材料和试剂
1.1.5 mL琥珀色微量离心管（ Abdos ，目录号：P10204A）
2.3 mL圆底聚苯乙烯管（Becton Dickinson，目录号：156758）
3.20 mL 1 M HEPES pH 8.0（ Himedia ，目录号：RM380-500G）
4.载玻片（ Borosil ，目录号：BT409100P02）
5.盖玻片（ Borosil ，目录号：9115S01）
6.1 mL移液器吸头（ Abdos ，目录号：P10109）
7.200 µL 移液器吸头（ Abdos ，目录号：P10140）
8.10 µL 移液器吸头（ Abdos ，目录号：P10116）
9.1 cm石英比色皿（Shimadzu，目录号：226-85010-92）
10.0.2 µm 尺寸的 Millipore 膜过滤器（Merck，目录号：GSWP04700）
11.BD FACS清洁溶液（0.1％次氯酸钠）（ Becton Dickinson ，目录号： 340345）
12.过氧化氢（Merck，目录号：1.93408.0521）
13.Milli-Q 水
14.Synechococcus elongatus PCC 7942、 Synechocystis sp.呈指数增长的培养物。 PCC 6803 和Fremyella 在补充有 20 mM HEPES (Allen, 1968)的 BG11 培养基中生长的双环管 BK14 。
注： Synechococcus elongatus PCC 7942, Synechocystis sp. PCC 6803和Fremyella dilosiphon BK14 (Kehoe and Grossman, 1996) 在补充有 20 mM HEPES 的 BG11 液体培养基中生长。从固体 BG11+20 mM HEPES 琼脂板上接种细胞。 Synechococcus elongatus PCC 7942和Synechocystis sp。 PCC 6803 在 PAR（光合有效辐射）（~80 µmol m -2 s -1 ）下生长，而Fremyella dilosiphon BK14 在红光下生长（红色 LED 荧光灯，Havells，印度）（ ~20 µmol m -2 s -1 ），在 25°C 下以 ~150 rpm 摇动。监测所有生物的生长曲线，并通过定期传代培养将培养物维持在指数期。
15.DCFH-DA（Sigma-Aldrich，目录号：D6883）
16.乙醇（Merck，目录号：1.00983.0511）
17.磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Merck，目录号：1.93622.0521）
18.磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）（Merck，目录号：1.93624.0521）
19.氯化钠（NaCl）（SRL，目录号： 41721）
20.2 mM (w/v) DCFH-DA 储备溶液 (1 mL) （参见配方）
21.0.1 M PBS pH 7.4 (100 mL) （见食谱）

设备

1.BD FACSCalibur流式细胞仪（ Becton Dickinson，目录号：342975 ）
2.UV-VIS分光光度计1800（ Shimazdu ，目录号：80626 ）
3.尼康 90i 日食荧光显微镜（日本尼康）
4.冷却离心机（印度雷米/NEYA16R）

软件

1.BD CellQuest Pro（美国 Becton Dickinson ）
2.NIS elements AR软件4.0 （日本尼康）

程序

A.FCM参数优化

1.取 50 毫升单细胞（ S. elongatus PCC 7942 和Synechocystis sp. PCC 6803）和丝状（ Fremyella dilosiphon BK14）在上述条件下生长的蓝藻（材料和试剂第 14 项）。
2.× g和 25°C下离心 10 分钟去除生长培养基，并用 0.1 M PBS 缓冲液将样品稀释至不同的 OD 750 ，即0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 和 0.8。在 1.5 mL微量离心管中使每个细胞浓度的最终体积为 1 mL 。
3.用 0.1% 次氯酸钠溶液和 Milli-Q 水清洁 BD FACSCalibur的喷嘴。
在进行实验前 10-15 分钟打开BD FACSCalibur流式细胞仪。建议定期使用 QC 微珠校准 BD FACSCalibur 。
4.CellQuest Pro 软件中绘制两个点图，即前向散射（FSC）对侧向散射（SSC）和FSC对荧光通道3（FL3）。同样，绘制荧光通道 1 (FL1) 和 FL3 的两个直方图。为所有参数设置对数比例。 FL1 和 FL3 是两个荧光通道，可检测 DCF 荧光（绿色荧光，发射范围 515 – 545 nm）和叶绿素 ( Chl ) ɑ的自发荧光（红色荧光，发射范围 >670 nm），分别。 FSC与SSC 图提供有关细胞大小、形状和粒度的信息； FSC与FL-3 图用于根据Chl ɑ自发荧光和细胞大小选择蓝藻种群。 FL-1 和 FL-3 直方图提供 DCF 和Chl的荧光强度 ɑ ，分别。
5.将步骤 2 中的样品转移到3 mL 圆底聚苯乙烯管中，以低流速（12 μL /min）采集所有样品，针对不同生物体调整 FSC、SSC、FL1 和 FL3 的 PMT 电压，如图1A。调整后的最佳 PMT 电压用于分析同一生物体的所有样品，在没有 DCFH-DA 的情况下提供来自细胞的荧光强度。在测量 DCFH-DA 处理的细胞中 DCF 的平均荧光强度以估计 ROS 水平时，排除了细胞的这种背景荧光。设置 FSC 为主要参数，FL3 为次要参数。
6.获取 50,000 – 100,000 个事件。将样本采集速率保持在 1,000 个事件/秒以下，以避免多个细胞同时暴露于激光束。
7.请注意最小 OD 750 （来自步骤 2）值，该值提供 500 – 1,000 个事件/秒之间的样本采集速率，以确定从 FCM 获得正确信号所需的每个蓝藻的适当细胞密度。

图 1. 使用 2',7'-二氯二氢荧光素-二乙酸酯 (DCFH-DA) 优化不同流式细胞术 (FCM) 参数以测量活性氧 (ROS) 水平。
用于优化流式细胞仪不同荧光通道的 PMT 电压的 FCM 直方图 (A)。测试有机体 (B) 的 DCFH-DA 浓度优化图。基于 FL3（叶绿素ɑ ）荧光和 FSC-H（相对大小）（C）的门控群体的点图。 FSC-H与SSC-H的点图分别显示了测试生物体 (D) 的相对大小和细胞复杂性。

B.DCFH-DA染料浓度的优化

1.采集 10 mL 优化 OD 750样品（参见 A 部分的步骤2-7 ）。将 100 mM H 2 O 2添加到每个样品中，并在材料和试剂部分第 14 项所述的生长条件下孵育 1 小时。
2.× g和 25°C下离心10分钟沉淀细胞，并用 10 mL 的0.1 M PBS (pH 7.4)洗涤细胞两次。
3.洗涤后，将细胞悬浮在 10 mL 的 0.1 M PBS 中，并分成 1 mL 的等分试样。
4.使用 DCFH-DA 库存溶液（材料和试剂部分的第 20 项）将不同浓度（0、10、15、20、25、30、35 和 40 μM）的 DCFH-DA 添加到 1 mL 的细胞等分试样中。
5.将细胞在黑暗中孵育 1 小时，在 25°C 下摇动约 150 转。
6.孵育 1 小时后立即使用 FCM 分析细胞。
7.清洗 FCM 并使用优化的 PMT 电压设置 BD CellQuest Pro 软件（请参阅 A 部分）。
8.以低流速 (12 μL /min) 采集样品。
9.体内检测 ROS所需的染料的最低浓度，如图 1B 所示。

C.使用 FCM检测体内ROS

1.在确定每种生物体的最佳细胞和染料浓度后（参见 A 和 B 部分），从不同的实验条件中获取蓝藻细胞。在这里，我们使用了在材料和试剂部分第 14 项中提到的条件下生长的不同蓝藻。
2.通过在 6,000 × g和 25°C 下离心 10分钟来沉淀细胞，并用 1 mL 的0.1 M PBS (pH 7.4)洗涤细胞两次。洗涤后，将细胞重新悬浮在 1 mL 的 0.1 M PBS 缓冲液中。
3.用确定浓度的染料在黑暗中摇动孵育细胞 1 小时。
4.FACSCalibur流式细胞仪的帮助下使用优化设置立即获取其中一个。如 Rastogi等人所述，使用另一等分的细胞通过荧光显微镜检测 ROS。（2010 年）（图 2）。

图 2。 Synechococcus elongatus PCC 7942, Synechocystis sp.中活性氧 (ROS) 的测量。 PCC 6803 和Fremyella 双虹吸管 BK14 使用 2',7'-二氯二氢荧光素-二乙酸酯 (DCFH-DA) 和荧光显微镜或流式细胞术 (FCM)。
二氯荧光素 (DCF) 荧光显示F. dilosiphon中光合色素 (红色) 的 ROS 水平 (绿色) 和自发荧光 BK14、 S. elongatus PCC 7942 和Synechocystis sp。 PCC 6803 (A)。来自 DCFH-DA 的仅不含细胞的样品的荧光代表阴性对照。使用×40 物镜获取图像。比例尺，5 μm 。 FCM 直方图显示了S. elongatus PCC 7942、 F. dilosiphon中二氯荧光素(DCF) 的荧光，即ROS 水平 BK14 和集胞藻属。 PCC 6803 (B)。显示来自S. elongatus PCC 7942、 F. diplosiphon的 FL1 通道的背景荧光的直方图 BK14 和集胞藻属。不带 DCFH-DA (C) 的 PCC 6803。

5.μL /min)采集至少 50000 个事件。
6.以 FCM 格式保存数据。

数据分析

1.流程图（图 3）显示了 ROS 检测所涉及的步骤（步骤 1-3；请参阅 A、B 和 C 部分）和数据分析。
2.使用 BD CellQuest Pro 软件，在 FSC与FL3（x 轴 FSC 和 y 轴 FL3）的帮助下门控蓝藻种群（图 1C）。
3.生成 FL1 的直方图，如图 2 所示。
4.记录来自门控蓝藻细胞群的 FL1 直方图的平均荧光强度 (MFI)，它描述了 ROS 水平。
5.FL1 通道直方图的 MFI 也可以表示为条形图来描述 ROS 水平。
6.来自不同生物体的 FL1 值可以使用 Tukey 事后函数的单向方差分析或其他合适的统计分析来分析。

图 3. 检测活性氧 (ROS) 和数据分析所涉及的步骤。

笔记

1.要优化 DCFH-DA 的浓度，请使用一定浓度的 H 2 O 2以在生物体中产生最大 ROS，同时杀死不到 10% 的细胞（Mondal等人， 2020）。可以使用不同浓度的 H 2 O 2和活细胞可渗透的核酸结合荧光染料 SYBR Green I 进行活-死检测。用不同浓度的 H 2 O 2 处理细胞，使用不同浓度的 H 2 O 2检测活细胞Sybr Green I 和 FCM 确定导致低于 10% 杀灭率的 H 2 O 2浓度（Mondal等人， 2020 年）。
2.流式细胞仪在细胞/细丝尺寸方面存在限制。喷嘴可以分析大约 1 µm 到 50 µm 的细胞/灯丝长度。尽管尺寸范围可能有所不同，但建议在使用丝状蓝藻或形成团块或聚集体的生物时要小心。长丝可能会堵塞喷嘴。如果需要，建议在通过 FCM 采集样品之前使用超声波仪准备短丝。然而，应提前分析超声处理对 ROS 水平和细胞存活的影响。样品可以在超声波浴超声仪中超声处理不同的时间间隔，并且可以通过光学显微镜监测碎片。 Fremyella的细丝 dilosiphon BK14 更短（<50 µm），因此这种蓝藻不需要碎裂。
3.DCFH-DA 是一种光敏荧光探针。建议在最小光线下进行整个实验，避免样品和染料直接暴露在光线下。
或者，可以通过直接细胞计数或细胞样品的浊度测量作为光散射来确定细胞浓度。在 FCM 中采集通常需要至少 1×10 5 个细胞。

食谱

1.2 mM (w/v) DCFH-DA 储备溶液 (1 mL)
a.1 mL 100% 乙醇（分子级）。
b.在 1 mL 的 100% 乙醇中溶解 0.974 mg DCFH-DA。
c.通过涡旋混合并在-20 °C的黑暗中储存（可储存长达 3 个月）。

2.0.1 M PBS pH 7.4（100 毫升）
a.将 40 mL 的 0.2 M 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 ) 库存与 10 mL 的磷酸二氢钠 (NaH 2 PO 4 ) 库存混合。
b.加入 0.9 g NaCl 并搅拌直至溶解。
c.2 O将体积调至 100 mL，并将 pH 调节至 7.4。
d.使用前通过 0.2 µm 尺寸的 Millipore 膜过滤器过滤。
e.储存在 4 °C。

致谢

这项工作得到了 Banaras 印度教大学 (R/Dev/D/IOE/Incentive/2021-2022/32399) 和印度新德里 SERB 以早期职业研究奖的形式提供的资助。 (ECR/2016/000578) 发给 Shailendra P. Singh。 Soumila Mondal 感谢 UGC 和 BHU 提供 UGC 研究奖学金。作者感谢 DBT 跨学科生命科学学院 (ISLS) BHU 的流式细胞术和荧光显微镜设施。该协议改编自 Mondal等人发布的程序。（2020 年）。 Pankaj K. Maurya 和 Anjali Gupta的仔细阅读和建议也得到认可。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的财务和非财务利益。

参考

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