材料和试剂

1. 聚乙烯膜（和建杰利塑料制品有限公司，膜厚： 10μm ）
2. 超声凝胶（GUANGGONG PAI，医用超声凝胶）
3. 去离子水

设备

1. FiberPort （ Thorlab ，型号：PAF-X-7-A ）
2. 单模光纤（ Thorlab ，型号：P1-460B-FC-5）
3. 准直器（ Thorlab ，型号：F240FC-532）
4. 物镜（大恒光学，型号：GCO-2101）
5. 超声波换能器（多普勒电子技术，型号： Fused φ8-3 )
6. 放大器（射频托架，型号：LNA-650 ）
7. 数据采集卡（Spectrum，型号：M3i.3221）
8. 图形处理单元（NVIDIA，型号：GeForce GTX 1060）
9. XY平移台（建诚光学，型号：LS2-25T）
10. 电机驱动器（建诚光学，型号：LS2-MD）
11. 机械臂（Ergotron，型号： 826-842)
12. 现场可编程门阵列（Altera，型号： Cyclone IV）
13. 联轴器杯（深圳WeNext Technology ，材质：尼龙）
14. 同轴电缆（Talent RG 电缆，型号：RG58/U）
15. 小型A 型 (SMA) 连接器（ Rebes ，型号：50 Ω ）
16. 激光护目镜（大恒光学，型号：GCAQ-YAD）
17. 铜箔胶带（深圳三旺达电子材料，型号： 3M1181）
18. 卡扣式磁环（嘉林磁业，型号：SCRC 35B）
19. 532-nm 脉冲激光（Laser-export，型号：DTL-314QT）
20. 直流电源（龙威，型号：PS-1502D）
21. 激光功率计（Physcience Opto-electronics，型号：LPE-1）
22. 数字万用表（Fluke，型号：115C）

软件

1. LabVIEW 2016（美国国家仪器， https://www.ni.com/zh-cn.html ）
2. MATLAB2020a ( MathWorks, https://ww2.mathworks.cn/ )
3. ImageJ（美国国立卫生研究院软件， https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

该协议改编自 Wang等人。 (2022b)，并提供了 PAD 构建的详细程序，包括组件选择、设备设置和系统校准。提供了人体皮肤成像的分步指南作为示例应用程序。

A. 系统设置

1. 使用 532 nm 脉冲激光作为激光照明源。使用 LabVIEW 程序将激光的重复频率设置为 10 kHz，将输出能量设置为 80%，并将触发设置设置为外部触发（图 2A）。

2. FiberPort直接固定在激光束出口的前面（图 2B）。
3. FiberPort (FP)将激光束耦合到单模光纤 (SMF) (图 2B)。

4. 使用光纤准直器准直单模光纤输出端的激光束（图 2C）。
5. 使用物镜聚焦准直激光束（图 2D）。
6. 将超声波换能器固定在物镜下（图 2E）。
7. 将聚焦的激光束穿过超声波换能器的中心孔（图 2F）。
8. 将耦合杯固定在超声波换能器下方（图 2G）。

9. 将外壳固定在 XY 平移台的中心。
10. 将超声波换能器连接到放大器的输入端口（图 2H）。
11. 使用同轴电缆将放大器的输出端口连接到数据采集卡的输入端口。
12. 将直流电源设置为 15 V，为放大器供电。
13. 使用带有 SMA 连接器的同轴电缆将电机驱动器的输出端口连接到 FPGA 的 I/O 端口 1 （图 2I）。
14. 使用带有 SMA 连接器的同轴电缆将 FPGA 的 I/O 端口 2 连接到脉冲激光的外部触发器（图 2I）。
15. 使用带 SMA 连接器的同轴电缆将 FPGA 的 I/O 端口 3 连接到数据采集卡的外部触发器，以输入同步信号（图 2J）。

图 1. 光声皮肤镜系统设置。
A. PAD 系统示意图。 B. 扫描采集时序图。 T1、T2、T3：触发； Col：准直器； OL：物镜； UT：超声波换能器； CC：耦合杯； SMF：单模光纤； DAQ：数据采集卡； AMP：放大器； FPGA：现场可编程门阵列。

图 2. 系统对齐图片。
A. 用于激光的 LabVIEW 程序。 B. 激光和光纤端口。 C. 光纤准直器。 D. 物镜。 E. 外壳和超声波换能器。 F. 耦合杯。 G. 超声波换能器。 H. 从超声波换能器到放大器的信号。 I. 在 FPGA 上触发连接。 J. 数据采集卡上的触发和信号连接。

B. 系统对齐

1. 使用聚乙烯膜密封耦合杯底部，并向耦合杯中加入去离子水（图 3A）。
2. 在超声波换能器下方添加去离子水（图 3B）。
3. 超声波换能器的底部调整到去离子水中（图 3C）。

4. 打开激光开关。选择激光控制程序。预热十五分钟。

5. 按下泵送开关的“ON”按钮。设置脉冲激光的外部触发器。
6. 仔细检查激光脉冲能量和脉冲重复率。
7. 使用激光功率计测量光能，以确保安全阈值 (20 mJ /cm 2 )。
8. 将刀片放在聚乙烯膜的底部。

9. 选择 A-Line LabVIEW 程序。按下“开始”按钮捕获定点信号并显示当前A-Line信号的幅度和频谱。
10. 调整超声波换能器的 XY 位置以避免信号振荡，并确保光学和声学焦点是共焦的。
11. 调整耦合杯的高度，以最大化 A 线信号的幅度（图 3C）。
12. 取下刀片并擦拭聚乙烯膜上的超声凝胶。
13. 将超声凝胶加入志愿者皮肤上，均匀涂抹。
14. 将集成成像探头靠近志愿者的皮肤放置，并在体内捕获人体皮肤的 A-Line 信号。
15. 稍微调整耦合杯的高度，使皮肤信号的幅度最大化。

16. 停止 A-Line LabVIEW 程序。

图 3. 皮肤信号的系统对齐和采集。
A. 向耦合杯中加入去离子水。 B. 在超声波换能器下方加入去离子水。 C、调整耦合杯与超声换能器的相对高度。 D.人体皮肤的A-Line PA信号。

C. 人体皮肤成像（视频 1）

1. 在人体皮肤成像之前，所有参与者都获得了口头和书面知情同意。
2. 参加者需佩戴激光护目镜。
3. 打开激光开关。选择激光控制程序。预热十五分钟。

4. 按下泵送开关的“ON”按钮。设置脉冲激光的外部触发器。
5. 仔细检查激光脉冲能量和脉冲重复率。
6. 选择成像区域并应用超声凝胶或去离子水（图 4A）。
7. 将耦合杯的聚乙烯膜与皮肤成像区域完全接触（图 4B）。
8. 打开LabVIEW程序。命名新创建的文件夹以保存数据。
9. 选择扫描速度、扫描区域大小、扫描步长和采集深度。例如，将扫描参数设置为“速度”选项卡中的“10 mm/s”、“区域”选项卡中的“5 mm*5 mm”、“采集深度”选项卡中的“500”和“10”在“步骤”选项卡中。
10. 单击“收集”按钮开始扫描。
11. 让志愿者保持静止，避免身体活动。
12. 扫描完成后点击“停止”按钮结束扫描。单击“归零”可使 XY 平移台归零。
13. 按“OFF”按钮关闭激光。
14. 单击“退出”按钮退出LabVIEW程序。
15. 取下聚乙烯膜，倒出耦合杯中的去离子水。

视频 1. 人体皮肤成像

图 4. 皮肤信号的系统对齐和采集。
A. 在成像前将超声凝胶或去离子水涂抹在目标区域。 B. 保持耦合杯与皮肤完全接触。

D. 故障排除程序

1. 激光光斑较大或照明不均匀：首先，确保光纤准直器正确连接到单模光纤的输出端。其次，确保超声波换能器下方没有气泡。
2. 无PA信号：首先确保数据采集卡可以正常采集信号。如果数据采集卡不工作，请检查外部触发信号是否正常。其次，确保脉冲激光设置为外部触发。第三，确保放大器已通电，并且所有同轴电缆都正常工作并正确连接。
3. PA信号中有较强的外来噪声：首先用数字万用表确保电机驱动器、放大器、超声波换能器的地线与电源地线相连。其次，使用铜箔胶带将放大器连接到外壳。第三，将卡扣式磁环固定在放大器的SMA接头和同轴信号线上。
4. PA 图像中有强烈的运动伪影：首先，确保机械臂固定且稳定。其次，确保 XY 平移台和外壳牢固连接。

数据分析

1. 每个激光脉冲无需机械扫描即可生成一维 (1D) 深度分辨图像，而 2D 横向扫描生成 3D 图像。 3D 体积 PA 数据是在扫描皮肤后获得的 (图 5A)。对于 PA 数据处理，首先，通过 x-z 横截面图像观察皮肤形态以获得皮肤表面（如图 5B 所示的红色虚线）。然后，根据皮肤表面和角质层和基底层的厚度，将所有的x-z横截面图像按深度划分，得到角质层、基底层和真皮。黑色素和血红蛋白分布的深度在 PA 横截面图像中清晰可见。图5B1-5B3分别代表角质层、基底层和真皮的PA横截面图像。此外，这些结构的横向最大振幅投影（MAP）如图 5C-5E 所示，清楚地显示了不同皮肤层中不同的形态结构。图5E显示真皮中丰富的血管形态；这种微血管的分支和形态与人体皮肤的生理状况密切相关（Aguirre et al. , 2017）。

图 5.人体皮肤的体内成像。
A. 人体皮肤的 3D 体积图像。 B. 人体皮肤的 PA 横截面图像，B1。角质层，B2。基底层和B3。真皮层。光盘。 C. 角质层、 D .基底层和 E. 真皮的光声横向 MAP 图像。比例尺：0.5 毫米。 PA，光声； MAP，最大幅度投影。

2. 为了进一步量化血管形态，分析真皮中血管的密度和直径（图 6A）。血管密度（VD）被定义为所有血管像素与所选总区域的总像素的比率，以反映给定区域中血管分布的数量。其中，整体像素为所选区域内的总像素数，血管像素为该区域内血管的总像素数。
计算血管密度，首先将图像格式改为8-bit（Menu: Image, Type, 8-bit），设置合适的阈值，对光声图像进行二值化（Menu: Image, Adjust, Threshold）。在相应的二值图像中，血管像素灰度值设置为 1，非血管像素灰度值设置为 0（图 6B）。最后，计算血管像素数与所有像素数之比：血管密度约为 37%。
在计算血管直径时，一条穿过血管骨架的垂直线在两点与血管边界相交，这两点之间的距离被认为是该点的血管直径。首先，将光声图像二值化，然后提取血管的边界（图 6C）。围绕像素点在一定范围内画出血管骨架的每个像素点的垂直线。确定血管边界图中对应的两点，计算两点之间的直线距离作为该点处的直径。最后，绘制血管直径的统计直方图（图 6D）。

图 6.皮肤血管形态的定量评估。
A. 真皮的光声横向 MAP 图像。 B. 对应于 AC 的二值图像对应于 AD 的血管边界 A 中血管直径的分布。比例尺：0.5 mm。

笔记

1. 功放电源调到15V，高电压会损坏功放。
2. 用于照射人体皮肤的激光能量需要满足安全标准（美国国家激光安全使用标准）。

致谢

基金项目：国家自然科学基金项目（61822505；11774101）、广东省科技计划项目（2015B020233016）和广州市科技计划项目（2019050001）资助。
该协议改编自我们实验室先前发表在《欧洲皮肤病学和性病学学会杂志》（Wang等人，2022b）和医学和外科定量成像（Wang等人，2022a）上的研究。

利益争夺

作者没有需要声明的利益冲突或利益冲突。

伦理

该研究经中国临床试验注册伦理委员会批准（ChiECRCT20200184）并在中国临床试验注册中心注册（ChiCTR2000034400）。在皮肤成像之前，所有参与者都获得了书面知情同意书。

参考

Aguirre, J.、Schwarz, M.、 Garzorz , N.、Omar, M.、Buehler, A.、 Eyerich , K. 和Ntziachristos , V. (2017)。用超宽带光声介观镜对无标记银屑病生物标志物进行精确评估。国家生物医学工程1（5）：0068。
Ma, H., Cheng, Z., Wang, Z., Gu, Y., Zhang, T., Qiu , H. and Yang, S. (2018)。快速线性共聚焦扫描光声皮肤镜检查无创评估色素沉着病。应用物理快报113：083704。
Ma, H.、Cheng, Z.、Wang, Z.、Zhang, W. 和 Yang, S. (2020)。可切换的光学和声学分辨率光声皮肤镜，专用于人体皮肤的活体活检。应用物理快报116（7）：073703。
Ma, H., Cheng, Z., Wang, Z., Qiu , H., Shen, T., Xing, D., Gu, Y. 和 Yang, S. (2021)。通过无创光声显微镜活检对皮肤血管病进行定量和解剖成像。 Biomed Opt Express 12（10）：6300-6316。
Tsuge , I.、Saito, S.、Yamamoto, G.、Sekiguchi, H.、Yoshikawa, A.、Matsumoto, Y.、Suzuki, S. 和 Toi, M.（2020 年）。大腿前外侧皮瓣手术的术前血管映射：光声断层扫描成像的临床试验。显微外科40（3）：324-330。
Wang, LV 和 Hu, S. (2012)。光声断层扫描：从细胞器到器官的体内成像。科学335（6075）：1458-1462。
Wang, Z.、Yang, F.、Ma, H.、Cheng, Z. 和 Yang, S. (2020)。通过使用双压电晶片换能器，具有高灵敏度和穿透深度的光声和超声 (PAUS) 皮肤镜。 J生物光子学13（9）：e202000145。
Wang, Z.、Yang, F.、Cheng, Z.、Zhang, W.、 Xiong , K.、Shen, T. 和 Yang, S. (2022a)。通过光声显微镜对皮肤增白进行定量多层评估。 Quant Imaging Med Surg 12（1）：470-480。
Wang, Z.、Yang, F.、Ma, H.、Cheng, Z.、Zhang, W.、 Xiong , K.、Shen, T. 和 Yang, S. (2022b)。双焦 532/1064 nm 交替照明光声显微镜，用于捕捉人体皮肤深层血管形态。 J Eur Acad Dermatol Venereol 36（1）：51-59。
Xu, D.、Yang, S.、Wang, Y.、Gu, Y. 和 Xing, D. (2016)。人体皮肤的无创和高分辨率光声皮肤镜检查。 Biomed Opt Express 7（6）：2095-2102。