材料和试剂
注意：除非另有说明，否则所有试剂均在室温下保存。
冰
MilliQ水
蛋白质表达
1.5 mL离心管（Eppendorf，Sigma-Aldrich，目录号：EP0030120086-1PAK）
50 mL无菌离心管（Corning， Sigma-Aldrich，目录号：CLS430290）
100毫米培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：P5731-500EA）
细胞吊具，无菌（Sigma-Aldrich，目录号：HS8171A-500EA）
2 L 细胞培养锥形瓶
10 mL血清移液管，无菌（Sigma-Aldrich，目录号：CLS4488-50EA）
25 mL血清移液管，无菌（Sigma-Aldrich，目录号：CLS4251-200EA）
铝箔_
pET22 b( +)- ALDH Tt （由 Hayes等人在实验室构建（2018 年）），储存于 -20°C
BL21(DE3) 化学感受态细胞（实验室制备），-80°C 储存
LB琼脂（Fisher Scientific，目录号：BP9724-500）
LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
氨苄青霉素钠盐（Fisher Scientific，目录号： A0166），储存在 4°C
胰蛋白胨（Fisher Scientific，目录号：1278-7099）
酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：10225203）
硫酸铵（（NH 4 ） 2 SO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：A4418）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S9763）
甘油（Fisher Scientific，目录号：BP229-4）
（D）-（+）-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7528）
α-乳糖一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：L2643）
七水合硫酸镁（MgSO 4 · 7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：230391）
ZY 媒体（见食谱）
20 × NPS（见食谱）
50 × 5052（见配方）
1 M MgSO 4 (见配方)
ZYP-5052 自动感应培养基（见配方）

蛋白质纯化
1 L 带密封盖的超高速离心瓶，Nalgene（ ThermoFisher ，Fisher Scientific，目录号：3140-1006）
50 mL Oak Ridge 高速聚碳酸酯离心管，带密封盖（ ThermoFisher ，Fisher Scientific，目录号：3138-0050PK）
10 mL血清移液管，无菌（Sigma-Aldrich，目录号：CLS4488-50EA）
50 mL无菌离心管（Corning，Sigma-Aldrich，目录号：CLS430290）
0.45 μm注射器过滤器，尼龙（Fisher Scientific，目录号：15131499）
20 mL 塑料注射器（Fisher Scientific，目录号：15889152）
500 毫升玻璃烧杯
4升玻璃烧杯
磁力搅拌棒
透析夹
透析管， Biodesign TM纤维素透析管卷，8000 Da MWCO（Fisher Scientific，目录号：12707486），在 4°C 下储存
Amicon Ultra-15 离心过滤器，50 kDa MWCO（Merck Millipore，Sigma-Aldrich，目录号：UFC9050）
200 μL PCR管（Sigma-Aldrich，目录号：BR781301）
液氮 (LN 2 )
来自鸡蛋清的溶菌酶（~ 70,000 U/mg）（Sigma-Aldrich，目录号：62971），储存于 4°C
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25），储存在-20°C
氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：10053023）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I2399）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
螯合琼脂糖快速流动（Sigma-Aldrich，目录号：GE17-0575-01），储存在 4 – 30°C
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
硫酸镍六水合物（NiSO 4 · 6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：227676）
乙酸钠（C 2 H 3 NaO 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
乙酸（CH 3 COOH）（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
裂解缓冲液（见配方）
缓冲区 A（见配方）
缓冲液 B（见配方）
透析缓冲液（见配方）
凝胶过滤缓冲液（参见配方）

ALDH Tt酶检测
塑料比色皿， Fisherbrand Macrocuvettes （Fisher Scientific，目录号：FB55923）
己醛（Sigma-Aldrich，目录号：115606）
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐（NAD + ）（Sigma-Aldrich，目录号：N0632），储存于-20°C
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）

设备

生物安全柜
高压釜
实验室天平
水浴
Corning ® 5 × 7 英寸顶部 PC-420D 带数字显示屏的搅拌热板，120V/60Hz（Corning，目录号：6795-420D）
摇动培养箱（Eppendorf，New Brunswick Scientific Inova 40，Sigma-Aldrich，目录号：EPM1299-0094）
-80°C 冰箱，New Brunswisk Scientific 超低温冰箱
大型离心机（ThermoFisher Scientific Sorvall RC6+ Centrifuge，Fisher Scientific，目录号：12121680）
ThermoFisher Scientific，Heraeus Megafuge 16R 离心机（ThermoFisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：75004230）
VWR Microstar12 微型离心机（VWR，目录号：521-1651）
探头超声仪（Bandelin Sonoplus HD 2200，目录号：2531）
蠕动泵 P-1（Cytivia Life Sciences，目录号：18111091）
ÄKTAprime plus（Cytiva 生命科学）
XK16色谱柱（Sigma-Aldrich，目录号：GE28-9889-37）
HiLoad 16/60 superdex 200 pg凝胶过滤柱（Cytiva，Sigma-Aldrich，目录号：GE28-9893-36）
NanoDrop TM ND-1000（ThermoFisher Scientific，目录号：ND-ONE-W）
SDS-PAGE 仪器（Biorad Mini-PROTEAN Tetra Cell，目录号：1658005EDU）
配备温度控制器（TC-1 温度控制器）（Quantum Northwest，目录号：TC 1-MAN-2.2）的 Cary 60 紫外可见分光光度计（Agilent）
pH计，Thermo Scientific Orion 2星台式pH计（Fisher Scientific，目录号：Meter Kit 1111001）

程序

蛋白质表达
转化：转化构建体 DNA pET-22b(+)- ALDH Tt (Hayes et al. , 2018)进入大肠杆菌BL21(DE3) 化学感受态细胞，通过标准热激在 42°C 的水浴中持续 30 秒。将产生的转化铺板在补充有 100 μg /mL 氨苄青霉素的琼脂板上，并在 37°C 下生长过夜。
预培养：用转化板中的一个菌落接种10 mL 补充有 100 μg /mL 氨苄青霉素的 LB 肉汤，并在 250 rpm 和 37°C 下搅拌孵育 16 h。
主要培养物：接种 1 L ZYP -5052 自诱导培养基（参见以下配方），添加 50 μg /mL 氨苄青霉素和 10 mL 预培养物（1% v/v），并在 200 rpm 和 25°C 下搅拌孵育48 小时。
笔记：用于表达的主要培养物是分开的，以便在 2-L 摇瓶中不超过 500 mL，用于通气目的。

蛋白质纯化
将大肠杆菌细胞转移到 1 L 离心瓶中，并在 6,000 × g和4°C 下离心 15 分钟以收获细胞。
注意：在细胞收集之前，称量空离心瓶，以便在离心后确定细胞质量。
丢弃上清液，并对废物进行高压灭菌。
称量细胞颗粒（通常为 ±35 g/L 培养物）。
μg /mL DNase I 和 200 mM MgCl 2补充裂解缓冲液。将颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中（参见下面的配方），每 1 g 细胞加入 5 mL 裂解缓冲液。
注意：使用 10 mL 血清移液管在冰上进行细胞重悬，以上下吸取缓冲细胞悬液。如果在室温下进行，则应及时进行，因为天然细胞蛋白酶可能会降解所需的蛋白质。
将细胞裂解物以 50 mL 的等分试样储存在 -80°C 的 Falcon 管中过夜。
注意：细胞裂解液在 -80°C 下的过夜储存可延长至 1 周。
在 37°C 的水浴中解冻细胞裂解物。
功率设置在60-70 %之间的探头声波器对细胞进行声波处理（超声波标称输出最大为 200 W）。声波处理 30 s，休息 30 s，并重复此过程 3 次。
注意：超声处理是在 4°C 的冷室中进行的，细胞裂解液被冰包围。
在水浴中将细胞裂解物加热至 65°C 15 分钟。省略此步骤会导致蛋白质产量降低约 40%。
× g和 4°C 下离心 30 分钟收集细胞碎片。除去含有ALDH Tt的上清液，并储存在冰上。在处置前对收集的细胞进行高压灭菌。
注意：在离心 30 分钟以收集含有ALDH Tt的可溶性部分后，应在离心机停止后立即收集样品，以确保细胞不会重新进入溶液。
通过 0.45 μm尼龙注射器过滤器过滤收集的可溶性部分，并储存在冰上的 50 mL Falcon 管中。保留 1 mL 的样品用于 SDS-PAGE 和西方印迹分析。
用大约 10 mL 的螯合 Sepharose 快速流动树脂填充 XK 16/20 色谱柱，并按如下方式进行预平衡。使用蠕动泵，以 1 – 3 mL/min的速率将以下数量的缓冲液输送到柱中：0.5 柱体积 (CV) 的 0.2 M EDTA、0.5 M NaCl、pH 7、2 CV 的 0.5 M NaCl 、2 CV MilliQ水、0.2 CV 0.2 M NiSO 4 、5 CV MilliQ水、5 CV 20 mM 乙酸钠、0.5 M NaCl pH 4，最后是 2 CV 缓冲液 A（参见下面的配方）。
将整个过滤的可溶性部分（从 1 L 培养物中大约 80-100 mL）加载到 Ni 亲和柱上。在装载过程中将溶液保持在冰上。收集用于 SDS-PAGE 和西方印迹分析的流量。
将色谱柱连接到Akta Prime 系统，并开始 IMAC 纯化。
以 3 mL/min 的速度用缓冲液 A 清洗色谱柱，直至达到稳定（接近于零）的 Abs 280nm 。
使用缓冲液 A 和缓冲液 B 的组合，通过 50、100、200 和 500 mM 的咪唑阶梯梯度（图 1）以 3 mL/min 的速度洗脱蛋白质（参见下面的食谱）。仅当从先前浓度获得的 Abs 280nm稳定时，才增加缓冲液 B 的浓度，从而增加咪唑。从每个洗脱中收集一部分用于 SDS-PAGE 和西方印迹。
注意： ALDH Tt应从 200 mM 咪唑馏分中的镍亲和色谱中洗脱。

图 1. ALDH Tt通过 Ni 亲和色谱的洗脱曲线。
色谱图显示使用 50–500 mM的咪唑阶梯梯度通过 Ni 亲和色谱纯化ALDH Tt 。大肠杆菌宿主蛋白在前两个峰中从 10-50 mM 咪唑中洗脱，而ALDH Tt在第三个峰中在 200 mM 咪唑中洗脱。

图 2. ALDH Tt表达和纯化样品的 SDS-PAGE。
泳道 1： PageRuler预染色蛋白阶梯 ( ThermoFisher Scientific)，泳道 2：表达ALDH Tt的大肠杆菌BL21(DE3) 细胞裂解物，泳道 3：Ni 亲和层析 200 mM 咪唑洗脱，泳道 4：纯化的ALDH Tt 在凝胶过滤色谱之后，泳道 5：Ni 亲和色谱流过（改编自 Shortall等人，2021）。

取含有ALDH Tt （通常为 30 – 40 mL）的馏分，并用4 L 的透析缓冲液进行透析（参见下面的食谱）。在 4°C 下用温和的磁力搅拌透析过夜。
Amicon Ultra-15 离心过滤器、50 kDa MWCO (Merck Millipore) 以 3,500 × g浓缩蛋白质样品使用 5 分钟旋转，直到获得大约 1 mL 的体积（包含大约 15 – 20 mg/mL）。
凝胶过滤色谱：以 1 mL/min 的速度预平衡HiLoad 16/60 Superdex 200 pg柱与 2 CV (240 mL) 凝胶过滤缓冲液（参见下面的配方）。使用Akta Prime 系统上的注射回路将大约 1 mL 的浓缩ALDH Tt蛋白质样品加载到色谱柱上，并以 1 mL/min 的速度运行 120 分钟，并收集蛋白质峰。
注意： ALDH Tt应该在大约 65 mL时开始从凝胶过滤色谱中洗脱。凝胶过滤色谱图上应该只有一个峰。峰开始处（左侧）可能会出现轻微的肩部，但不应收集。
将凝胶过滤色谱（约 20 mL）的级分合并，并使用Amicon Ultra-15 离心过滤器、50 kDa MWCO（Merck Millipore）浓缩至 25–30 mg/mL（或根据需要），在 3,500 × g下使用 5 分钟旋转，直到获得所需的浓度。
NanoDrop TM 1000 分光光度计上，使用 1671 M -1 cm -1的序列衍生消光系数，通过280 nm 处的紫外吸光度监测蛋白质浓度。使用凝胶过滤缓冲液作为空白。
准备 30-μL 等分试样，在液氮 (LN 2 ) 中快速冷冻，并储存在 -80°C 直至进一步使用。如果要立即使用蛋白质，则根据需要等分，并储存在冰上直至进一步使用。

ALDH Tt酶检测
在 10 mM 磷酸钾 pH 8 中，使用己醛作为底物 (2 mM) 和 NAD +作为辅因子 (2 mM)测定ALDH Tt 。
注意：己醛仅微溶于水，因此应准备低浓度的储备溶液。在水中的溶解度约为 6 g/L (60 mM)。在缓冲液中制备的己醛溶液的保质期为一周。
对配备温度控制器的分光光度计进行编程，在 340 nm 和 50°C 下分析 2 分钟。添加 1 分钟的预平衡步骤，以确保所有溶液保持在 50°C。使用 2 分钟的短分析时间来避免挥发性醛底物因蒸发而损失。
加热 5 mM 己醛、10 mM NAD +和 10 mM 磷酸钾 pH 8 至 50°C 的溶液。
ALDH Tt的酶活性可以在 20–50°C 下进行分析。然而，随着温度降低，观察到酶活性降低。
在冰上解冻 30 μL 的ALDH Tt等分试样。
稀释ALDH Tt以获得 0.38 mg/mL 的浓度，并以 4，050 × g离心5 分钟。
注意：应使用凝胶过滤缓冲液将ALDH Tt稀释至 0.38 mg/mL 的浓度进行酶测定。例如，通过将 10 μL的ALDH Tt添加到 690 μL的凝胶过滤缓冲液中，可以在 26.65 mg/mL 的储备浓度下进行1:70 的ALDH Tt稀释。
在塑料比色皿中，加入 360 μL的 10 mM NAD + 、680 μL的 10 mM 磷酸钾 pH 8 和 40 μL的ALDH Tt ，浓度为 0.38 mg/ mL。将比色皿插入分光光度计中，在 50°C 下平衡 1 分钟。
加入 720 μL的 5 mM 己醛并轻轻混合。监测 340 nm 的吸光度 2 分钟，以产生 NADH。
注： ALDH Tt的酶促测定在 50°C 下监测时，应导致 340 nm 处的吸光度增加（正斜率）（图 3）。
使用比尔-朗伯定律计算酶活性，使用 NADH 在 340 nm 处的 6,220 M -1 cm -1消光系数（方程式 1）。

" U " 〖"mg" 〗^"-1" "= " ("slope × " 〖"10" 〗^"6" " × vol" )/("6220 " "M" ^"-1" 〖"cm" 〗^"-1 " "× l × mg of " 〖"ALDH" 〗_"Tt" ) " Equation 1"

注意：一个酶单位等于 1 µmol/min NADH 的产量。 l 等于比色皿的路径长度，在这种情况下 l = 1 cm。 Vol 等于比色皿的体积，在这种情况下 vol = 1.8 mL。

+进行ALDH Tt测定的原理，通过 NADH 的出现通过分光光度法监测活性。展示了使用的比色皿示例和获得的结果。

数据分析

上述表达、纯化和酶活性分析的原始研究文章发表于 Shortall等人。（2021 年）， https://doi.org/10.3390/cells10123535 。

食谱

注意：所有溶液均使用MilliQ水 (18.2 MΩ cm) 制备。

中源传媒
10%色度
5% 酵母提取物
20 × NPS（NPS= 100 mM PO 4 、25 mM SO 4 、50 mM NH 4 、100 mM Na、50 mM K）
0.5 M (NH 4 ) 2 SO 4
1 M KH 2 PO 4
1 M Na 2 HPO 4
50 × 5052（5052 = 0.5% 甘油、0.05% 葡萄糖、0.2% α-乳糖）
25% 甘油
2.5% 葡萄糖
10% α-乳糖
注意：50 × 5052 的制备可以通过磁力搅拌温和加热来辅助。 50 × 5052 可能难以溶解，在所有组分溶解之前不应高压灭菌。如果高压灭菌后溶液明显呈褐色，则应重新制备。
1M MgSO 4
ZYP-5052 自感应介质
~928 mL ZY 培养基
1 mL 1 M MgSO 4
20 毫升 50 × 5052
50 mL 的 20 × NPS
50微克/毫升氨苄青霉素
注意：ZYP-5052 自感应培养基的溶液单独制备和高压灭菌。这些结合起来，使媒体在当天表达文化。
裂解缓冲液
20 mM Tris-HCl pH 7.5
5 mM β-巯基乙醇
10 毫米咪唑
500 毫米氯化钠
缓冲器 A
20 mM Tris-HCl pH 7.5
5 mM β-巯基乙醇
10 毫米咪唑
200 毫米氯化钠
缓冲器 B
20 mM Tris-HCl pH 7.5
5 mM β -巯基乙醇
1M咪唑
200 毫米氯化钠
透析缓冲液
50 mM Tris-HCl pH 7.5
5 mM β-巯基乙醇
250 毫米氯化钠
凝胶过滤缓冲液
50 mM Tris-HCl pH 7.5
5 mM β-巯基乙醇
150 毫米氯化钠

致谢

该协议是 Shortall等人描述的协议的扩展。 (2021) 并改编自 Hayes等人。（2018 年）。这项研究由欧盟的 Horizon 2020 研究和创新计划Oyster（开放表征和建模环境，以推动先进纳米架构和仿生硬/软接口的创新）根据第 760827 号赠款协议资助。资金也来自利默里克大学化学科学系和爱尔兰高等教育局。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

Hayes, K., Noor, M., Djeghader , A., Armshaw , P., Pembroke, T., Tofail , S. 和Soulimane , T. (2018)。嗜热栖热菌醛脱氢酶的四级结构通过进化上独特的 C 末端臂延伸来稳定。科学代表8（1）：1-14。
Lyons, JA, Aragão , D., Slattery, O., Pisliakov , AV, Soulimane , T. 和 Caffrey, M. (2012)。 caa 3 型细胞色素氧化酶中电子转移的结构见解。自然487（7408）：514-518。
Robin, S.、Arese, M.、Forte, E.、 Sarti , P.、Giuffre, A. 和Soulimane , T. (2011)。嗜热栖热菌的亚硫酸盐呼吸途径和新发现的细胞色素 c 550的关键作用。细菌杂志193（15）：3988-3997 。
Shortall, K., Durack, E., Magner, E. 和Soulimane , T. (2021)。来自嗜热栖热菌的 ALDH 的研究 -表现出脱氢酶和酯酶活性的非底物特异性嗜热酶的表达、纯化和表征。单元格10（12）：3535。
苏里曼，T. (2010)。嗜热栖热菌编码一种类似古菌的果糖-1,6-双磷酸酶：纯化天然和重组蛋白用于结构研究。蛋白质表达纯化74(2)：175-180 。