材料和试剂
纸巾
C57BL/6J 成年雄性或雌性小鼠，购自 Charles River，8-12周龄。在 12 小时光照/黑暗循环的光照阶段对动物进行测试，并且在测试时已单独饲养 ≥5天（见注 1）。无需预先训练或习惯。
70% 乙醇

设备

行为领域
一个直径92厘米的圆形竞技场，由5毫米厚的白色亚克力制成，中间有一个10厘米× 50厘米的矩形孔；和一个类似的直径为 92 厘米的圆形竞技场，其中没有孔，放置在有孔的平台下方（图 1）。
有障碍物的面板
50 厘米长× 10 厘米宽的面板，沿中心轴附有一个 50 厘米长× 12.5 厘米高的障碍物，由 5 毫米厚的白色丙烯酸制成（图 1）。
平板
相同的 50 厘米长× 10 厘米宽的面板（图 1B）。
站立以支撑升高的行为舞台， ≥ 20 厘米高
支架应稳定地支撑 92 厘米直径的竞技场，而不会伸出竞技场周边。例如，一个 62.5 厘米的立方体底座可以工作（图 1A）。
庇护所
10 厘米长× 10 厘米宽× 15 厘米高的透明红色丙烯酸立方体（对鼠标不透明）。它在前面包括一个老鼠洞形的入口（图 1）。
录影机
acA1300-60gmNIR，Basler，带有近红外选择性滤光片，位于行为舞台上方 1 m 处（图 1A）。
放大器（Topaz AM10，Cambridge Audio）和扬声器（L60， Pettersson ）连接到用于控制实验的计算机。
红外 LED 照明器（TV6700， Abus ；850 nm 光）分布在平台上方用于红外视频录制（我们使用六个照明器）。
声级计（城堡GA213）
听觉刺激声音文件（补充音频 1-2 ）。从 soundbible.com 下载了两种声音（“粉碎”和“噼啪作响的壁炉”）。然后在 Audacity 2.3.0 中对它们进行手动编辑，使它们的长度为 1.5 秒并持续响亮。
推荐：红外 LED（850 nm OSLON PowerStar IR LED），连接到来自放大器的听觉威胁信号，因此每当听觉刺激发生时，都会向摄像机闪烁红外光。
可选：一个大型隔音箱（160 厘米宽× 165 厘米深× 190 厘米高）。或者，用任何深色材料（如薄黑色塑料）环绕竞技场，至少高出竞技场高度 30 厘米，以减少环境暴露，从而减少老鼠的压力。
可选：投影仪 (BenQ) 和投影仪屏幕 (Xerox)。我们使用投影仪照亮舞台，因为我们也在同一舞台上进行视觉刺激实验。但是，用灯照亮竞技场就足够了。在实验期间，屏幕用5 cd m -2的均匀灰色光照亮（这测量来自投影仪的入射光进入投影仪屏幕）。在投影仪屏幕上切出一个矩形孔，并将摄像机和扬声器放置在该孔的正上方，在行为舞台中心上方 1 m 处。

图 1. 避难所 + 障碍物环境。
A.用于建造和记录的设备从掩体+障碍环境的相对位置示意图。 B.行为领域的俯视图。在障碍物去除实验中，障碍物面板被实验者替换为平板。建议的威胁区域（实际平台上没有明显标记）长 50 厘米，从平台的最右边延伸 15 厘米。 C.图片的平台，障碍物面板就位，鼠标从避难所中窥视。

软件

使用 Bonsai 2.4.1 编写的视频录制和自动刺激演示程序。在线鼠标跟踪基于比白色丙烯酸平台更暗的鼠标（示例代码可在 github.com/philshams/bonsai-behavior 获得）。
事后动物追踪，DeepLabCut （Mathis等人，2018）
分析管道是用 Python 3.8 ( https://github.com/philshams/behavior-opto-analysis )编写的

程序

在两组小鼠中进行两种类型的实验：基线逃生实验，其中在没有障碍物存在的竞技场中触发逃生，以及障碍物移除实验，其中小鼠在存在障碍物的竞技场中探索 20 分钟，和然后移除障碍物并触发逃生。我们建议在两组不同的小鼠中进行这些实验。如果有必要重复使用小鼠，请在实验会话之间留出 3-7 天。

设置和测试行为平台
将没有孔的亚克力竞技场放在支架顶部，将带有矩形孔的竞技场放在上面。障碍物清除实验：将有障碍物的面板放入孔中。基线逃逸实验：将平板放入孔中。
通过将声级计放在舞台周边，指向扬声器，通过头顶扬声器测试听觉刺激。确保它以 84 dB 的音量播放。
通过将黑色、鼠标大小的物体移动到威胁区域并确保触发听觉刺激来测试视频和自动刺激演示程序。
确保竞技场光线充足，让鼠标轻松看到并瞄准障碍物（~5 cd m -2 ；参见设备 12 和注释）
用 70% 乙醇擦拭竞技场、避难所和障碍物，然后在开始实验前至少等待 5 分钟。

以自发的探索期开始行为会议
将鼠标放置在赛场中的一致位置，例如，在障碍物和避难所之间，并启动行为程序。老鼠被尾巴的底部捡起来，当它们被放置在竞技场上时，一只手支撑着它们的身体。以前对小鼠的处理仅限于常规畜牧业。
鼠标应在前 7 分钟内自发进入避难所，此后将其视为其首选位置。如果这种情况没有持续发生，请参阅下面的注释以获得帮助。
障碍清除实验：让鼠标自发探索竞技场共 20 分钟。基线逃逸实验：让鼠标自发探索竞技场共 7 分钟。
在整个会话过程中：如果鼠标 5 分钟未离开避难所或 10 分钟未进入威胁区域，则将一撮 (1 g) 的垫料从其家笼中散布在威胁区域，每次最多一次会议。

障碍物移除实验：移除场地障碍物
20分钟后，鼠标一进入避难所，悄悄抬起并移除障碍板，换上平板。如果这不是偷偷做的，它可能会吓到老鼠，导致它在实验的大部分时间里呆在庇护所里。细节将取决于实验室的布局，但通常，这应该在 15 秒内完成。如果在面板切换已经启动后鼠标开始离开避难所，我们建议冷静地完成切换。

触发听觉威胁刺激
使用自动化软件程序（我们在 Bonsai 中使用自定义软件）在线跟踪鼠标位置并在以下条件下触发威胁刺激：鼠标当前处于威胁区域，鼠标在 1.5 秒前处于威胁区域，并且鼠标在避难所的相反方向上具有正速度。
威胁刺激由 1.5 秒的声音组成，自动重复播放，直到鼠标进入避难所 20 厘米以内，或最多 9 秒。每隔一次试验交替发出“碰撞”声音和“粉碎”声音（补充音频 1-2 ），以防止刺激习惯。
如果鼠标在刺激期间没有成功逃脱，则将刺激音量增加 2 dB，最高可达 88 dB。
在一小时或六次成功的逃脱试验后结束实验，以先到者为准。

数据分析

事后跟踪
使用DeepLabCut跟踪视频中每一帧的鼠标位置。我们发现，对多个被跟踪的身体部位进行平均会导致更稳健的跟踪。具体来说，我们平均 13 个点：鼻子、左眼、右眼、左耳、右耳、颈部、左上肢、右上肢、上背部、左下肢、右下肢、下背部和尾基。但是，鼠标颈部或上背部区域的单个点也可以。
计算视频中每一帧的鼠标速度及其相对于避难所位置的速度，将其转换为 cm s -1 ，并使用高斯滤波器（σ = 100 ms ，长度 = 800 ms ）平滑这些数据。

逃生目标得分和轨迹分类
要量化逃生轨迹，请计算“初始逃生目标分数”（图 2）。这是一个直接指向避难所的向量接收值为 0 的度量；瞄准任一障碍物边缘的一个接收值为 1.0；介于这些分数之间的向量 0.5；并且指向边缘之外的向量接收大于 1.0 的值。初始逃生目标是通过在鼠标位于障碍物前方 10 厘米时获取鼠标的位置并比较后一个位置与它直接朝避难所或障碍物边缘逃逸时的位置之间的偏移量来计算的。这计算为

score=(|offset_HV-offset_EV+offset_(HV-EV) |)/(2*offset_(HV-EV) )

其中偏移HV是鼠标到鼠标起始位置和避难所之间的线（图 2 中的“避难所方向”线）的距离；偏移量EV是鼠标到鼠标起始位置和障碍物边缘向量之间的线的距离（图 2 中的“边缘方向”线）；偏移量HV -EV是从掩蔽方向线到边缘方向线的距离（图 2）。如果逃生路径偏离归位矢量路径的左侧，则左侧障碍物边缘用于计算偏移量EV和偏移量HV -EV （反之亦然）。每个收到分数的数据点对应一个逃生路线。
要将逃逸分类为边缘矢量或归巢矢量，请使用在没有障碍物的环境中逃逸的一组老鼠的分数的第 95个百分位来阈值初始逃生目标分数。在我们手中，这个值为 0.65。在子目标学习组中预期 40 – 60% 的边缘向量响应。
如果鼠标直接跑向避难所或障碍物边缘，计算鼠标会在哪里需要首先确定逃生起始点。对于逃生开始的简单测量，使用鼠标相对于（朝向）避难所位置超过 20 cm s -1的速度的点。这是通过计算鼠标与避难所距离的逐帧差异来计算的。关键是使用一个近似于逃生开始的度量，但不包括有时在威胁发作之后但开始逃生之前发生的非逃生运动。

统计置换检验
使用非参数置换测试为执行了更多逃生试验的小鼠赋予更多权重，同时仍随小鼠数量缩放自由度。替代测试在这里效果不佳：在 t 检验或 Mann-Whitney 检验中使用每个试验的数据将不正确地随试验次数缩放自由度，并且使用重复测量 ANOVA 会强加高斯噪声假设数据不太可能跟随。要测试 A 组和 B 组是否具有不同的执行边缘向量转义的倾向，请使用组的平均合并边缘向量概率中的有符号差异作为测试统计量（即，B 组边缘向量 - A 组边缘向量）。通过随机打乱每只老鼠的组标签来生成这个值的空分布（即，在每次打乱中，所有给定老鼠的逃生试验都分配给A组或B组）。然后，找出均值的实际差异在该分布中所占的百分位数——这是假设 B 组比 A 组具有更多边向量的 p 值。

附加参数
数据排除：排除成功逃脱试验为零的小鼠。
复制次数：每种条件使用 8-14 只小鼠。

图 2. 对逃生轨迹进行分类。
初始逃生目标使用障碍物前方 10 厘米处的鼠标位置（灰点和绿点），在 0（从逃生起始点到避难所的直接路径）和 1（从逃生起始点到障碍物边缘的直接路径）之间进行归一化地点）。逃生启动（顶部的鼠标轮廓）是鼠标相对于避难所的速度超过 20 厘米/秒的地方。虚线表示在 20 分钟探索期间障碍物所在的位置。 A.归航向量逃逸响应，初始逃逸目标为 0.53。这小于阈值 0.65，此时逃逸点被分类为边缘向量。 B.边缘向量逃逸响应。 C.用于计算逃生目标分数的偏移距离的特写。 Offset EV （绿色）是鼠标到边缘矢量线的距离。偏移HV （灰色）是鼠标到归位矢量线的距离。 Offset HV -EV （蓝色）是连接边缘向量和归位向量线的线的长度，约束条件是这条线必须通过障碍物前面 10 cm 处的两个向量的平均值（即，它必须通过对应于逃生目标分数 0.5 的点）。图改编自Shamash 和 Branco (2021 ) 。

笔记

有一个关键的“维度”，老鼠的行为往往会因人而异：庇护所休息与积极探索。就产生足够的逃生试验而言，这两个极端都可能存在问题。留在避难所的老鼠可能永远不会进入威胁区。另一方面，喜欢探索而不是躲在避难所的老鼠可能无法响应威胁刺激而逃到避难所。例如，群体饲养的小鼠探索更多，但可能无法对威胁刺激的多次试验做出反应，而单独饲养的小鼠探索较少，但对威胁刺激的反应更一致。促进庇护所休息的其他因素包括：从鼠笼中添加一小撮床上用品到庇护所，增加背景照明，以及在多个行为会话中使用鼠标。促进探索的因素包括：在威胁区域添加少量垫料、减少背景照明、在明暗循环的黑暗阶段进行实验、使用限制食物的小鼠和使用年轻（7-8周大）小鼠。

致谢

我们的实验室使用该协议来评估最近两篇出版物（Shamash 和 Branco，2021；Shamash等人，2021）中的子目标学习。这项工作得到了Wellcome高级研究奖学金 (214352/Z/18/Z) 和Gatsby Charitable Foundation 和Wellcome (090843/F/09/Z) (TB)的 Sainsbury Wellcome中心核心资助和 Sainsbury Wellcome的支持中心博士项目。我们感谢 R. Vale 和 Branco 实验室的其他成员在开发该检测时提供的帮助；和 J. Aloor对手稿发表评论。

利益争夺

作者声明不存在任何冲突和/或竞争的利益。

伦理

惠康中心动物福利伦理审查机构的当地伦理批准后进行。

参考

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Mathis, A., Mamidanna , P., Cury , KM, Abe, T., Murthy, VN, Mathis, MW 和Bethge , M. (2018)。 DeepLabCut：使用深度学习对用户定义的身体部位进行无标记姿态估计。 Nat Neurosci 21（9）：1281-1289。
Shamash, P., Olesen, SF, Iordanidou , P., Campagner , D., Banerjee, N. 和 Branco, T. (2021)。老鼠通过记忆子目标位置来学习多步路线。 Nat Neurosci 24（9）：1270-1279。
Shamash, P. 和 Branco, T. (2021)小鼠通过动作驱动的映射过程识别子目标位置。预印本。神经科学。
Sharma, S.、 Rakoczy , S. 和 Brown-Borg, H. (2010)。评估小鼠空间记忆。生命科学87（17-18）：521-536。
Tolman, EC 和Honzik , CH (1930)。奖励的引入和去除，以及大鼠的迷宫表现。加州大学心理学出版物4：257-275。
Vale, R.、Evans, D. 和 Branco, T. (2018)。研究空间记忆在小鼠本能防御过程中的作用的行为分析。 J 可见指数(137)： 56988。
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