材料和试剂
受体结合结构域的产生
向量构造
用 KpnI/PmeI 消化的 pOPINTTG 载体（图 1A）
人类密码子优化的合成 RBD 基因（编码氨基酸 330 – 352）具有 15 bp 延伸与 pOPINTTG 融合进入位点重叠（小写）：
5'gcgtagctgaaaccggcCCGAATATCACAAATCTTTGTCCTTTCGGAGAAGTATTCAACGCAACTCGCTTCGCATCAGTATATGCCTGGAACCGCAAACGAATTTCTAATTGTGTCGCCGACTACTCTGTGCTTTACAACTCAGCATCATTTTCAACATTCAAATGCTATGGTGTCTCCCCTACGAAGTTGAACGATCTTTGTTTCACTAATGTCTACGCCGATTCCTTTGTTATTAGGGGGGACGAGGTTCGCCAGATCGCGCCGGGCCAAACGGGCAAGATAGCTGACTATAATTATAAGCTGCCAGACGACTTTACAGGCTGCGTTATCGCTTGGAATTCAAACAATCTTGATAGCAAAGTGGGTGGTAATTATAACTACCTCTACAGACTGTTTCGCAAGTCTAATCTGAAGCCTTTCGAGCGGGACATCTCTACTGAGATCTATCAAGCTGGTTCAACCCCCTGCAATGGCGTCGAGGGTTTTAACTGTTACTTCCCACTTCAGTCATACGGATTTCAACCAACTAATGGGGTTGGCTATCAGCCGTACCGCGTGGTCGTTCTTAGCTTTGAGCTGCTTCACGCCCCTGCAACGGTGTGCGGACCGAAAAAAAGTACAAAaaacatcaccatcac 3'
ClonExpress II One Step Cloning 试剂盒（Vazyme，目录号：C113-02）
NucleoSpin 148 ® Gel and PCR Clean-up kit（MACHEREY-NAGEL，目录号：12303368）
恒星感受态细胞（Takara Bio，目录号：636766）
LB培养基（Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
SOC（具有分解代谢物抑制的超级最佳肉汤）恢复培养基（ThermoFisher Scientific，目录号：15544034）
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9393）
LB-琼脂板添加 100 μg /mL 氨苄青霉素
质粒小量制备试剂盒（例如，Qiagen，目录号：27104）
Plasmid Plus Midi 试剂盒（例如，Qiagen，目录号：12941）
测序引物：pTTfwd 5' TCCACAGGTGTCCACTCC 3'
pTTrev 5' TCCTTTATTAGCCAGAGG 3'

expi293 TM细胞中的表达
500 mL 带通风封口的无菌挡板烧瓶（ThermoFisher Scientific，目录号：4116-0500）
Countess TM细胞计数室载玻片（ThermoFisher Scientific，目录号：C10228）
Expi293 TM电池（ThermoFisher Scientific，目录号：A14527）
Expi293 TM表达培养基（ThermoFisher Scientific，目录号：A1435101）
台盼蓝溶液（ThermoFisher Scientific，目录号：15250061）
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（10 × ）（ThermoFisher Scientific，目录号：14185052）
Gibco OPTI-MEM 减少血清培养基（ThermoFisher Scientific，目录号：31985062）
丙戊酸（Sigma-Aldrich，目录号：P4543）
葡萄糖（45％溶液）（参见配方或来自Sigma-Aldrich，目录号：G8769）
丙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P1880）
PEI MAX 40 K（Polysciences Inc.，目录号：24,765-1）
Kifunensine（Sigma-Aldrich，目录号：K1140）
预制 SDS 聚丙烯酰胺凝胶（例如，NuPAGE TM 10%，Bis-Tris ThermoFisher Scientific ，目录号 WG1201A）
InstantBlue ®考马斯蛋白染色剂（Abcam，目录号：ab119211）
RBD纯化
5 ml HisTrap_FF Ni-NTA 柱（Cytiva，目录号：1752860）
SD75 16/600 尺寸排除柱（Cytiva，目录号：28989333）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I2399）
PBS，磷酸盐缓冲盐水，10 ×溶液（Fisher，目录号：BP399-20）
洗涤缓冲液（见配方）
洗脱缓冲液（参见配方）
凝胶过滤缓冲液（参见配方）

VHH 生产
向量构造
用 SfiI 切割的 pADL-23c 载体（图 1B）（New England Biolabs，目录号： R0123S）
输液引物：
VHH Fwd 引物 5' GTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC 3'
VHH Rev 引物 5' GGTGATGGTGTTGGCCTTTATTAATGATGGTGGTGATGGTG 3'
校对聚合酶（例如，PhusionFlash TM高保真聚合酶 ThermoFisher Scientific，目录号：F548S）
pADL-23c 测序引物：PhdseqFwd 5' GCTTCCGGCTCGTATGTTG 3'
PhDseqRev 5' GTCGTCTTTCCAGACGTTAG 3'
2 mL 冷冻管（例如ThermoFisher Scientific，目录号：5000-0020 ）
大肠杆菌表达
WK6 细胞大肠杆菌（Migula）Castellani 和 Chalmers（ATCC，目录号：47078）
极好的肉汤（TB）培养基（见食谱）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，IPTG（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）
葡萄糖
氯化镁
氨苄青霉素
VHH 纯化
TES 缓冲液（见配方）
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号： D4263)
氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号： M8266)
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）

图 1. 矢量图 (A) pOPINTTGneo (B) pADL-23c

VHH-RBD 复合物的结晶

VHH-RBD复合物的制备
EndoH（New England Biolabs，目录号：P0702S）
SD200 10/300 尺寸排除柱（Cytiva，目录号：28990944）
结晶筛选
Swisssci Triple-Drop 结晶板（Molecular Dimensions，目录号： MD11-003-100）
无盖 V 孔微孔板，天然，聚丙烯（Greiner，目录号：651201 96）
VIEWseal TM板密封剂，透明，不可刺穿的 Greiner，目录号：676070）
Pact Premier TM结晶筛选条件（Molecular Dimension，目录号： MDSR-29）
JCSG-plus TM结晶筛选条件（Molecular Dimensions，目录号：MDSR-37）
SG1 TM结晶条件（Molecular Dimensions，目录号： MDSR-88 ）
晶体的冷冻保存
甘油（分子尺寸，目录号： MD2-100-65 ）
PEG 400（Sigma-Aldrich，目录号：06855）
安装的圆形LithoLoops（0.25 mm）（分子尺寸，目录号： MD7-137 ）
安装的圆形 LithoLoops（0.15 毫米）（分子尺寸目录号：MD7-135）
标准泡沫杜瓦瓶（分子尺寸，目录号：MD7-35）
Uni-Puck 10 Pack（分子尺寸，目录号：MD7-613）
Cryotool 套件（Molecular Dimensions，目录号：MD7-517）
Dry Shipper（分子尺寸，目录号：MD7-21）

设备
微量分光光度计（例如，ThermoFisher Scientific、NanoDrop TM One/OneC 微量紫外-可见分光光度计：ND-ONE-W）
CO 2轨道摇床（例如，n-Biotek.com ANICELL 培养箱，目录号：NB-206CXL/NB）
适用于 50 mL Falcon 管的台式离心机（Sorvall Legend RT Plus）
细胞计数器（例如，ThermoFisher Scientific Countess TM 3 自动细胞计数器）
ÄKTA Xpress 自动化多步纯化系统
液体处理器（例如，Art Robbins Instruments 的 Hydra Dispenser）
用于结晶板的小容量分配器（例如，SPT labtech 蚊子® LV）
晶体板成像仪（例如，Formulatrix RockImager ®系统）

程序

受体结合结构域的产生

向量构造
对于 10 μL的融合反应，混合 20 ng (1-3 μL) 合成基因、100 ng (1-2 μL) PmeI/NcoI cut pOPINTTG 载体、1 μL Exnase II和 2克隆试剂盒随附的 μL 优化缓冲液。
将反应在 37 °C 下孵育30 分钟，然后立即停止，加入 20 μL冰冷的 TE 缓冲液。
使用 5 μL所得反应混合物转化 20 μL Stellar 感受态细胞，在冰上孵育 30 分钟，然后在 42 °C 下热休克45 秒。
加入 400 μL的 SOC 培养基并在 37 °C下孵育45 分钟。
100 μ L 的细胞和培养基混合物放在 LB 琼脂板上，辅以 100 μ g/mL 氨苄青霉素，并在 37 °C 下培养过夜。
将单个菌落挑入含有 100 μg /mL 氨苄青霉素的 3 mL LB 中，并在 37 °C下孵育过夜。
通过将 0.5 mL 的 50% (v/v) 无菌甘油添加到 2 mL 冷冻管中 LB 中细胞的 0.5 mL 过夜培养物中，并在 -80 °C 下冷冻，生产甘油库存。
从沉淀的细胞中制备 DNA，并通过使用 pTTfwd 和 PTTrev 引物对小量制备 DNA 进行测序来确认正确的克隆。
使用 50% 甘油原液培养更大规模的培养物，用于转染级质粒制备。
转染级质粒（0.5-1 mg ），如果需要，将质粒储存在 -20 °C的无菌 1.5 mL Eppendorf 管中。
使用 NanoDrop 分光光度计测量 DNA 的纯度和浓度。用于转染的质粒 DNA 应该是高纯度的（见注 1）。
DNA 的浓度和纯度由仪器使用以下等式自动计算：
浓度：DNA (µg/mL) = (A 260读数 – A 320读数) × 稀释倍数 × 50 µg/mL
纯度：（A 260 /A 280 ）=（A 260读数 - A 320读数）÷（A 280读数 - A 320读数）
每百万个转染细胞使用 1 μ g DNA。
转染方案
Expi293 TM细胞在加湿 (80%) 培养箱中解冻后保持悬浮培养至少 3 代（3-30 代可用于实验），5-8% CO 2 ，37 °C ，开在 Gibco Expi293 TM Express 培养基中以 120 rpm 的转速摇床，细胞密度在 0.5 和 5.0 × 10 6 个细胞/mL 之间。使用 125 mL 烧瓶来维持 30 mL 的 Expi293 细胞。
转染前一天，以 1 × 10 6 个细胞/mL的细胞密度接种 Expi293 TM细胞。对于 RBD 的每次制备，在 500 mL 烧瓶中设置三个 170 mL 的培养物。
在转染当天，确定细胞计数和存活率，如果细胞计数在 2 × 10 6 –2.5 × 10 6 /mL 之间且存活率至少为 95%，则继续转染（见注 2）。
对于每个 170 mL 培养物，将 17 mL OPTI-MEM 培养基与 170 μg质粒 DNA 和 918 μL PEI Max 40kDa 转染试剂混合在 50 mL Falcon 管中。
彻底混合，在室温 (RT) 下孵育 10 分钟，然后轻轻（逐滴）加入 Expi293 TM细胞（见注 3）。
从 1 mg/mL 的原液浓度（每 100 mL 培养体积 100 μL）中添加 kifunensine ，并在125 rpm、5 – 8% CO 2 、80% 湿度和 37 °下将细胞返回到轨道振荡器上孵育C. _
16-18 小时后，在每 170 mL培养物中加入 2,890 μL丙戊酸、1,100 μL丙酸钠和 3,400 μL葡萄糖。将培养物送回培养箱（见注 4）。
在转染后第 5 天，确定细胞计数和活力。
收获培养基，在 0.5-L 离心瓶中以 6,000 × g离心20 分钟。使用 0.45 μ m 0.5-L 瓶顶过滤器进行过滤消毒。
纯化
IMAC-SEC 纯化方案适用于 ÄKTA Xpress 平台，使用 Nettleship等人中描述的程序。（2009 年）。相同的工作流程可以在其他具有自动峰检测的纯化系统上实施。独角兽计划的成绩单作为附录提供。
使用“凝胶过滤平衡”程序和凝胶过滤缓冲液（20 mM Tris，pH 7.5，200 mM NaCl）平衡凝胶过滤柱。
按照“哺乳动物准备系统”的方法设置系统。它将泵清洗 A1 和 A2，并清洁入口。然后它会要求您将 5-mL 色谱柱拧入位置 1，并平衡色谱柱。
在过滤后的细胞上清液中加入等体积的 PBS，用 NaOH 调节 pH 至 7.4。
插入色谱柱并准备好上样后，从缓冲液中缓慢取出 A2 管线（通过小幅度移动以避免管线中出现气泡），然后将其插入样品中。确保所有的线条都在瓶子的底部。
让协议在一夜之间运行。
使用来自 ÄKTA 的迹线，选择包含目标蛋白质的正确级分。将 10 μL 的蛋白质溶液与 10 μL 的样品缓冲液混合，并在 95 °C 下加热5 分钟。运行样品的 SDS-PAGE 凝胶，并使用 Instant Blue ®对其进行染色。
使用 10 kDa 浓缩离心机在 2,500 × g和 4 °C 下将蛋白质浓缩至 5 mg/mL 。
分装（例如，0.1 mL）并通过将试管插入液氮中快速冷冻蛋白质。
储存在 -80 °C 。

生产 VHH

向量构造
通过筛选 M13 噬菌体展示文库鉴定的 VHH 被重新表达用于蛋白质生产。
VHH Fwd 引物和 VHH Rev 引物以及以下 PCR 条件从源展示载体中扩增 VHH：
1) 98°C 10 秒
2) 30 个循环：
98°C 1 秒
60°C 5 秒
72°C 15 秒
3) 72°C 2 分钟
4) 4°C 保持
根据制造商的说明使用 Nucleospin ®试剂盒进行提取。如克隆 RBD 所述，将PCR 产物克隆到SfiI 切割的 pADL-23c 载体中。
通过使用 PhDseqFwd 和 PhDseqRev 引物测序来验证克隆。
在大肠杆菌中的表达
如上所述转化化学感受态 WK6 细胞，用于构建 RBD 表达载体。
从转化细胞板中挑选一个菌落，并设置预培养：8 mL 的 TB 辅以 100 μg/mL 氨苄青霉素、2% 葡萄糖和 1 mM MgCl 2。
设置培养：在 2-L 烧瓶中加入 800 mL 的 TB 培养基，辅以 100 μg/mL 氨苄青霉素、0.1% 葡萄糖和 1 mM MgCl 2。
将烧瓶/培养基预热至 37 °C 。
°C的轨道摇床上添加预培养和培养培养。
600达到 ±1.2（通常需要大约 3.5 小时）时，将 IPTG 添加到 1 mM 的最终浓度，并在 225 rpm 和 28 °C下继续生长过夜。
在 4 °C 下以 2,500 × g将细胞沉淀 15分钟。
VHH 的纯化
将 15 mL 的 TES 缓冲液添加到细胞颗粒中，并在 4 °C 下用磁力搅拌器缓慢重新悬浮在瓶子中过夜。
第二天，在重悬培养物中加入两倍体积的冷TES/4 缓冲液，辅以 120U Kunitz DNaseI，缓慢搅拌 2 小时。
使用 TES/4 缓冲液最多加注 80 mL。
以 28,000 × g离心沉淀和 4 °C 30 分钟（在 50 mL 管中）。
在真空下通过 0.8 μm 过滤器过滤上清液。
用五倍体积的 PBS (pH 7.4) 稀释上清液，并充分混合。
将样品加载到两个串联的 5 mL IMAC 柱上，速度 <2 mL/min。
用含有 30 mM 咪唑的 PBS (pH 7.4) 清洗柱子。
用含有 300 mM 咪唑的 PBS 以 1 mL/min 的速度将样品洗脱到 96 孔收集板中，收集 1 mL 分数。
池 A 280个峰值分数（约 7.5 mL）并在凝胶过滤缓冲液（50 mM Tris pH 7、150 mM NaCl）中的 Superdex S75 16/600上运行。
汇集 A 280个峰值蛋白质组分，并使用 5 kDa MWCO 浓缩器浓缩，通常浓缩至 15 mg/mL（见注 5）。
分装（例如，0.1 mL）并通过将试管插入液氮中快速冷冻蛋白质。
储存在 -80 °C 。

VHH-RBD 复合物的结晶

VHH:RBD 复合物的制备
将 5 mg RBD (5 mg/mL) 与 3 mg VHH (15 mg/mL) 以 RBD:VHH 为 1:1.2 的摩尔比混合，并在冷藏室中以 2 rpm 搅拌孵育 3 小时（见注 6）。
将 RBD-VHH 复合物与 0.4 mg EndoH 糖苷酶 (1 mg/mL) 在室温下以 2 rpm 搅拌过夜（见注 7）。
使用 5 kDa MWCO 浓缩器将混合物浓缩至 1 mL，并注入凝胶过滤缓冲液（50 mM Tris pH 7、150 mM NaCl）中的 Superdex 200 10/300。
器监测 A 280 、汇集峰级分并浓缩至 20 mg/mL（参见图 2 和 3）。

SD200 20/300 尺寸排阻柱(CV 23.56 mL)上纯化 VHH-RBD 复合物。

图3. RBD（泳道 1）、VHH（泳道 2）和 RBD-VHH 复合物凝胶过滤部分的SDS页，用糖苷内切酶 HH 处理后（泳道 3-12）。

结晶筛选
25 μ L 的结晶溶液从 96 孔母块中分配到 Swisssci 晶体板的储液孔中。
将蛋白质溶液移液到 V 井微孔板中的一列中。
设置一个包含 288 滴的坐式滴板，使用机器人液体处理器 (Mosquito)，使用三种蛋白质：水库比率（100 nL 蛋白质 + 100 nL 水库；200 nL 蛋白质 + 100 nL 水库；100 nL 蛋白质 + 200 nL 水库）（见注 8)。
使用 VIEWseal 密封完成的板。
° C下，在 Formulatrix 成像仪中按斐波那契计划对板进行成像和存储（请参见图 4 中的晶体示例）。
在选定的水晶滴上切出一个正方形的密封，然后打开滴。
将 1 μ L 冷冻保护剂混合物（原始结晶条件下的 30% 甘油或 Peg 400）添加到晶体/滴上。表 1 给出了结晶 VHH-RBD 复合物的例子。
将安装销放在磁棒上，从水滴中循环晶体，然后迅速放入含有液氮的泡沫杜瓦瓶中。
将安装的水晶存放在泡沫杜瓦瓶内的冰球中。
将冰球转移到液氮预冷的干式运输机中。

表 1. 结晶 VHH-RBD 配合物的示例，详细说明了结晶条件、空间群和生成的晶体的分辨率限制。

复杂的 RBD-F2 RBD-H3-C1 RBD-C5
水晶屏风契约TM JCSG TM SG1 TM
结晶条件 0.1 M SPG，pH 8，25% Peg 1500 1.0 M 氯化锂、0.1 M 柠檬酸盐 pH 4、20% Peg 6000 0.2 M 醋酸钠、0.1 M 二甲胂酸钠 pH 6.5 和 30% w/v PEG 8000
晶体形成时间 3天少于 24 小时 3天最佳生长
比率 0.2 μ L 蛋白质和 0.1 μ L 储液罐 0.2 μ L 蛋白质和 0.1 μ L 储液罐 0.1 μ L 蛋白质和 0.1 μ L 水库
浓度 34 毫克/毫升 18 毫克/毫升 18 毫克/毫升
冷冻保护剂甘油 PEG400 甘油
数据采集
接触 0.006s 0.012s 0.008s
空间群 P31 P41212 P21212
分辨率 ( Å) 2.3 1.9 1.5

图 4. 不同配合物的晶体形状：RBD-F2（左）、RBD-H3-C1（中）和 RBD-C5（右）。
笔记

具有最少蛋白质和化学污染的优质 DNA 的吸光度比应为 260/280 介于 1.8 – 2.0 之间，以及 260/230 介于 2.0–2.2 之间。
我们的方案适用于任何规模的表达：1 – 3 mL 板实验和 30 – 300 mL 在烧瓶中的放大表达。 Scale 提供与转染细胞体积成比例的试剂体积和数量。
不要直接混合 DNA 和 PEI，因为它们会立即沉淀。
丙戊酸、丙酸钠（组蛋白脱乙酰酶抑制剂）和葡萄糖饲料的组合使用有助于显着增强基因表达。
重要的是要定期检查在浓缩步骤期间没有 VHH 沉淀，如果观察到这种情况，则停止进一步浓缩蛋白质。任何沉淀物都可以通过在微量离心机中以 12,000 × g离心10 分钟来去除。然后通过 280 nm 处的吸光度测量最终蛋白质浓度。
添加摩尔过量的 VHH，以确保 RBD 与纳米抗体完全复合。
EndoH 在 pH ~5.2 时具有最高效率。然而，由于大多数蛋白质在此 pH 值下不稳定，因此反应在 pH 值 7.5 下进行。此外，许多蛋白质在 37°C 下长时间不稳定，因此反应首选 RT。 EndoH 在 RT 和 pH 7.5 时具有活性，但反应时间比在最佳条件下运行时要长。
两种稀疏矩阵筛选（JCSG+ 和 SG1）通常以两种不同的浓度（通常为 34 mg/mL 和 18 mg/mL）以三种不同的比率进行筛选。对于配合物 RBD-F2 和 RBD-H3-C1，我们获得了许多结晶命中，而对于 RBD-C5，我们只获得了一个命中。只是偶尔使用 PACT 屏幕。晶体直接从稀疏矩阵屏幕中收获，不需要进一步优化。为了获得更多具有非常细微不同衍射质量的晶体，通常使用相同的协议将相同的条件设置为蚊子上的一排。这也允许测试两种不同的低温条件（通常是甘油和 Peg 400）。晶体的重现性非常好。通常在生长后 24 小时内从所有命中中收获最干净的晶体，但对于大多数命中而言，衍射质量在此后 5 天内保持稳定。

食谱

丙戊酸
500 mg 在 10 mL 细胞培养基或 HBSS 中，过滤 0.2 μ m，并储存在 - 20 °C。

丙酸盐溶液
在 10 mL 细胞培养基或 HBSS 中加入 1 g 丙酸钠，过滤并储存在-20 °C。

裴
将 100 毫克 PEI Max 40K 悬浮在 90 毫升 MilliQ 水中。使用 PTFE 涂层搅拌棒搅拌。溶解时间应少于 5 分钟，然后使用 NaOH 或 HCl 将 pH 值调节至 7.0。加水至 100 mL，过滤 0.2 μm ， -20 °C保存。

葡萄糖
45 g 于 100 mL HBSS 或细胞培养基中，过滤 0.2 μm ， -20 °C储存。

洗涤缓冲液
PBS + 30 mM 咪唑 pH 7.4

洗脱缓冲液
PBS + 300 mM 咪唑 pH 7.4

凝胶过滤缓冲液
20 mM Tris 和 pH 7.5、200 mM NaCl 或50 mM Tris pH 7、150 mM NaCl

TES 缓冲液
200 mM Tris pH 8、0.5 mM EDTA、500 mM 蔗糖

TES/4 缓冲器
50 M Tris pH 8、125 mM 蔗糖

结核培养基
酵母提取物 (24 g/L)、胰蛋白胨 (20 g/L)、甘油 (4 mL/L)、磷酸盐缓冲液 (100 mL/L) 的 0.17 M KH 2 PO 4 、0.72 MK 2 HPO 4

致谢

这项工作得到了资助交付合作伙伴 EPSRC 罗莎琳德富兰克林研究所的支持。和罗莎琳德富兰克林研究所 EPSRC 授权号。 EP/S025243/1。 JHN、ALB 由 Wellcome Trust (100209/Z/12/Z) 提供支持。 JH 得到 EPA 头孢菌素和 Edward Penley Abraham 基金的支持。 X 射线数据是在光束线 I03、I04 和 I24 上使用钻石光源 COVID-19 快速访问时间获得的（提案 MX27031）。

利益争夺

罗莎琳德·富兰克林研究所已申请鉴定 SARS-CoV-2 刺突蛋白纳米抗体的专利； RJO、JH 和 JHN 被命名为发明人。其他作者声明没有竞争利益。

参考

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