材料和试剂

1. Whatman ® 3MM 滤纸（Whatman ® ，GE Healthcare，目录号：WHA30306185）
2. 超厚吸墨纸 (2.5 mm) ( ThermoFisher Scientific, Thermo Scientific TM ，目录号88605 ）
3. Amersham TM Hybond TM -N 0.45 µm 孔，中性尼龙膜（GE Amersham，目录号：RPN203N）
4. 15 mL Falcon 管（例如，Corning ® 15 mL 离心管，Sigma-Aldrich，Merck，目录号：CLS430790）
5. 50 mL Falcon 管（例如，Corning ® 50 mL 离心管， Sigma-Aldrich，Merck，目录号：CLS430829）
6. 1.5 mL 微量离心管（例如，Eppendorf ® Safe-Lock 微量离心管，Sigma-Aldrich，Merck，目录号：T9661）
7. 塑料薄膜（例如保鲜膜）（Scientific Laboratory Supplies，目录号：FIL1003）
8. 醋酸片（Rapid Electronics Ltd，Diacel，目录号：34-0303）
9. 培养皿或称重船（用于如图1所示的采摘头，例如，小方形称重船，Sigma-Aldrich，Merck，目录号：Z708542-500EA）
10. 用10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA（Sigma-Aldrich， Merck ，目录号：P3803）饱和的苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）
11. 氯仿（分析试剂级）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：366927）
12. 乙醇（用于分子生物学）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：51976）
13. 溴化乙锭，分子生物学级水溶液（500 mg/mL）（Sigma-Aldrich， Merck，目录号：E1385）
14. 浓（36.5-38.0％）盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：H1758）
15. 氯化钠（NaCl）（分析试剂级）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：S9888）
16. 氢氧化钠（NaOH）丸（无水）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：S5881）
17. 柠檬酸钠（柠檬酸钠三水合物）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：C8532）
18. TRIS盐酸盐（TRIS HCl）pH 8.0（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：10812846001）
19. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：L3771）
20. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
21. 要测试的果蝇种群（每种基因型 50 – 60 只苍蝇（参见将其应用于其他组织/协议的说明），包括阴性野生型对照，例如 Canton S 或 Oregon R）。野生型苍蝇可以从布卢明顿果蝇种群中心（BDSC，印第安纳大学）（Canton S：BDSC 9515，俄勒冈州 R BDSC 2376）或其他种群中心获得。我们示例中使用的转基因原种是通过剑桥显微注射设施将pUAST -DPR-EGFP 显微注射到 VK00005 胚胎中产生的 [参见 West等人。（2020）；可应要求提供]。
22. 用于生成转基因蝇系的质粒，用作阳性对照 [例如， pUAST - DPR( 1000)]，参见 West等人，2020，可根据要求提供
23. 干冰
24. 无核酸酶水（分子生物学级）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：W4502）
25. 蛋白酶 K（ ThermoFisher Scientific， Thermo Scientific TM ，目录号：EO0491），分成 1 mL 等分试样并储存在 -20°C
26. 限制性内切酶，用适当的缓冲液从基因组中切除感兴趣的 DNA；对于我们的示例，我们使用了 Dde1（New England Biolabs，目录号：R0175）和 NlaIII （ New England Biolabs，目录号：R0125），以及 CutSmart ®缓冲液（New England Biolabs，目录号：B7204）。
27. TBE 缓冲液 (Tris-borate-EDTA) (10 × ) ( ThermoFisher Scientific, Thermo Scientific TM ，目录号：B52）
28. 用于分子生物学的琼脂糖（Sigma-Aldrich， Merck，目录号：A9539）
29. 6 ×上样染料（New England Biolabs，目录号：B7021S）
30. DNA 分子量标记 II，DIG标记（罗氏，默克，目录号：11218590910）
31. 1 kb Plus DNA Ladder（NEB，目录号：N3200）
32. 特定于目标序列的探针 [West et al ., (2020 ) 中使用的探针，由 Eurofins UK 合成，列在本协议的注释部分]。
33. DIG easy hyb（Roche，Merck，目录号：11603558001）
34. 鲑鱼精子 DNA（Agilent Technologies，目录号：201190），分成 300 µL 和 150 µL 的等分试样，并在 -20°C 下储存。
35. DIG Wash and Block Buffer Set（Roche，Merck，目录号：15857 62001），一个等分 DIG 块（例如，50 mL 等分试样）并在 -20°C 下长期储存（一个等分试样可储存长达 3 个月在 4°C）。
36. 抗地高辛-AP，Fab 片段（Roche，Merck，目录号：11093274910， RRID：AB _2734716），储存于 4°C
37. 超纯水（例如来自 Milli-Q ® Purification System）
38. CDP - Star ®化学发光底物（Roche，Merck，目录号：CAS160081-62-9），储存于 4°C
39. 70% 乙醇（见食谱）
40. 脱嘌呤溶液（见配方）
41. 凝胶变性溶液（见配方）
42. 凝胶中和溶液（见配方）
43. 20 × SSC 库存（见食谱）
44. 10% SDS 溶液（见配方）
45. 2 × SSC，0.1% SDS（见配方）
46. 0.5 × SSC，0.1% SDS（见配方）
47. 0.1 × SSC，0.1% SDS（见配方）
48. 阳性对照（见食谱）
49. 基因组提取缓冲液（见配方）
50. 1 × TBE（见配方）
51. 梯子混合（见食谱）
52. 1 × DIG 块（见配方）
53. 1 ×马来酸缓冲液（见配方）
54. 1 ×马来酸洗涤缓冲液（参见配方）
55. 1 ×检测缓冲液（参见配方）

设备

1. 移液器和吸头（P1000、P200、P20、P10 和 P2）
2. 精细画笔（例如，RS PRO Thin 6.4 mm 画笔，RS Components Ltd，目录号：2379190）
3. 涡流混合器（例如，Vortex-Genie ® 2 混合器，Sigma-Aldrich，Merck，目录号：Z258415）
4. 通风柜
5. 酸碱度计
6. 标准 700W – 1000W 微波
7. 标准实验室微量离心机（例如，Sigma 1-14 Microfuge， Sciquip ，目录号：90616）
8. （例如， SciSpin MINI Microfuge， Sciquip ，目录号：SS-6050）
9. 轮管旋转器（例如，Cole- Parmer TM Stuart TM Rotator Disk，Fisher Scientific，目录号：11496548）
10. PowerPac TM基本电源（Bio-Rad，目录号：1645050）
11. × 15 cm）的Sub-Cell GT 电泳池（Bio-Rad，目录号：1704402）
12. 清洁塑料托盘和三明治盒，用于孵育膜和凝胶以及组装 Southern 印迹（图 2）
13. 大三明治容器（例如250 × 150 mm）用作 Southern 印迹装置的盆（图 2）
14. 化学发光和荧光成像系统（例如， G:box成像单元， Syngene ）
15. HB铅笔
16. 用于切割滤纸和膜的剪刀/断头台
17. UV Transilluminator（例如，双波长（302/365）8W transilluminator LM-20，VWR，目录号：732-4388）
18. 标准沸水浴（例如，VWR，SBB Aqua 5 plus，目录号：462-0171）或能够达到> 100°C的热块
19. 标准杂交烘箱（例如，HB-1000 Hybridiser，VWR，目录号：732-4300）
20. 适合杂交炉的玻璃杂交瓶（例如，35 × 150 mm 杂交瓶，VWR，目录号：732-4350）
21. 平刃钳（例如， S Murray TM不锈钢钳 L325/01，Fisher Scientific，目录号：12342158）
22. 摇杆（例如， Cole- Parmer TM Stuart TM See-Saw Rocker，目录号：10470655）

软件

1. 用于对印迹进行成像的成像软件，例如： GeneSys和GeneTools （ Syngene ， https ://www.syngene.com/support/software-downloads/ ）

程序

A. 准备试剂
在开始方案之前，请确保您已准备好阳性对照、梯形混合物以及配方部分中描述的所有缓冲液和溶液。除 1 × DIG 块和 1 ×检测缓冲液外，所有配方必须在使用当天由 10 ×补足，可提前制作并保存至少 1 年。蛋白酶 K 必须在使用前立即新鲜添加到基因组提取缓冲液中。

B. 果蝇头部提取 DNA （可以使用整只果蝇或其他组织，但我们发现使用头部可以提供更好的信号，因为缺乏来自肠道内容物等污染物）。

第一天
1. 收集 50 – 60 只苍蝇（产生约 25 – 30 µg 基因组 DNA），每个基因型，在 15 mL Falcon 管中，放在干冰上。除了测试样品，收集野生型苍蝇，例如Canton S或Oregon R ，用作阴性对照。
2. 要分离飞头，将3-4块干冰放入 50 mL Falcon 管中，并将含有苍蝇的 15 mL Falcon 管放入 50 mL Falcon 管内（参见图 1A）。不要将盖子放回 50 mL Falcon 管上。以最高速度涡旋直到头部分离（~30 s）（参见视频 1）。不涡旋时始终保持在干冰上。

视频 1.通过涡旋分离果蝇头。

3. 挑选头并将它们转移到干冰上的 1.5 mL 微离心管中。可以使用最简单的方法手动拾取头部。我们推荐的方法是将被斩首的苍蝇倒在衬有滤纸的培养皿上，该滤纸位于大托盘或装有干冰的称重船上（参见图 1B）。使用细画笔拾取头部（参见图 1C）并将它们转移到干冰上的 1.5 mL 管中。当一切都尽可能保持低温时，此过程会更容易。
4. 解冻蛋白酶 K 并添加到基因组提取缓冲液中（参见食谱）。
5. 通过用 1 – 200 µL 移液器吸头“挤压”来均质化磁头，其中填充有基因组提取缓冲液（每头 1 µL）而不排出液体（在此过程中将排出足够的缓冲液以有效地均质化磁头而不会使磁头四处飘浮）（约 10 秒）。然后排出剩余的提取缓冲液并放入杂交烘箱（或另一个培养箱）并设置为 57°C。孵育过夜。

图1 。用于收集果蝇头部的示例装置。
A.使用涡流混合器分离果蝇头的装置（另请参见视频 1）。 B.使用画笔拾取头部的设备。 C.头部与苍蝇的其余部分分离。

第 2 天
6. 第二天，在通风橱中，加入一体积（相当于步骤 5 中使用的体积）苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）并在室温下旋转孵育 15 分钟（使用轮管旋转器），例如）。
7. × g下离心 5 分钟。
8. 将水（顶部）层转移到新管中。
9. 将 1 体积的 100% 氯仿添加到步骤 8 中回收的水相中，在室温下旋转孵育 15 分钟（例如，使用轮管旋转器），然后重复步骤7-8 。
10. 用标准乙醇沉淀法回收 DNA：
a. 加入 1 mL 100% 乙醇，颠倒 1 分钟，然后在 -20°C 下放置过夜。

第 3 天
b. 第二天，以 13,000 × g旋转10 分钟并弃去上清液。
c. 用 800 μL 的 70% 乙醇清洗颗粒。
d. 以 13,000 × g离心5 分钟并弃去上清液。
e. 在室温下风干15-30 分钟，然后重新悬浮在 100 μL 的无核酸酶水中。
11. 允许在 4°C 下溶解过夜或在室温下 1 小时。此时可以将 DNA 冷冻并储存在 -20°C 下，直到准备好进入 C 部分。

C. DNA 消化
第 4 天
注意：选择限制性内切酶可有效消化基因组 DNA，而不会切割靶序列。对于我们的示例，选择DdeI和NlaII是因为它们有效地切割了用于将我们的构建体插入果蝇基因组的载体，而不切割 DPR 序列 [参见图 2 和 West 等人，(2020)]。虽然应考虑基因组中每种酶的大致切割频率（例如， NlaIII切割 4 bp 位点，因此切割频率约为 4 4 ），但最关键的因素是酶不会切割您的目标序列。我们示例中使用的酶在材料和试剂中列出，并在表 1中进行了详细说明。消化在 500 μL 的大体积中进行，以便完全消化基因组 DNA。使用 50 – 60 头提取的所有 DNA（~ 25–30 µg DNA）。

图 2. 显示限制性酶NIaIII和 Dde1 切割位点的质粒图谱。
pUASt-DPR1000-GFP 质粒图谱显示了 mini-white 元素、DPR 序列和 EGFP 标签。指示了NlalII和 Dde1 的限制位点（使用Snapgene Viewer 制作）。

1. 将杂交炉（或其他培养箱）设置为限制酶所需的温度。
2. 准备反应混合物（如表 1 所示的示例）。
3. 通过移液混合并通过在台式微量离心机中离心来沉淀内容物（10 秒，2,680 × g ）。
4. 在您选择的酶的最佳条件下孵育（在我们的示例中，在 37°C 下过夜）。

第 5 天
5. 用标准乙醇沉淀法回收 DNA：
a. 加入 1 mL 100% 乙醇，颠倒 1 分钟，然后在 -20°C 下放置过夜。
第 6 天
b. 第二天，以 13,000 × g旋转10 分钟并弃去上清液。
c. 用 800 μL 的 70% 乙醇清洗颗粒。
d. 以 13,000 × g离心5 分钟并弃去上清液。
e. 让颗粒在室温下风干 15-30 分钟。
6. 将颗粒重新悬浮在 17 μL 的无核酸酶水中，充分混合，然后在台式微量离心机中短暂离心（10 秒，2,680 × g ），以确保所有 DNA 都位于管底。
7. 在进行 Southern 印迹之前，让 DNA 在 4°C 下溶解 2 – 3 天。

表1 。 DNA 消化混合物示例
体积 (µL)
脱氧核糖核酸 100
Cutsmart缓冲区 (10 × ) 50
NIaIII 2
Dde1 2
无核酸酶水 346
总容积 500

D. 印迹样品
第 7 天（第 6 天后 2 – 3 天）
1. 制作琼脂糖凝胶：
a. 将 130 mL 1 × TBE 与适当质量的琼脂糖混合，制成分离构建体所需百分比的凝胶（有关凝胶百分比和基于产品大小的分离能力的指南，请参见表 2；在我们的示例中，我们使用 1%对于 6 kb 的产品）。
b. 在微波炉中煮沸 TBE 琼脂糖混合物。
c. 加入 0.5 µg/mL 溴化乙锭并旋转混合。
d. 倒入 15 × 15 厘米的浇铸托盘中并静置。
2. 准备电泳样品：
a. 解冻梯形混合物和 10 ng/µL 阳性对照库存。
b. ×上样染料中加入 0.5 μL 的阳性对照，总体积为 12 μL。
c. 对于 B 和 C 部分中制备的测试样品和阴性对照，添加 3 μL 的 6 ×上样染料，使总体积为 20 μL，这是可以装入孔中的最大值。
3. 准备运行凝胶：
a. 将凝胶放入槽中，用 1 × TBE 填充槽，然后取下梳子。
b. 将 7 μL 的梯形组合、12 μL 的阳性对照和 20 μL 的样品加载到单个井中。将空白孔留在阳性对照的任一侧可能是有益的，以避免因孔之间溢出而导致误报。
4. 在 100 V 下对 DNA 样品进行足够长的电泳，以在目标 DNA 周围的梯带之间提供良好的分离（对于 6 kb 的产品，这大约是 2.5 小时）。

表2 。基于预期产品大小的 TBE 凝胶中琼脂糖百分比指南
琼脂糖 % (w/v) 解析度
0.50% 1,000–30,000 碱基对
0.70% 800–12,000 碱基对
1.00% 500–10,000 碱基对
1.20% 400–7,000 碱基对
1.50% 200–3,000 碱基对
2.00% 50–2,000 碱基对

5. 使用凝胶文档系统（如 G-box）对凝胶进行成像。这有助于确定 DNA 是否已完全消化（消化应显示为泳道上的涂片），并在对最终印迹成像时参考某些泳道中的信号是否较弱。使用紫外线透射仪帮助修剪印迹也很有帮助。
6. 如果需要，可以使用梯子将凝胶修剪得更小，以确保不会去除感兴趣的 DNA。切开凝胶的一个角以帮助识别凝胶方向，然后将凝胶转移到干净的塑料容器中。
7. 凝胶脱嘌呤：加入足够的脱嘌呤溶液覆盖凝胶，室温下在跷跷板或定轨摇床上缓慢摇动，直至上样染料中的溴酚蓝变黄或不超过 10 分钟。
8. 在下一步之前，倒掉脱嘌呤溶液并在蒸馏水中短暂冲洗凝胶。
9. 使凝胶中的 DNA 变性：加入足够的凝胶变性溶液以覆盖凝胶，并在室温下摇动孵育 30 分钟。
10. 中和凝胶：倒出变性溶液，换上等体积的中和溶液。在室温下振荡孵育 30 分钟。
11. 倒掉中和溶液，换上等体积的 20 × SSC。在室温下孵育 20 分钟，在吸墨前摇动。这有助于平衡凝胶并去除背景。
12. 同时，准备 3 张 Whatman 3 MM 纸、一张Hybond -N 0.45 µm 孔尼龙膜和 15 张超厚吸水纸，均切成与凝胶相同的尺寸。还剪下 3 条 3MM 纸，略宽于凝胶，长于支撑的长度，用作灯芯（见图 2）。
13. 此时，您可以从膜上剪下一个角，让杂交后的印迹能够定向，并在将面对凝胶的一侧画一个铅笔标记，以识别 DNA 侧。
14. 使用 70% 乙醇清洁平刃镊子以去除碱性磷酸酶，然后再使用它们处理尼龙膜（碱性磷酸酶与检测过程中使用的化学发光底物发生反应）。
15. 如图 3 所示组装传输。对于这一步，可以重复使用20 × SSC。
a. 将一个小的塑料容器（桥/支架）倒置在一个较大的容器中，以形成您的转移装置的基础。
b. 将较长的滤纸条放在桥/支架上以起到吸水作用，将缓冲液储液罐中的 20 × SSC 吸到凝胶中。倒入少许 20 × SSC 以润湿灯芯。
c. 将凝胶放在灯芯覆盖的桥/支架上（我们通常将凝胶正面朝上放置；然而，这并不重要，因为转移可以在任何方向发生），然后是尼龙膜（铅笔标记朝下，面向凝胶，膜的切角与凝胶的切角相匹配，以帮助定向）。小心去除凝胶和膜之间的所有气泡（用戴手套的手指轻轻地）。
d. 紧随其后的是 3MM 纸和超厚吸墨纸。为避免转移短路，确保缓冲液在被吸至厚吸墨纸时不会绕过凝胶和膜，方法是确保吸液芯不接触凝胶和膜上方的吸墨纸。
e. 在纸上放置一个重物（约 100–300 克，例如一个装满水以覆盖底部但不会溢出的小塑料容器），并将凝胶在室温下放置过夜以进行转移。确保灯芯浸入水中并且重量是水平的。如果室温是温暖的并且您对 20 × SSC 的蒸发有疑问，请用塑料薄膜盖住设备以防止这种情况发生。

图 3.Southern 印迹组装。
A.示意图。 B.照片。将一个小的塑料容器倒置在一个较大的塑料容器中，形成一个桥梁。将较长的滤纸条放在容器上，让缓冲液槽中的 20 × SSC 芯吸到凝胶中。倒入少许 20 × SSC 以润湿灯芯。将凝胶放在桥上，然后是尼龙膜，小心去除凝胶和膜之间的所有气泡。小心地将 3MM 纸和超厚吸墨纸放在上面。将重物（例如，装满水的塑料容器）放在纸上，让凝胶过夜以进行转移。确保灯芯被覆盖和重量水平。如果你担心蒸发，你可以用塑料薄膜覆盖。

E. 杂交
第 8 天
1. 第二天，将沸水浴/热块设置为 100°C，杂交烘箱设置为 42°C。
2. 将 30 mL DIG easy hyb置于 42°C 预热。解冻 300 µL 鲑鱼精子 DNA。
3. 拆卸印迹（保留 20 × SSC 以供重复使用）并在 ~ 20 mL 的 2 × SSC 中轻轻清洗膜。
4. 使用 UV（302 nm，“Hi”强度设置）将 DNA 固定在膜上：将塑料薄膜放在 UV 透照器表面，将膜 DNA 面朝下，打开照明器，固定 180 秒（图 4）。如果使用 UV 交联剂，例如 Stratalinker，请使用 1200 µJ 的标准自动交联设置。

图 4. 紫外固定膜 - 示意图。
确保您佩戴正确的个人防护设备以使用紫外线。将塑料薄膜放在紫外线透照仪的表面上，膜 DNA 面朝下放在塑料薄膜的顶部。打开 UV 并离开修复 180 秒。

5. 转移到杂交瓶中（DNA 面朝内；确保膜的 DNA 面完全暴露且不折叠）并加入约 50 mL 的 2 × SSC 以防止膜变干* 。
注意：* 膜可以在 2 × SSC 中放置过夜，但如果在杂交前放置更长时间，请在超纯水中冲洗膜两次 10 分钟，然后轻轻风干膜并在 3MM 纸之间存放后期杂交。这种洗涤是至关重要的，因为它可以去除任何可能在膜上干燥并产生背景信号的微量盐分。
6. 准备预杂交溶液：将 300 µL 鲑鱼精子 DNA 原液煮沸 10 分钟使其变性（这是 3,000 µg DNA），然后置于冰上以防止重新退火；加入 30 mL 预热的 DIG easy hyb。
7. 倒掉 2 × SSC，然后加入预杂交溶液。在 42°C 下旋转预杂交 4 小时。
8. 制备杂交溶液：解冻 150 µL (1,500 µg) 鲑鱼精子 DNA，将 15 mL DIG easy hyb预热至 42°C；如步骤 6 中所述使鲑鱼精子 DNA 变性，并将其和 7.5 µL 10 ng/ µL寡核苷酸探针原液添加到 DIG easy hyb 中，最终鲑鱼精子 DNA 浓度为 100 µg/µL，探针浓度为 0.005 ng/µL。
9. 倒掉预杂交溶液并更换为杂交溶液。在 42°C 下旋转杂交过夜。

F. 检测
第 9 天
1. 第二天，从烤箱中取出杂交瓶并设置为 65°C。
2. 放入 2 × SSC的 2 × 50 mL 等分试样； 0.1% SDS 和 1 × 50 mL 0.5 × SSC； 0.1% SDS（和 50 mL 0.1 × SSC；如果用于可选的额外最终洗涤（步骤 7），则为 0.1% SDS）在 65 °C 下预热。解冻 10 × DIG 块并准备 1 ×块（参见食谱）。
3. 倒掉探针，用大约 50 mL 2 ×冲洗杂交瓶中的膜 SSC； 0.1% SDS。
4. 加入 50 mL 预热的 2 × SSC；将 0.1% SDS 加到瓶中的膜上，并在 65°C 下旋转洗涤 15 分钟。
5. 更换为 50 mL 新鲜预热的 2 × SSC； 0.1% SDS 洗涤 15 分钟。
6. 更换为 50 mL 预热的 0.5 × SSC； 0.1% SDS 洗涤 15 分钟。
7. 可选的额外清洗（如果背景高且信号较弱）：替换为 50 mL 预热的 0.1 × SSC； 0.1% SDS 洗涤 15 分钟。
8. ×马来酸缓冲液冲洗瓶子（使用前剧烈摇晃）。
9. 将膜转移到干净的盘子中，在室温下将膜在马来酸缓冲液中振荡 2 分钟。
10. × g下将抗地高辛-AP 抗体离心 15 分钟来制备抗体溶液，以去除抗体复合物。从顶部移取抗体以在 1 × DIG 块中制备 20 mL 1:20,000 抗DIG。
11. 倒出马来酸缓冲液并在室温下将膜在 50 mL 1 × DIG 块中摇动孵育 30 分钟。
12. 倒出封闭溶液，在室温下将膜在 20 mL 抗体溶液中振荡孵育 30 分钟。
13. ×马来酸洗涤缓冲液中洗涤膜两次（2 × 15 分钟，在室温下摇动）。
14. 准备 1 ×检测缓冲液（参见配方）。在 20 mL 1 ×检测缓冲液中平衡膜 5 分钟。在室温下留在检测缓冲液中，直到准备好成像。
15. 将膜 DNA 面朝上放在一张干净的醋酸盐上。加入 1–2 mL（覆盖膜）CDP- Star ®化学发光底物，均匀分布在膜上。在顶部放置另一张干净的醋酸盐，将膜夹在中间。当您将第二张醋酸盐片放在膜上时，请小心消除气泡。立即进行成像。
16. 最初使用 G-Box 或等效系统对膜进行 1 分钟成像，以检查印迹是否有效（应该看到梯子），然后再次以最高质量成像。
17. 为了增强对弱波段的检测，突出显示感兴趣的区域并根据这些波段设置自动曝光时间。再上图。使用此处列出的 G-Box 系统最多可能需要 30 分钟。请参见图 5，了解最终的 Southern 印迹图像示例。

图 5. 用于长度检查 UAS-GA1000-EGFP 飞线的 Southern 印迹示例。
一个 6 kb 的条带对应于 1000 个二肽重复。泳道按顺序排列：阳性对照（+，来自野生型果蝇的 DNA，掺有 1000 个重复线性化质粒 DNA）、阶梯、阴性对照（-，来自野生型果蝇的 DNA）和两个独立的 GA1000 系（1 和 2）。该印迹成像 30 分钟。

笔记

我们发现从 50-60 个头部中提取是最佳的（25-30 µg 基因组 DNA），但如果使用其他基因组 DNA 提取方案，或者从其他组织中提取 DNA，这可能需要优化。我们建议至少应使用 5 µg 基因组 DNA。

如果感兴趣的 DNA 具有更短/更长的重复长度，则可以使用不同的 DIG 梯。
如果目标 DNA 与给出的示例不同，则需要优化以下内容：
• 凝胶百分比和运行时间
• 加载的阳性对照量，基于相对于样品的强度
为了进一步优化背景降低，我们建议在杂交后添加额外的严格洗涤，如程序部分 F 步骤 7 中所述。抗体孵育后在马来酸洗涤缓冲液中第三次洗涤 15 分钟（F 部分步骤 12）也可能有助于降低高背景水平。

在 West等人中产生的果蝇的 Southern 印迹。 (2020) 使用了以下探针：
GA探针：DIG-GGCAGGAGCTGGAGCTGGCGCAGGAGCTGGTGCTGGG-DIG
GR 探头：DIG-AGGCAGAGGTCGTGGGAGAGGCAGGGGTCGCGGACGTGGA-DIG
AP探头：DIG-AGCACCAGCACCGGCGCCAGCTCCAGCACCAGCACCC-DIG
PR 探头：DIG-AGACCCCGTCCTCGTCCTCGTCCAAGACCAAGGCCGAGGC-DIG

探针设计将根据您的目标序列而有所不同。通常，寡核苷酸探针应在 18 到 50 个碱基之间以平衡产量和特异性。最佳 GC 含量在 40 – 50% 之间，建议进行计算分析以优化特异性。

食谱

除非另有说明，否则缓冲液和溶液应在室温下保存长达一年。
1. 基因组提取缓冲液
25 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH 8.2、1 mM EDTA 和蛋白酶 K 200 μg /mL
在室温下储存不含蛋白酶 K 的缓冲液；蛋白酶 K 应以 1 mL 等分试样在 –20°C 下储存，并在使用前立即加入适当体积的缓冲液中。
2. 阳性对照
野生型果蝇DNA 在每 1 µg 基因组 DNA 中加入 157 ng 含有目标重复序列的线性化质粒，以产生等效的单倍体 DNA。在 -20°C 下保持 10 ng/µL 的库存。
3. 阶梯混合
1:1 DIG 标记的 DNA 标记物 II：1 kb 加上 DNA 梯，加上 1 ×上样染料（在电泳后修剪凝胶时，可见梯用作 DNA 片段大小的参考）。将这种混合物储存在 -20°C。
4. 70% 乙醇（在无核酸酶水中配制）
在无核酸酶水中化妆
5. 1 × TBE
在超纯水中化妆
6. 脱嘌呤溶液
0.25 M 盐酸
7. 凝胶变性溶液
0.6 M NaCl，0.2 N NaOH
17.53 g NaCl，4 g NaOH 溶于 500 mL 水中
8. 凝胶中和溶液
1.5 M NaCl，0.5 M Tris-HCl pH 8.0
43.8 g NaCl，30.30 g Tris，在 500 mL 水中加 HCl 至 pH（约 30 mL）
9. 20 × SSC 库存
3 M NaCl，300 mM 柠檬酸钠 pH 7.4
每升蒸馏水 175.3 g NaCl，88.2 g 柠檬酸钠
10. 10% SDS 溶液
50 克十二烷基硫酸钠在 500 毫升水中的总体积
11. 2 × SSC，0.1% SDS
50 mL 20 × SSC，5 mL 10% SDS，总体积为 500 mL 蒸馏水
12. 0.5 × SSC，0.1% SDS
12.5 mL 20 × SSC，5 mL 10% SDS，总体积为 500 mL 蒸馏水
13. 0.1 × SSC，0.1% SDS
2.5 mL 20 × SSC，5 mL 10% SDS，总体积为 500 mL 蒸馏水
如果您的印迹有大量背景且信号较弱，这可用于最后 15 分钟的严格洗涤。
14. 1 × DIG块（当天准备）
×马来酸缓冲液中稀释 10 × DIG 块（DIG 洗涤和块缓冲液套装）
15. 1 ×马来酸缓冲液
用蒸馏水稀释 10 ×苹果酸缓冲液（DIG Wash and Block Buffer Set）
16. 1 ×马来酸洗涤缓冲液
用蒸馏水稀释 10 ×苹果酸洗涤缓冲液（DIG Wash and Block Buffer Set）
17. 1 ×检测缓冲液（当天配制）
用蒸馏水稀释 10 ×检测缓冲液（DIG Wash and Block Buffer Set）

致谢

我们感谢 Sara Rollinson 博士在优化此协议方面提供的帮助和专业知识。
这项工作得到了授予 RJHW (AS-JF-16b-004 (510))、皇家学会 (RGS\R2\212216)、授予JLS的医学研究委员会奖学金和 Jean Corsan基金会奖学金的阿尔茨海默氏症协会奖学金的支持授予NSH。该协议源自我们之前的工作（West等人，2020； doi ：10.1186/s40478-020-01028-y）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益

参考

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