶解在 10 μL 的 DMSO 中，至 100 μM。
d. 准备 MitoTracker Red 染色溶液：在 1 mL 的 DMEM10 培养基中稀释 1 μL 的 MitoTracker Red（100 μM），最终浓度为 100 nM。
e. 将细胞在 MitoTracker Red 染色溶液中于 37°C 孵育 20 分钟。
f. 用 2 mL 的 DMEM10 培养基替换 MitoTracker Red 染色溶液。
3. 检测 UPLaS 诱导的自噬体的形成
a. 如步骤 C.2 所述，对转染 LC3-GFP 并加载 MitoTracker Red 的细胞进行 UPLaS 实验。

b. 将细胞放回培养箱中。
c. 30 分钟后，将盘子放在显微镜台上。找到选定的网格和被飞秒激光刺激的细胞。
d. 开始单帧共聚焦扫描。找到被飞秒激光刺激的线粒体。保存光刺激细胞的 LC3-GFP 分布荧光图像以进行进一步的数据分析。

数据分析

A. 处理荧光图像的步骤

1. 根据共聚焦显微镜软件 FV1200 (Olympus) 获取荧光图像。
a. 选择“文件”>“打开”。
b. 选择一个实验文件并单击打开。
b. 选择“文件”>“导出”>“文件类型：TIFF”。
c. 选择一个目标文件夹并单击保存，如图 3 所示。

图 3. 将实验文件导出为 TIFF 图像系列。

2. 通过 ImageJ 软件获取荧光强度。
a. 将您的文件夹拖到 ImageJ 中。选择转换为 RGB 并使用虚拟堆栈。单击是，如图 4A 所示。此文件夹中的所有图像都显示为堆栈（图 4B）。
b. 单击“多边形”按钮（图 4C）。要创建多边形选择，请反复单击鼠标以创建线段。完成后，单击起点处的小框（或双击），ImageJ 将自动绘制最后一段（图 4D）。可以移动定义多边形选择的点，并且可以使用修改键来删除或向多边形添加新顶点。
c. 选择图像 > 堆栈 > 测量堆栈（图 4E），以显示此堆栈中所有图像的平均值（图 4F）。
3. 将 ImageJ 中所有图像的平均值和 FV1200 记录的时间序列复制到 GraphpPad Prism 7。使用 GraphPad Prism 7 绘制图表。

图 4. 使用 ImageJ 软件获取荧光强度的工作流程。

B. 代表性数据

如图 1 和图 2 所示，我们通过将飞秒激光对准共聚焦显微镜的光路，建立了一种无创超精密激光刺激( UPLaS )技术。这种 UPLaS 方法能够针对单个线粒体进行时空特异性刺激。如图 5 所示，UPLaS在单个线粒体管状结构中引起局部 mitoCa 2+振荡，具有瞬时、中度和快速恢复的 MMP 去极化，而 mitoROS 在那里增加，对其邻居没有任何干扰。
Parkin-mCherry 的延时动力学表明，在 UPLaS 后 1 小时出现了对受刺激线粒体的最显着的 Parkin 募集。然后，我们测量了 PINK1 [通过免疫荧光 (IF) 显微镜观察] 和线粒体（由 MitoTracker Red 指示）的共定位。 PINK1 的 IF 显微镜在 UPLaS 后 5、30 和 60 分钟进行。 UPLaS 后 1 小时，受刺激线粒体上的 PINK1 水平较高。最终，用UPLaS处理的线粒体都与自噬体一致。详细分析见https://doi.org/10.1038/s41419-021-03913-3 。

图 5. UPLaS 激发目标线粒体中的 mitoCa 2+振荡。
UPLaS 刺激的单个线粒体。 CEPIA-3mt 表示mitoCa 2+对 UPLaS（在 t = 5 s）的响应。白色箭头指向飞秒激光刺激的单个线粒体管状结构。

C. 每个独立实验应至少重复三个实验重复进行。

笔记

1. 在我们的实验中，我们将飞秒激光对准共聚焦显微镜。双光子显微镜的功能可以完全实现UPLaS技术。
2. 我们对 Hela 细胞和 SH-SY5Y 细胞进行了相同的 UPLaS 实验。培养和转染过程与Hela细胞相同。
3. 实验后关闭飞秒激光和共聚焦显微镜。
4. 使用 TMRM 时，尽可能降低可见激光（473 nm 和 543 nm）的功率。

食谱

1. Hela培养基（DMEM10培养基）
500 毫升 DMEM
10 mL (1×) 青霉素/链霉素
50 毫升胎牛血清

2. SH-SY5Y培养基（MEM/F12-10培养基）
43.5 mL MEM，不含谷氨酰胺
43.5 毫升 Ham's F-12 营养混合物
10 毫升胎牛血清
1 毫升 GlutaMAX
1毫升丙酮酸钠
1 毫升 MEM NEAA
1 mL (1 × ) 青霉素/链霉素

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金 (NSFC 92054105、62022056 和 61975118)、上海市科委 18QA1402300 和上海市教委创新研究计划 ZXWF082101 到 HH 的支持
原始研究论文 Yu等人。 (2021): 线粒体 Ca 2+振荡通过 PINK1-Parkin 途径诱导线粒体自噬启动。 https://doi.org/10.1038/s41419-021-03913-3 。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

伦理

本研究经上海交通大学生物医学工程学院伦理委员会批准。

参考

Cheng，P.，Tian，X.，Tang，W.，Cheng，J.，Bao，J.，Wang，H.，Zheng，S.，Wang，Y.，Wei，X.，Chen，T.，等人。（2021 年）。通过超快激光直接控制储存操作的钙通道。单元格第 31（7）号：758-772。
Chung, E.、Choi, Y.、Park, J.、Nah, W.、Park, J.、Jung, Y.、Lee, J.、Lee, H.、Park, S. 和 Hwang, S.（ 2020）。 Parkin 的细胞内递送使神经元免受受损线粒体和病理性 α-突触核蛋白的积累。科学进阶 6 (18): eaba1193。
Ge, P., Dawson, VL 和 Dawson, TM (2020)。 PINK1 和 Parkin 线粒体质量控制：帕金森病区域脆弱性的来源。摩尔神经变性剂15（1）：20。
He, H., Li, S., Wang, S., Hu, M., Cao, Y. 和 Wang, C. (2012)。通过飞秒激光操纵来自绿色荧光蛋白的细胞光。国家光子学 6 (10): 651-656。
Iwanaga, S.、Smith, N.、Fujita, K. 和 Kawata, S. (2006)。使用低重复率飞秒脉冲照射的慢速 Ca 2+波刺激。选择快递 14 (2): 717-725。
Jin, SM 和 Youle, RJ (2013)。 PINK1 感知线粒体基质中错误折叠蛋白的积累，从而诱导 PARK2/Parkin 介导的极化线粒体线粒体自噬。自噬9（11）：1750-1757。
Lazarou, M., Sliter, DA, Kane, LA, Sarraf, SA, Wang, C., Burman, JL, Sideris, DP, Fogel, AI 和 Youle, RJ (2015)。泛素激酶 PINK1 募集自噬受体以诱导线粒体自噬。自然 524 (7565): 309-314。
Liu, J.、Liu, W.、Li, R. 和 Yang, H.（2019 年）。帕金森病中的线粒体自噬：从发病机制到治疗。细胞 8 （7）：712。
Liu, X., Lv, X., Zeng, S., Zhou, W. 和 Luo, Q. (2009)。使用飞秒激光对神经回路进行非接触和无损识别。应用物理快报 94 （6）：061113。
Pickrell, AM 和 Youle, RJ (2015)。 PINK1、parkin 和线粒体保真度在帕金森病中的作用。神经元 85 (2): 257-273。
Russell, OM, Gorman, GS, Lightowlers, RN 和 Turnbull, DM (2020)。线粒体疾病：对未来的希望。细胞 181 （1）：168-188。
Smith, NI, Iwanaga, S., Beppu, T., Fujita, K., Nakamura, O. 和 Kawata, S. (2005)。飞秒激光诱导神经型细胞中的钙释放。在：纳米生物光子学和生物医学应用 II，国际光学和光子学学会。过程 SPIE 5705，https://doi.org/10.1117/12.596923。
Smith, NI, Kumamoto, Y., Iwanaga, S., Ando, J., Fujita, K. 和 Kawata, S. (2008)。用于心肌细胞的飞秒激光起搏器。选择快递16(12)：8604-8616。
Wang, S., Liu, Y., Zhang, D., Chen, S. c., Kong, SK, Hu, M., Cao, Y. 和 He, H. (2018)。飞秒激光对靶细胞中细胞外信号调节激酶信号的光激活。激光光子学 Rev 12 （7）：1700137。
Wang, Y., He, H., Li, S., Liu, D., Lan, B., Hu, M., Cao, Y. 和 Wang, C. (2014)。靶细胞中基因表达的全光调控。科学代表4：5346。
Yu, Z.、Wang, H.、Tang, W.、Wang, S.、Tian, X.、Zhu, Y. 和 He, H. (2021)。线粒体 Ca 2+振荡通过 PINK1-Parkin 途径诱导线粒体自噬启动。细胞死亡 Dis 12（7）：632。
Zhao, Y., Zhang, Y., Liu, X., Lv, X., Zhou, W., Luo, Q. 和 Zeng, S. (2009)。用飞秒激光脉冲对星形胶质细胞进行光刺激。选择特快17(3)：1291-1298。