材料和试剂
生物材料（协议#1）
1.实验动物：
C57BL/6J 小鼠（杰克逊实验室，目录号：000664）。然而，该协议可用于任何小鼠品系，它也可以类似地应用于其他实验啮齿动物模型。
关键：对于电穿孔，动物应至少 6 个月大，以确保完成产后肌肉生长。然而，如果目的是探索基因在出生后肌肉生长中的作用，可以使用更年轻的动物。

生物材料（协议#2）
1.C2C12 鼠成肌细胞：
在 37°C 下在含有 10% (v/v) FBS 培养基和 1% (v/v) 青霉素/链霉素的 DMEM + GlutaMax中培养，在 5% (v/v) CO 2的气氛中。为了分化成肌管，细胞在含有 2% (v/v) HS 培养基和 1% (v/v) 青霉素/链霉素的 DMEM + GlutaMax中培养，在相同的条件下。
关键：每 6 个月对所有细胞进行一次支原体检测。污染。最佳结果的最大通道数为 10。

试剂（方案 #1 和 #2）
电穿孔（协议#1）
1.透明质酸酶 - 来自牛睾丸的 IV-S 型（Sigma-Aldrich，目录号：4272）
2.5 × siRNA缓冲液（Horizon，目录号：B-002000-UB-100）
3.1 × PBS（Gibco，目录号：10010-023）
4.20 nM ON- TARGETplus siRNA（作为单个 siRNA 或作为 4 个 siRNA 的SMARTpool提供），例如非靶向对照（Horizon，目录号：D-001810-10-20）或靶向感兴趣基因的 siRNA（注意：本协议中也可以使用其他类型的 RNAi 试剂代替 ON- TARGETplus siRNA）。荧光团标记的siRNA（ siGLO试剂，例如siGLO Red Transfection Indicator，D-001630-02-05）也可用于在测试此方案时监测 siRNA 的传递。
5.异氟醚（ Piramel Critical Care，目录号：66794-013-25）
6.医用氧气 [100% (v/v) O 2 ]
7.Nair 脱毛膏（Church & Dwight 或同等产品）

冷冻保存（协议#1）
1.黄蓍胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1128）
2.2-甲基丁烷，即异戊烷（Sigma-Aldrich，目录号：277258）
3.乙醇，140 Proof（ Greenfield Global的Pharmco ，目录号：111000140）

冷冻切片（协议 #1）
1.Tissue-Tek OCT 化合物（Sakura Finetek USA，Inc.，目录号：4583）
2.苏木精染色（Cancer Diagnostic，目录号：SH5777）
3.Mount Quick Aqueous Mounting，30 mL（Research Products International，目录号：195705）

免疫组织化学（方案 #1）
1.牛血清白蛋白（BSA； GoldBio ，目录号：A-420-1）
2.Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：9002-93-1）
3.SC-71-s 一抗（Developmental Studies Hybridoma Bank，目录号：SC-71）
4.BF-F3-s 一抗（Developmental Studies Hybridoma Bank，目录号：BF-F3）
5.层粘连蛋白α2抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：SC-59854）
6.Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG1（ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：A21121）
7.Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgM（ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：A21426）
8.Alexa Fluor 647山羊抗大鼠IgG（ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：A21247）
9.DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：10-236-276-001）
10.Slow Fade Gold Antifade（ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：S36937）
11.快速干燥面漆抛光剂（电子显微镜科学，目录号：72180）

细胞培养（方案#2）
1.DMEM，高葡萄糖， GlutaMax补充剂（Gibco，目录号：10566106）
2.胎牛血清（FBS；Gibco，目录号：10438-026）
3.1 ×青霉素/链霉素10,000 U/mL（P/S；Gibco，目录号：15140122）
4.马血清（HS；Gibco，目录号：26050070）
5.Opti-MEM 减少血清培养基（Gibco，目录号：31985062）
6.Lipofectamine 2000（Invitrogen，目录号：11668019）
7.胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：C1768）
8.0.25% 胰蛋白酶-EDTA（w/vol），酚红（Gibco，目录号：25200056）

肌管免疫染色（方案 #2）
1.16％多聚甲醛（PFA）水溶液，EM级（Fisher Scientific，目录号：50-980-487）
2.肌球蛋白 4 单克隆抗体 MF20（ Thermo Fisher Scientific，目录号：14-6503-82）
3.Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG2b（ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：A21147）

试剂设置（方案 #1 和 #2）（参见配方）
1.10% 黄蓍胶
2.透明质酸酶原液
3.透明质酸酶工作液
4.50 μM siRNA 原液
5.2% BSA 封闭缓冲液
6.一抗染色液（冷冻载玻片）
7.二抗染色液（冷冻载玻片）
8.10% 胎牛血清
9.2% 恒生
10.1% P/S
11.4% PFA
12.一抗染色液（细胞培养肌管）
13.二抗染色液（细胞培养肌管）

设备

对于协议 #1 和 #2
1.带鼻锥的感应室（ VetEquip V-10 移动装置）
2.异氟醚蒸发器（ VetEquip ，目录号：911103）
3.29 ½ 号针头（Fisher Scientific，目录号：1 4-841-32）和U-100 胰岛素注射器（0.5 mL 0.33 × 12.7 mm； Exel INT，目录号：26028）
4.Electro Square Porator （ECM830 BTX Harvard Apparatus）和电极（ Genetrodes ，直，10mm Gold Tip，目录号：45-0114，BTX Harvard Apparatus）
5.培养皿，可堆叠盖 100 mm × 15 mm 无菌（Fisher Scientific，目录号：FB0875712）
6.Exel International不锈钢一次性手术刀#11（Fisher Scientific，目录号：14-840-01）
7.碳纤维数显卡尺（Fisher Scientific，目录号：15-077-957）
8.莫洛尼镊子（ Roboz Surgical Store，目录号：RS-8254）
9.Graefe镊子（ Roboz Surgical Store，目录号：RS-5139）
10.解剖剪刀，4.5 英寸直（ Roboz Surgical Store，目录号：RS-5912）
11.手术剪刀，4.5 英寸直（ Roboz Surgical Store，目录号：RS-6802）
12.敷料钳（World Precision Instruments，目录号：500365）
13.软木板（Fisher Scientific，目录号：07-840-10）
14.台式液氮容器，2 L（ Thermo Fisher Scientific，目录号：2123）
15.Versi -Dry Dispenser Roll，20 英寸 x 100 英寸（ Thermo Fisher Scientific，目录号：62070）
16.绝缘泡沫冷却器
17.精密天平（如 Sartorius Secura Analytical Balance 0.1mg）
18.250 mL 烧杯（DWK Life Sciences，Kimble）
19.Leica CM3050S 低温恒温器（Leica Biosystems，目录号：14903050S）
20.Superfrost plus 显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：22-037-246）
21.样品盘，30 mm（Leica Biosystems，目录号：14037008587）
22.Leica 一次性刀片低剖面 819（Leica Biosystems，目录号：14035838925）
23.3 mL 移液管（Falcon，目录号：357524）
24.盖玻片22 × 30 mm，1.5厚度（Fisher Scientific，目录号：NC1272771）
25.单刃工业剃须刀片（VWR，目录号：55411-050）
26.显微镜载玻片盒100p软木塞（Fisher Scientific，目录号：22-267294）
27.Kimwipes（Fisher Scientific，目录号：06-666A）
28.蜡笔Dako （Agilent，目录号：S2002）
29.激光扫描共聚焦显微镜（例如，尼康 C2）
30.Nikon Elements 软件（高级研究版）
31.CO 2培养箱 (5% (vol/vol) CO 2 , 37°C)
32.II级，A2型生物安全柜
33.大容量台式离心机（ Sorvall T6000D）
34.T150细胞培养瓶（ MidSci ，目录号：TP90151）
35.6孔康宁Costar平底细胞培养板（康宁，目录号：3516）
36.Falcon 50-mL 锥形管（Fisher Scientific，目录号：352070）
37.Corning Costar 10-mL血清移液管（Corning，目录号：4488）
38.Corning Costar 25-mL血清移液管（Corning，目录号：4489）
39.一次性 9 英寸巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：NC9496627）
40.便携式移液器控制器（Drummond Scientific Company，目录号：4-000-101）
41.Hausser Scientific血细胞计数器（Fisher Scientific，目录号：S17036 ）
42.手动计数计数器（Fisher Scientific，目录号：07-905-6）
43.倒置相差显微镜
44.生物危险废物容器
45.锥形管架
46.荧光显微镜（Keyence BZ-X700）

设备设置

手术室（方案#1）
所有动物实验和解剖都应在指定的手术室进行，该手术室可以使用异氟醚麻醉室和氧气。在手术室中，用 70% 的酒精对工作站进行消毒，并放置一个手术吸水垫。穿着适当的个人防护装备，包括长袍、发套、鞋套、面罩和无菌手套。

准备解剖组织（协议 #1）
在进入手术室之前，准备好每个样品：一个 1.5-mL不含 RNAse的微量离心管，和一个 2-cm × 2-cm 用于肌肉安装和冷冻保存的软木垫。收集所有必要的试剂，包括液氮、异戊烷和黄蓍胶。准备一个装有 100 mL 异戊烷的塑料烧杯，将其插入聚苯乙烯泡沫塑料垫中，然后在液氮中漂浮在带有密封盖的适当绝缘容器内。在冷冻任何组织之前，让异戊烷达到最佳温度 (-160°C)。用 70% 的酒精对所有手术工具进行消毒。

细胞培养制备（协议 #2）
所有细胞培养实验都应在无菌 II 类 A2 型生物安全柜中的指定程序室中进行。所有人员都应根据 BSL-2 协议进行培训。应使用无菌技术进行实验，并使用 70% 乙醇对细胞培养罩、所有设备和试剂进行消毒。应根据机构和州法律以适当的方式丢弃生物危害废物。必须穿戴适当的 PPE，包括手套和干净的实验室外套。在所有实验之前，必要的试剂应在 37°C 水浴中加热至少 30 分钟，除非方案中另有说明。

软件

1.GraphPad Prism（版本 7 或更高版本）
2.图像J

程序_

A.肌肉电穿孔 • 时间每只小鼠约 2.5 小时
1.将鼠标放在感应室中，以 2.5 升/分钟的流速输送 3.0% (v/v) 异氟醚，直到动物完全麻醉。监测鼠标的呼吸频率，并通过脚趾捏反射测试麻醉效率。
注意：如果吸入蒸气，异氟醚是危险的。确保适当的通风。
2.从感应室中取出鼠标并将其转移到手术垫上。将动物放在鼻锥装置中并保持异氟醚水平。
3.在腿上加入一角硬币大小的脱毛乳液 10 秒，然后用 70% 乙醇擦拭。
4.30 μL的透明质酸酶工作溶液直接注入 TA 肌肉。为此，将针头倾斜约 10 °放置在所需的后腿上，定向以便您可以看到针头的开口。从 TA 的下部附件开始插入针头，直到到达肌肉的上部。将针从肌肉中拉出时缓慢释放所有溶液（图 1a - b）。确保交付所有内容。结果，肌肉会膨胀，但你不应该看到任何皮下液体。
关键：透明质酸酶降解透明质酸，透明质酸是细胞外基质的一种成分，对于帮助 siRNA 通过 TA 扩散至关重要。
5.注射后，将鼠标放回笼子，让它恢复 2 小时，然后再次麻醉。
关键：确保鼠标在恢复过程中能够获得食物和水。
6.在鼠标恢复时，设置电穿孔机并调整设置以读取 20 ms 、1 Hz 和 80V。通过将尖端脉冲到水中来测试电极。如果工作正常，脉冲会产生气泡。
注意：如果直接接触电极，可能会对皮肤造成伤害。
7.注射透明质酸酶 2 小时后，再次麻醉小鼠并将其放回鼻锥中，保持与以前相同水平的异氟醚。以与透明质酸酶溶液类似的方式将30 μL的 50 μM siRNA 直接注入 TA 肌肉（步骤 4；图 1a-b）。
8.Genetrodes电极放置在与 TA 肌肉平行的先前剃过的皮肤上，对注射了 siRNA 的肌肉进行电穿孔，脉冲四次（每个脉冲由 1 Hz、80 V 组成，持续 20 ms ），中间间隔 1 s脉冲（图 1c）。使用垂直于 TA 肌肉放置的电极重复此过程（图 1d-e）。将电极放置在 TA 顶部剃光皮肤的任何区域都可以，只要用力按压即可。
注意：确保电极没有相互接触或您的手。使电极彼此相距 0.2 厘米。
9.将鼠标返回笼子进行恢复。计划在电穿孔后 7 天解剖肌肉以进行后续分析。

图 1. 将 siRNA 电穿孔到胫骨前肌的肌纤维中。
一个。胫骨前肌 ( TA) 肌肉和相关胫骨在后腿中的位置。湾。将透明质酸酶和 siRNA 注入 TA：这些溶液在拔出针头的同时缓慢释放。 c，电穿孔仪的设置。 d - e。将电极平行(d)和垂直(e)放置在 TA 顶部的皮肤上，用于电穿孔 siRNA。

B.肌肉解剖和保存• 时间为每只小鼠约 7 分钟（协议 #1）
10.将鼠标放入安乐死室，以 3-L/min 的流速提供 100% (v/v) CO 2 2 分钟。观察动物是否有呼吸困难，并将 CO 2水平再维持一分钟。将动物从房间中取出，并进行颈椎脱位以确认动物的死亡。记录其重量（如果比较从不同年龄的动物获得的结果相关，如背景部分所述），并立即转移到手术吸水垫。
11.将动物放在其背上，用 70% 乙醇喷洒后腿。用手术剪刀在脚踝上方做一个小切口，去除腿部周围的皮肤。用莫洛尼镊子将皮肤拉回大腿以暴露 TA。
关键：使用 Moloney 镊子的尖端小心地去除筋膜（即覆盖肌肉的结缔层）。
注意：所有手术工具都非常锋利，如果使用不当可能会造成伤害。
12.用手术刀切断远端肌腱，从脚踝释放肌肉。使用莫洛尼钳，将肌肉拉向大腿，并将组织固定到位。使用微解剖剪刀将肌肉与近端附件和相关骨骼（即胫骨）分离。称量肌肉并记录测量值。
13.为了保存组织进行分析，用手术刀在中腹部（肌肉最宽的部分）将 TA 切成两半。通过在准备好的软木广场上传播黄蓍胶来准备组织学样品。使用Graefe钳，将 TA 肌肉的远端半部（肌腱侧向下）拖入黄蓍。将软木塞放入悬浮在液氮中的异戊烷中至少 30-45 秒，以冷冻保存组织。
注意：吸入异戊烷是危险的。处理时避免皮肤接触并穿戴防护设备。
14.再次将剩余的 TA 肌肉切成两半。收集准备好的 1.5-mL 微量离心管中的所有组织，并按照前面描述的类似程序（ Meng et等人，2014 年）。
关键：使用其中一个组织块进行 RNA 提取，以通过qRT - PCR 测试 siRNA 的击倒效率。
15.使用手术剪刀，在膝盖中间剪开，将腿与动物分离。一旦分离，找到膝盖和胫骨的交界处，然后再次切割。为了暴露骨头，将动物的脚压向手术垫，然后将皮肤向下拉。使用数字卡尺测量胫骨的长度（以毫米为单位），并记录。胫骨长度的测量用于标准化 TA 肌肉的重量，以解释实验动物的身体和肌肉大小的变异性。
16.在另一条腿上重复步骤 11 - 15。
注意：为了提供适当的稳健控制，一个 TA 用靶向感兴趣基因的 siRNA 进行电穿孔，而对侧腿中的另一个 TA 用对照非靶向 siRNA 进行电穿孔（图 2）。
17.在解剖过程中将软木塞和管子暂时存放在干冰上。将所有样品储存在 -80 °C以供将来分析。

图 2. 胫骨前肌和胫骨的解剖。
一-我。从后腿前部解剖胫骨前 (TA) 肌肉的分步视觉表示。一个。使用手术剪刀在脚踝处做一个小切口。湾。去除皮肤以暴露下面的 TA 肌肉。 C。筋膜被移除。 d。切断近端肌腱，释放 TA 肌。 e. TA 肌肉被拉向大腿。 F。肌肉与胫骨分离。克。在膝盖水平进行切割以分离后腿的下部。 H。膝盖和胫骨之间的连接被切断。我。将胫骨放在手术垫上，将动物的脚向下拉露出骨头，这样就可以正确测量胫骨的全长。

C.组织的冷冻切片 • 每个样本的时间约为 15 分钟（协议 #1）
18.从 -80°C 冰箱中取出组织，切片前 30 分钟将其放入低温恒温器室中。将样品和腔室温度调整至 -20°C。
批判的：试样温度因试样类型而异。对于骨骼肌，建议温度范围在 -25 °C和 -15 °C之间。
19.将样品盘和刷子放入腔室，并将一次性刀片对准支架。
注意：一次性刀片很锋利；搬运时要小心，以免受伤。不使用时，低温恒温器手轮应始终处于锁定位置。
20.在 30 毫米样品盘上涂抹足量的 OCT，然后安装样品。在组织冻结时为每个样品准备四张显微镜载玻片。
21.组织冷冻后，将圆盘插入样品头。使用附加的杠杆，将组织定位到所需位置，然后向下夹。
22.将修整厚度调整为 10 µm，通过解锁手轮并使用电动粗进刀将样品带到一次性刀片。通过顺时针旋转手轮开始手动修剪肌肉，直到组织光滑。
23.用防卷板向下再次修剪纸巾。使用刷子将组织弄平并将样品收集到显微镜载玻片上。
故障排除：如果切片卷曲或切碎，请调整连接到防倾板的旋钮，以改变其与刀片的距离。
24.要测试切片是否正确修剪，请用滴管将苏木精染色剂涂抹在载玻片上，10 秒后用水清洗。安装载玻片并在显微镜下观察。如果正确，则修剪并收集组织，直到每个额外的显微镜载玻片具有多达三个组织部分，用于随后的免疫染色。
25.完成后，锁定手轮并从样品头中取出样品。在圆盘和软木塞之间插入刀片，将样品从冷冻介质中分离出来。暂时将组织存放在干冰上。
注意：刀片很锋利，使用时要小心，以免受伤。
26.将样品头放回原位，取下一次性刀片。将所有切片废物清扫到废物托盘中，并将其丢弃在生物危害废物中。
关键：不要将样品留在低温恒温箱中，因为冷冻箱每 24 小时会解冻一次。
27.使用 70% 乙醇对腔室进行消毒，关闭腔室滑动窗口，然后关闭照明。
28.将显微镜载玻片保存在幻灯片盒中，并在需要时将其保持在 -20°C。载玻片可在 -20°C 下无限期保存。

D.免疫染色载玻片 • 第一天的时间约为 1.5 小时，第二天的时间约为 3 小时（方案 #1）
29.从 -20°C 存储中取出载玻片，并在干燥的载玻片盒中在室温下解冻 10 分钟。
30.解冻后，使用疏水蜡标记在幻灯片上所需组织周围勾勒出一个正方形。用 1 × PBS水合载玻片10 分钟，注意不要接触组织。
31.从幻灯片中吸出 PBS，并在室温下加入 2% BSA-0.1% Triton X-100 阻断溶液 1 小时。
32.吸出阻塞溶液并将一抗染色溶液添加到载玻片中。在 4 °C 下孵育过夜。为了识别 TA 肌纤维类型，一抗溶液应包括抗层粘连蛋白 α2，用于检测肌纤维边界、SC-71 抗体，用于免疫染色IIA 型肌纤维，以及 BF-F3 抗体，用于免疫染色IIB 型肌纤维。为了尽量减少抗体溶液的蒸发，请在装有载玻片的盒子中加入水或浸泡过的纸。
33.第二天，从 4°C 中取出载玻片并吸出抗体溶液。在室温下使用 1 × PBS清洗载玻片 3 次。在室温下用二级抗体孵育载玻片 2 小时。对于 TA 肌纤维类型的免疫染色，二抗溶液应包含适当的 Alexa Fluor 偶联抗体，包括用于检测层粘连蛋白的 AF647 山羊抗大鼠 IgG、用于检测 IIA 型纤维的 AF488 山羊抗小鼠 IgG1 和 AF555 山羊抗兔IgM 检测 IIB 型纤维。 DAPI 也可以用于染色肌纤维的细胞核。
34.× PBS清洗幻灯片两次。最后一次清洗后，通过从载玻片上吸出 1 × PBS 并用kimwipe去除蜡涂层来单独准备每张载玻片。
35.为了保留成像，在幻灯片上添加两滴抗褪色安装介质，并在组织上放置一个盖玻片。让幻灯片在室温下风干 24 小时。
关键：荧光染料对光敏感，请将载玻片存放在黑暗的地方。
36.24 小时后，用透明指甲油涂抹边缘以密封载玻片，并在 4°C 下储存。
暂停点：样品可以在 4 °C下保存数周甚至数月，但信号强度会随着时间的推移而下降。
37.使用激光扫描共聚焦显微镜分析样品（图 3）。

图 3. siRNA 电穿孔进入胫骨前肌的结果。
一个。 siGLO红色和非荧光对照非靶向 (NT) siRNA电穿孔后胫骨前部 (TA) 骨骼肌的代表性图像。在用siGLO red电穿孔的 TA 肌肉中检测到红色荧光，而用 NT siRNA 电穿孔没有检测到荧光。湾。在用siGLO red电穿孔的 TA 肌肉的肌纤维中也检测到红色荧光。 C。用对照 NT siRNA 和靶向肌因子 Cyr61 的 siRNA 电穿孔后 7 天的 TA 肌肉横截面。不同肌球蛋白重链亚型的免疫染色可识别不同的肌纤维类型：IIA 型（绿色）、推测的 IIX（黑色，即缺乏染色）和 IIB（红色）肌纤维。注意在用 Cyr61 siRNA 电穿孔的肌肉中缺乏损伤/再生，而在用 NT siRNA 电穿孔的 TA 肌肉的右侧（黄色星号）外周上只能看到轻微的炎症浸润和小的再生纤维。 Cyr61 siRNA 诱导从 IIX 型到 IIB 型肌纤维的转变。 a-b 中的数据来自Hunt LC等人。 Cell Reports (2019)， c 中的数据来自Hunt LC等人。细胞报告（2021a）。

E.共焦成像• 每张幻灯片的时间约为 7 分钟（协议 #1）
38.打开尼康 C2 显微镜。打开成像软件程序“NIS-Elements-Confocal”。对于每个激光通道，打开针孔，并将像素大小更改为 1024 × 1024 像素。
注：等效的激光扫描共聚焦显微镜和相关的图像采集软件可用于这些分析。
39.将样品幻灯片安装在舞台上，盖玻片向下。打开“Eye Port”，并使用 4 ×物镜通过目镜观察幻灯片。调整舞台，直到镜头位于肌肉部分的中心。
40.关闭眼端口，并切换到 10 ×目标。选择 Cy5 通道 (405 nm)，并实时扫描图像。调整焦点，直到层粘连蛋白染色的细胞边界清晰。对于每个单独的激光通道，通过调整增益来优化信号放大。
CRITICAL：使用对照样本设置 Cy5 通道的增益，并为所有样本保持一致。
41.在ND 采集选项卡下，选择 lambda 以单独检查共焦单通道：Cy5、FITC、TRITC 和 DAPI。然后，选择 Larger Image，并在 4 × 4 区域中扫描该区域，最佳路径重叠为 10% 拼接。
42.选择“开始运行”并将图像另存为 ND2 和 JPEG 文件以进行图像分析。

F.图像分析 – Nikon Elements •每张图像约 10 分钟的时间（协议 #1）
43.打开 Nikon Elements – Advanced Research 软件。从视图下拉菜单中选择分析控件，并停靠二进制层、阈值和对象计数功能。
44.将图像作为 ND2 文件打开，并使用多边形感兴趣区域 (ROI) 选项在肌肉部分周围绘制轮廓，以仔细建立分析边界。在结果表下，记录肌肉的总面积，稍后将用于确定总横截面积 (CSA)。
CRITICAL：轮廓尽可能靠近肌肉边界，以避免分析软件检测到背景。
45.在对象计数控制下，观察限制框。选择 Area 和MinFeret ，并设置所需的限制。对于骨骼肌，面积和Feret最小直径的限制范围分别为 100 – 10,000 μm 2和 10 – 150 μm 。设置后，选择保持更新计数。
CRITICAL：限制和范围可以根据实验模型进行调整。也可以在结果表下添加参数。
46.观察二进制层控件上的三个工作层：Cy5、FITC 和 TRITC，分别代表层粘连蛋白、IIA 型纤维和 IIB 型纤维。通过单独选择每一层并调整低/高选项来设置阈值。具体来说，该软件将根据阈值限制以与肌肉其余部分不同的颜色显示检测到的纤维。使用参考层，通过确保阈值根据相应的免疫染色（即抗 IIA 免疫染色仅识别 IIA纤维）来识别单个肌纤维，调整阈值以准确表示纤维。设置后，保持所有图像的阈值相同。
CRITICAL：对于骨骼肌，Cy5 (Alexa 635) 通道的低阈值始终为 0，而 FITC/TRITC (Alexa 488/555) 通道的高阈值始终为 4095。
47.要确定 IIA 型肌纤维，请打开二元运算对话框并在 Cy5 和 FITC 层之间创建交集 (AND)。该软件将使用层粘连蛋白 α2 的逆阈值识别纤维，以确定肌纤维边界。
48.在对象计数控件的结果表下查看每根纤维的面积。使用 FITC 的参考层作为指导，并删除任何不代表光纤的交点。将数据导出到 Excel 中，并将工作表标记为样品名称和纤维类型。
49.要确定 IIB 型肌纤维，请对 TRITC 通道重复步骤47-48 。
50.要查找未染色的假定 IIX 型纤维，请打开二元操作对话框并在 Cy5 和 FITC 层之间创建一个减法（第一层的第二层）。使用新创建的减法层和 TRITC 层重复此步骤。像以前一样检查该区域，删除任何非光纤，然后将数据导出到 Excel。
51.取消选择保持更新计数，并关闭图像。不要保存对图像的更改。
52.对每个样本重复步骤 47-51 （图 4）。

图 4. 使用 Nikon Elements 软件分析 TA 肌纤维尺寸。
一个。 Nikon Elements软件打开，对接阈值、二值层、物体计数功能。湾。打开图像，并在肌肉边界周围绘制一个多边形感兴趣区域 (ROI)。 C。在对象计数功能上，选择了 Area 和MinFeret选项，并将限制设置为所需的范围。选择“不断更新计数”功能。 d。观察到三个工作层（Cy5、FITC 和 TRITC），并调整阈值以准确表示纤维类型（IIA、IIB 和 IIX）和肌纤维边界（由抗层粘连蛋白免疫染色指示）。 e.通过使用二元运算对话框来识别 IIA光纤，在 Cy5 和 FITC 通道之间创建了一个交集。 F。在 Cy5 和 TRITC 通道之间创建一个交叉点，使用二进制操作对话框来识别 IIB光纤。 G。使用二进制运算对话框在 Cy5 和 FITC 通道之间创建一个减法。使用新创建的减法和 TRITC 通道重复该步骤。检测到未染色的假定 IIX纤维。在步骤 e-g 之后，将生成的数据导出到 Excel 进行分析。

G.使用 Excel 和 GraphPad Prism 软件分析Feret 的平均最小直径和纤维百分比• 每个样品组的时间约为 15 分钟（协议 #1）
53.将包含 Nikon Elements 分析数据的新工作表添加到 Excel 文件。创建两个表，一个用于平均Feret最小直径 (FMD)，另一个用于纤维百分比。用纤维类型（IIA、IIB 和 IIX）标记列，用样品名称标记行。
54.要确定每个样品的每种纤维类型的 FMD，请从导出的数据中取Feret最小直径的平均值。通过平均先前记录的总面积数，还可以对每根光纤的横截面积 (CSA) 执行此分析。
55.要获得纤维的百分比，请从导出的数据中计算每个样本的每种纤维类型的纤维总数。将样本的纤维计数（IIA、IIB 和 IIX）相加，然后将单个纤维类型计数除以总和。将该数字乘以 100 以百分比形式显示数据。
56.和分析结果，方法是创建一个新的分组表，并选择“在并排子列中输入重复次数”。将每一列命名为样品组的名称，并用纤维类型标记每一行。重复次数对应于每个实验组的样本数。
57.复制Excel 文件中计算的平均 FMD 或纤维百分比数据，并粘贴到相应的数据表中。
58.将数据绘制为单个交错散点图，并使用具有标准偏差 (SD) 的平均值来测量变异性。
59.分析数据，以观察纤维尺寸或纤维百分比的显着变化。通过在多重比较选项卡下选择“在每一行内，比较列”来更改参数。

H.Feret最小直径数据的GraphPad Prism 进行直方图分析• 时间~20 分钟（协议#1）
60.打开 GraphPad Prism 软件并创建一个新的 Column 表，选择“输入重复值，堆叠成列”。将每一列命名为样品组的名称，并为每种其他纤维类型复制该表。
61.对于每根光纤和样品，从 Nikon Elements Excel 文件中复制所有 FMD 数据并粘贴到相应的数据表中。
62.使用分析功能，选择列分析下的频率分布选项。将参数更改为“相对频率（百分比）”并相应地调整 bin 宽度和范围。将结果绘制为交错条形图。
63.分析频率分布结果，在XY分析下选择非线性回归（曲线拟合）。在参数下，使用高斯方程，保持默认设置。也可以使用 Nikon Elements Excel 文件中的“面积”数据对光纤的 CSA 执行此分析。

I.C2C12 细胞培养• 大约数天的生长时间和大约 1 小时的细胞分裂时间（协议 #2）
64.在 37°C 和 5% (v/v) CO 2的 10% (v/v) FBS DMEM + GlutaMax培养基中培养细胞。当细胞达到 80% 汇合时，将它们分开，并准备转染板。
65.要分裂细胞，请从烧瓶中取出培养基，并用 1 × PBS 洗涤两次。
关键：避免将 PBS 直接添加到细胞中，因为它们可能会脱落并丢失。
66.使用 0.25% Trypsin-0.53mM EDTA (w/v) 在 37°C 下分离细胞 3 分钟。为确保分离，轻敲烧瓶的侧面，并在显微镜下观察。
67.通过将 10 mL 的 DMEM+10% (v/v) FBS 添加回烧瓶中来中和胰蛋白酶化。将细胞收集在 50 mL 锥形管中，以 2,000 × g离心细胞10 分钟。为了保持细胞生长，将 20 mL 的 10% FBS 培养基添加回烧瓶中，然后放入培养箱中。
68.离心后观察沉淀并吸出剩余的培养基。用 3 mL 的生长培养基重新悬浮颗粒，一次添加 1 mL，以确保适当的重新悬浮。
69.血细胞计数器的两个腔室中添加 10 μL 的重新悬浮细胞来计数细胞。在显微镜下可视化腔室的中心区域（1 mm 2 ），并用细胞计数器计数细胞。对血细胞计数器的两个腔室重复该步骤并平均两个计数。
CRITICAL：将平均计数乘以转换因子 10,000 或 10 4 个细胞。
70.根据要测试的 siRNA 的数量，准备适量的 6 孔细胞培养板。使用总细胞数, 计算悬浮液所需的体积, 以使每口井的最终浓度为 20,000 个细胞/mL, 总井体积为 2 mL。
关键：每个 siRNA 至少需要 3 个孔。还包括一个经过 siRNA 处理的板（每孔一个 siRNA），用于染色、成像和分析肌管直径大小。
71.准备 DMEM 生长培养基和重悬细胞的混合物，并在细胞培养板中加入适当的体积。在 37°C 下将板在 5% (v/v) CO 2中孵育。每隔一天更换一次生长培养基，注意不要分离细胞。
72.当成肌细胞达到 80 – 100% 汇合时，将 10% (v/v) FBS 生长培养基替换为 2% (v/v) HS 分化培养基，将细胞分化为肌管。
73.分化四天后，在 10% FBS 生长培养基中用 Ara-c 处理细胞两天，以杀死任何剩余的成肌细胞。治疗第一天 Ara-c 浓度应为 4.0 µg/mL，第二天为 0.4 µg/mL。

J.Myotube siRNA 转染• 时间约为 45 分钟（协议 #2）
74.在转染细胞之前，将 Opti-MEM 预热至 22°C，并在冰上解冻适当的 siRNA。计算总体积为 200 μL Opti-MEM、8 μL 的 Lipofectamine 2000 和 8 μL 的 50 μM siRNA 所需的试剂量。
关键：包括一个非靶向 (NT) siRNA 用作对照。 Opti-MEM、Lipofectamine 2000 和 siRNA 的混合体积可以根据板的大小进行调整。
75.将 8 μL 的 50 μM siRNA 稀释到 100 μL 的 Opti-MEM 中，并通过移液轻轻混合。重复此步骤，将 8 μL 的 Lipofectamine 2000 添加到 100 μL 的 Opti-MEM 中。将两种溶液混合，移液混合，孵育 10 分钟。
76.在潜伏期，取出准备好的 6 孔板上的介质，并添加 1.8 mL 的新鲜 10% (v/v) FBS 生长介质。
77.10 分钟后，将 200 μL 的转染混合物添加到每个孔中，并通过来回摇动板轻轻混合。将板与 5% (v/v) CO 2在 37°C 下孵育 48 小时。
78.24 小时后，将介质更改为无血清介质（含 1% P/S）。
79.要检查 siRNA 引起的击倒，请使用 Invitrogen TRIzol试剂和随附的协议在转染后 48 小时进行 RNA 提取。使用 mRNA 特异性寡核苷酸运行qRT -PCR，以量化 siRNA 靶向 mRNA 的击倒，使用 NT siRNA 处理的样品作为对照。

K.Myotub e 免疫染色和成像• 染色时间约为 4 小时，成像时间约为 1 小时（方案 #2）
80.在每毫升培养基中加入 1 mL 的 4% PFA，并在室温下孵育 10 分钟（最终 PFA 浓度为 2%）。
关键：将溶液添加到孔的一侧以避免提起细胞。出于同样的原因，固定溶液直接添加到细胞培养基中。
81.取出 PFA 溶液并用 1 × PBS 洗井 3 次。吸出剩余的 1 × PBS，并通过添加 1 mL 的 2% BSA 阻塞缓冲液（2% BSA Triton X-100）来阻塞井。让盘子在室温下轻轻晃动 1 小时。
82.封闭孔后，加入 300 µL 一抗溶液，在 4°C 下轻轻摇动板过夜。
83.第二天，去除抗体，用 1 × PBS 洗孔 3 次。在室温下加入 300 μL 的二级抗体溶液 2 小时，轻轻摇动。
84.× PBS清洗孔一次，然后用 1 mL 新鲜的 1 × PBS 替换并储存在 4°C，保护板免受光照，直到准备好成像。
暂停点：细胞可以在 PBS 中保留约 1 个月，但信号强度会下降。
使用可访问 532 nm 激光通道 (TRITC) 的荧光显微镜对板进行成像。使用 10 ×物镜，分别对每个孔进行成像以进行进一步分析。
关键：使用与刻度相同的物镜对血细胞计数器进行明场设置成像（图 5）。

图 5. siRNA 电穿孔进入 C2C12 成肌细胞和肌管的结果。
一个。用siGLO red转染的 C2C12 成肌细胞的代表性图像显示了荧光 siRNA 的细胞摄取，而在用非荧光 NT siRNA 转染的成肌细胞中没有观察到荧光。湾。将siGLO red 转染到 C2C12 肌管中也发现了类似的结果。 a-b 中的数据来自Hunt LC等人。细胞报告（2019 年）。

L.肌管直径测量•每张图像的时间约为 30 分钟（协议 #2）
86.打开 ImageJ。在测量肌管之前，打开血细胞计数器图像。使用直线工具，在血细胞计数器四个角的 25 个小方块（0.25 毫米）之一内画一条线。
87.分析下拉菜单中选择设置比例选项，并在“已知距离”框中输入正方形的大小为“250”，长度单位为“µm”。检查“全局”选项，然后按 OK。比例应为 0.648pixels/µm。
CRITICAL：所有图像都需要设置为相同的比例才能进行准确分析。
88.打开缝合的肌管图像并放大单个肌管。使用直线工具，在直径上绘制三条线，以指示每个肌管的开始、中间和结束。在每一行之后，从分析下拉菜单中选择测量选项。
89.重复此操作，直到测量到每组至少 50 个肌管。将测量数据导出到 Excel。
90.要确定肌管直径，请平均每个肌管的三个测量值。在 GraphPad Prism 或等效分析软件中绘制每个肌管的平均值，与对照相比。执行适当的统计测试以确定 siRNA 是否会引起肌管直径大小的显着影响（图 6）。

图 6. 使用 ImageJ 分析软件测定 C2C12 肌管直径。
一个。在ImageJ 中打开血细胞计数器图像以建立比例。湾。通过使用直线工具，在血细胞计数器四个角之一的 25 个小方块之一内绘制一条线。 C。从分析下拉菜单中选择设置比例选项，并分别输入 250 μm作为已知像素距离和单位。选择全局选项将比例设置为 0.648 像素/ μm 。 d。打开缝合的肌管图像。 e.放大单个肌管。通过使用直线工具，在肌管的两端和中间的肌管宽度上水平绘制三条线。 F。绘制每条直线后，从“分析”下拉菜单中选择测量选项。 G。至少测量 50 个肌管，并将数据导出到 Excel。每个肌管的三个测量值被平均以确定平均直径大小。

预期的结果。通过上面报告的分析，可以分析具有靶基因敲除的 TA 肌肉，以确定由此产生的对肌纤维大小和肌纤维类型组成的影响，还可以通过 RNA 测序和蛋白质印迹等后续应用确定 mRNA 和蛋白质变化洗涤剂可溶性和不溶性部分的分析（Rai等人，2021b；Hunt等人，2021a）。为了分析肌纤维大小，用抗层粘连蛋白抗体对肌肉冷冻切片进行染色，以描绘所有肌纤维的边界，并使用肌球蛋白重链异构体特异性抗体来识别 TA 肌肉中存在的不同肌纤维类型，即快速糖酵解2B 或 IIB 型肌纤维（MHC-2B-阳性）和更小、更具氧化性的 2A 型或 IIA 型肌纤维（MHC-2A 阳性）和 2X 或 IIX 型肌纤维（MHC-2A 阴性和 2B 阴性），如前所述完成（Hunt等人，2015、2021a、2021b）。通过这些分析，可以确定 siRNA 介导的 TA 肌肉中靶 mRNA 的敲低是否会导致肌纤维大小和不同肌纤维类型比例的变化（Hunt等人，2015、2021a、2021b）。在测量电穿孔 TA 肌肉中的肌纤维尺寸时，可以使用Feret 的最小直径，因为该几何参数能够可靠地测量肌纤维横截面积，不受冷冻切片引入的细胞变形的阻碍（布隆伯格和 Quadrilatero，2012 年）。类似地，与对照 NT siRNA 转染相比，对转染 siRNA 的培养的 C2C12 肌管大小的估计提供了洞察siRNA 靶向 mRNA 在肌管大小测定中是否具有一般作用[然而，肌纤维类型分析通常不在细胞中进行文化（黄等，2021 ）]。亨特等人。 2019 提供了一个类似结果的例子，在培养的 C2C12 肌管中敲除相同的蛋白质，并且在体内小鼠 TA 骨骼肌中：在这两种情况下，E3 泛素连接酶 UBR4 的敲低都会诱导肌纤维肥大（Hunt等人，2019）。
除了这些预期的结果之外，上面报告的协议可以与信息性抗原的免疫染色和额外的生化/分子测定相结合，以确定目标 mRNA 的急性敲低是否影响肌肉稳态的任何方面。这可以包括在研究与疾病相关的肌肉萎缩时估计肌纤维大小，以及确定与最佳肌肉功能或肌肉疾病相关的细胞器或标志物的丰度。除了确定细胞和分子特征外，还可以对电穿孔的 TA 肌肉进行功能分析，以确定靶向某些 mRNA 的 siRNA 是否会导致等长和强直力的相应变化（Hunt等人，2019、2021b）。
最后，这种方法可以克服其他技术方法的后勤限制。例如，肌肉减少症（即与年龄相关的骨骼肌质量和力量下降）的研究因获得所需基因型的老年小鼠所需的相对较长时间而受到阻碍。此处报告的将 siRNA 电穿孔到 TA 肌肉中的协议和优化条件可能有助于克服这一限制。具体来说，我们建议这种方法可以提供一种快速而稳健的方法，用于在老野生型小鼠的 TA 肌肉中实现靶基因敲低，从而在肌肉减少症的背景下快速评估基因功能。

食谱

试剂设置（方案 #1 和 #2）
1.10% 黄蓍胶
在 100 mL 蒸馏水中混合 10 mg 黄蓍胶。在 4 ° C下储存两周。
2.透明质酸酶原液
在 1 mL 的 1 × PBS 中混合 10 mg 透明质酸酶粉末。在 -20 °C 下储存长达 1 年。
3.透明质酸酶工作液
× PBS稀释原液至终浓度为 ±0.4 单位/ mL。在-20 °C 下储存长达 6 个月。
4.50 μM siRNA 原液
× siRNA 缓冲液中重悬 20 nmol siRNA，最终浓度为 50 μM 。在-20 °C 下储存长达 6 个月。
5.2% BSA 封闭缓冲液
× PBS中混合 0.4 克 BSA 粉末（2%（重量/体积）最终浓度）和 20 μL的 Triton X-100（0.1%（体积/体积）最终浓度）。在 4 °C 下储存长达 1 个月。
6.一抗染色液（冷冻载玻片）
× PBST中将一抗稀释至终浓度为 1:150 （对于 1.5 mL：1.5 mL PBS、1.5 μL Tween- 20、10 μL一抗）
7.二抗染色液（冷冻载玻片）
× PBST中稀释二抗至终浓度为 1:200 （对于 2 mL：2 mL PBS、2 μL Tween- 20、10 μL二抗）
8.10%胎牛血清(FBS)
将 50 mL 的 FBS 与 500 mL DMEM + GlutaMax介质混合。
9.2% 马血清 (HS)
将 10 mL 的 HS 与 500 mL DMEM + GlutaMax介质混合。
10.1% 青霉素/链霉素
将 5.55 mL 的 P/S 添加到 550 mL DMEM + GlutaMax血清培养基中。
11.4% PFA
用 1x PBS 稀释 16% PFA，最终浓度为 4%（4 mL 的 16% PAF 和 12 mL 的 PBS）。
12.一抗染色液（细胞培养肌管）
× PBST中将一抗稀释至 1:200 的最终浓度（对于 2 mL：2 mL PBS、2 μL Tween- 20、10 μL一抗）。
13.二抗染色液（细胞培养肌管）
× PBST中将二级抗体稀释至 1:400 的最终浓度（对于 2 mL：2 mL PBS、2 μL Tween- 20、5 μL二级抗体）。

致谢

BioRender绘制方案。用于鉴定肌纤维类型的抗 MHC 抗体获自Developmental Studies Hybridoma Bank。这项工作得到了国家老龄化研究所 (R01AG055532 和 R56AG63806) 对 FD 的研究资助。圣裘德儿童研究医院的研究得到美国黎巴嫩叙利亚联合慈善机构 (ALSAC) 的支持。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。作者贡献： AS 和 FD 撰写了手稿。 FAG 和 LCH 提供了反馈。所有作者都阅读并编辑了手稿。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有实验均按照联邦和地方法规进行。圣裘德儿童研究医院 (SJCRH) 动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准了执行的所有协议。动物被安置在美国田纳西州孟菲斯市 SJCRH 的动物资源中心的通风、温度控制设施中。

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