材料和试剂
1. 96 孔板（印度Tarsons产品）
2. 50 mL 离心管（印度Tarsons产品）
3. 1.5/2 mL 管（印度Tarsons产品）
4. 拟南芥基因型 Col-0的根样本
5. 双蒸水
6. 普朗顿盒（ Tarsons产品，目录号：020080，尺寸：75 × 75 × 100mm）
7. 次氯酸钠（ NaOCl ）（ Himedia Laboratories，目录号：PCT1311-5X50M）
8. 氯化钙（CaCl 2 ）（ Himedia Laboratories，目录号：PCT0004-500G）
9. 氯化铝（AlCl 3 ）（Merck，目录号：8010810100）
10. 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）（Sigma-Aldrich，目录号：NAD100-RO-1G）
11. 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢（NADH）（Sigma-Aldrich，目录号：10107735001-500MG）
12. 七水硫酸镁（MgSO 4 · 7H 2 O）（ Himedia Laboratories，目录号：RM684-5KG）
13. 五水合硫酸锰（II）（MnSO 4 · 5H 2 O）（ FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation ，目录号：139-00825）
14. 硫酸亚铁（FeSO 4 · 7H 2 O）（ Himedia Laboratories，目录号：GRM3917-500G）
15. 七水合硫酸锌（ZnSO 4 · 7H 2 O）（ Himedia Laboratories，目录号：PCT0118-1KG）
16. 五水合硫酸铜（II）（CuSO 4 · 5H 2 O）（ Himedia Laboratories，目录号：RM630-500G）
17. 硝酸钾（KNO 3 ）（ Himedia Laboratories，目录号：RM1401-500G）
18. 硼酸（H 3 BO 3 ）（ Himedia Laboratories，目录号：MB007-1KG）
19. 无水磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）（ Himedia Laboratories，目录号：MB183-500G）
20. 四水合钼酸铵（(NH4) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：431346）
21. 六水合氯化钴（II）（CoCl 2 · 6H 2 O）（ Himedia Laboratories，目录号：PCT0103-500G）
22. EDTA，二钠盐水合物（Na 2 EDTA）（Sigma-Aldrich ，目录号：E5134）
23. 硝酸钠（NaNO 3 ）（ Himedia Laboratories，目录号：GRM1184-500G）
24. 磷酸二氢钠二水合物（NaH 2 PO 4 · 2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：71505）
25. 磷酸氢二钠十二水合物（Na 2 HPO 4 · 12H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：71649）
26. 氯化钙二水合物（CaCl 2 · 2H 2 O）（ Himedia Laboratories，目录号：MB034-500G）
27. 氢氧化钠颗粒（NaOH）（ Himedia Laboratories，目录号：MB095-500G）
28. 盐酸（HCl）（ Himedia Laboratories，目录号：AS004-2.5L）
29. Tris碱基（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
30. Bicine（Sigma-Aldrich，目录号：B3876）
31. 3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2H-溴化四唑（MTT）（Sigma-Aldrich，目录号：1.11714-1G）
32. 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓甲基硫酸盐（1-甲氧基PMS）（Sigma-Aldrich，目录号：M8640-100MG）
33. 酒精脱氢酶（ADH），来自酵母（Sigma-Aldrich，目录号：A7011）
34. 0.2 M NaOH 溶液
35. 改进的 MGRL 解决方案（见配方 1）
36. Bicine/NaOH 缓冲液（见配方 2）
37. 1 M Tris-HCl（见配方 3）
38. 10 M 乙醇（见配方 4）
39. 80 mM EDTA-2Na（见配方 5）
40. ADH 溶液（见配方 6）
41. 反应混合物（见配方 7）
42. NAD 标准（见配方 8）
43. NADH 标准（见配方 9）

设备

1. 天平 ( Sartorious , 0.1 mg – 220 g)
2. 移液器/多道移液器（Gilson、 Piettman 、2-2020-200 和 100 – 1000 µL）
3. pH计（pH Tutor、 Eutech Instrument）
4. 离心机（ Eppendorf 5424 微型离心机）
5. 带热板的磁力搅拌器（印度Tarsons产品）
6. 微型研杵（印度Tarsons产品）
7. 高压灭菌器（ Equitron ， Equitron Medica Pvt. Ltd.，印度）
8. 水浴（ Equitron 非搅拌水浴， Equitron Medica Pvt. Ltd.，印度）
9. pH 试纸（ Himedia Laboratories，印度）
10. 微量滴定板阅读器（SUNRISE 微孔板阅读器，TECAN）
11. 尼龙网（100 µM 孔径）
12. 富士胶片塑料卡口，35 毫米（日本富士照片有限公司）

程序

1. 在 1.5 mL 离心管中用 1% 次氯酸钠对可行的拟南芥种子进行表面消毒 3 分钟，并在蒸压蒸馏水中冲洗五次。在层流罩内执行所有程序以避免污染。将冲洗过的种子保持在 4°C，以便在黑暗条件下进行春化。 2 天后，将春化种子放在安装在 Fujifilm 塑料支架上的尼龙网上，让它们在无菌条件下漂浮在已填充改性 MGRL 溶液（配方 1）的Planton盒上，温度为 20 ± 2°C，用光周期为 14 h，光子通量密度为 220 μmol m -2 sec -1 (PAR)。 5天后，用一只手倒出改性的MGRL并用处理溶液（含有100 μM C aCl 2 ，pH 5.0的10 μM AlCl 3溶液）代替；更换溶液时，使用镊子将 Fujifilm 塑料支架与承载幼苗的网状物保持在一起。在处理开始后 6 和 12 小时采集样品（全植物组织）用于氧化还原池测定（图 1）。
2. 在 1.5 mL 离心管中用微杵在液氮中研磨样品（全植物组织，100 mg），然后用 1 mL 0.2 N HCl 提取。将匀浆在 16,000 × g和 4°C 下离心 10 分钟；制作多个等分的上清液（每个 0.2 mL）用于重复。

图1。在 MGRL 水培溶液上无菌条件下生长的拟南芥植物。

3. 对于 NAD+ 测定，将 0.2 mL 提取物在沸水 (98–100°C) 中孵育 1 分钟，然后快速冷却并加入 20 µL 0.2 M NaH 2 PO 4 (pH 5.6) 中和，然后加入逐步添加 0.2 M NaOH 等分试样。每次添加后涡旋样品并用 pH 试纸检查 pH。最终的 pH 值应介于 5 和 6 之间，这需要大约 0.16 mL 的0.2 M NaOH。
4. 要测量 NADH，请提取叶样品与 NAD +相同，但使用 0.2 M NaOH 作为萃取介质，并用 0.2 N HCl 中和加热的上清液等分试样，使所有样品的最终 pH 值为7 – 8。这需要大约 0.14 mL 的 0.2 N HCl。每次添加后涡旋样品，并用 pH 试纸验证 pH。
5. 制备酶反应混合物如下：
a. 在单独的试管中加入 MTT 和 1-甲氧基 PMS 并溶解在水中（在室温下制备这些溶液）（参见配方 7）。
b. 在 50 mL 离心管中加入 2 mL 的 1 M Bicine/NaOH 缓冲液、0.4 mL 的 1 M tris、1 mL 的 80 mM EDTA 和 1 mL 的 10 M 乙醇（参见配方 7）。
c. 将溶解的 MTT 和 1-甲氧基 PMS 添加到 50 mL 离心管中，将最终体积调整至 20 mL，并在 25°C 的水浴中孵育直至进一步使用（参见配方 7）。该溶液将作为反应混合物。
d. 准备 ADH 溶液并将其放在冰上（参见配方 6）。
e. 将 40 μL每个标准样品（NAD +参见配方 8 ，NADH 参见配方 9）、植物样品（NAD +来自步骤 3和 NADH 来自步骤 4）和空白样品（40 μL水）加入 96 孔盘子。
f. 将 ADH (4 µL) 添加到反应混合物 (156 µL) 中并轻轻混合。
g. 在 96 孔板的每个样品孔中加入 160 μL 的酶反应混合物，并立即使用微量滴定板读取器测量吸光度。
h. 将测量吸光度的参数设置为：测量滤光片，570 nm；和动力学，以 1 分钟间隔进行 10 次测量，每次读数前摇动 5 秒。
i. 绘制 NAD +和 NADH 的标准图，并进一步评估植物样本内容（图 2）。

图 2。 NAD +的标准曲线 (A)和 NADH (B) 。在 570 nm 处测量吸光度。

数据分析

所有分析和绘图均使用 Microsoft Office Excel 2016 电子表格完成。每个实验重复三次，提供的数据是平均值±标准误差 (SE)。使用单因素方差分析测试显着性。进行Duncan的多范围检验 (DMRT) 以在一组实验之间进行比较（图 3）。

图 3。拟南芥 WT (Col-0) 根样品中 NAD +和 NADH含量及其比例的示例。
+和 NADH 及其比率进行绝对定量。值是三个独立实验的平均值 ± SE (n = 3)。根据 Duncan的多重范围检验，相同字母表示的平均值在 P < 0.05 时差异不显着。

食谱

1. MGRL解决方案
先生号化学成分解决方案
库存浓度解决方案
最终浓度制备 1 L 溶液所需的体积，pH 5.8
1 MgSO 4 · 7H 2 O 0.15 M 0.03 毫米 200 µL
2 Mn SO 4 · 5H 2 O 1.03 毫米 0.206 µM 200 µL
3 FeSO 4 · 7H 2 O 0.86 毫米 0.172 µM 200 µL
4 ZnSO 4 · 7H 2 O 0.1 毫米 0.02 µM 200 µL
5 CuSO 4 · 5H 2 O 0.1 毫米 0.02 µM 200 µL
6 硝酸钾3 0.3M 0.06 毫米 200 µL
7 H 3硼3 3.0毫米 0.6 µM 200 µL
8 (NH4)6Mo 7 O 24 · 4H 2 O 2.4微米 0.48纳米 200 µL
9 CoCl 2 · 6H 2 O 13微米 2.6纳米 200 µL
10 Na 2 EDTA 6.7 毫米 1.34 微米 200 µL
11 NaNO 3 0.4M 80微米 200 µL
12 Na-PO 4 (pH 5.8)
NaH 2 PO 4 · 2H 2 O
Na 2 HPO 4 · 12H 2 O
0.175 M
0.175 M
0.035 毫米
0.035 毫米 200 µL
13 CaCl 2 · 2H 2 O 1M 200微米 200 µL
根据样本量和植物种类准备足量的营养液；将 pH 值调至 5.8。

2. 1 M Bicine/NaOH (pH 8.0) 缓冲液
a. 将 16.317 g Bicine (MW = 163.17 g/mol]) 溶解在 75 mL 蒸馏水中
b. 使用 10 N NaOH 调节至 pH 8.0
c. 2 O填充至 100 mL 的最终体积
d. 过滤灭菌（推荐）或高压灭菌
e. 储存于 4 °C

3. 1 M Tris-HCl
a. 将 12.1 g Tris Base (TRIZMA) 溶解在 70 mL 蒸馏水中，加入浓 HCl 至 pH 8.0
b. 用蒸馏水填充至体积 1 L
c. 在室温下储存。

4. 10 M 乙醇
制备该溶液时，取 58.4 mL 无水乙醇，用蒸馏水补足 100 mL。

5. 80 毫米 EDTA-2Na
a. 将 29.77 g Na 2 EDTA 溶解在 80 mL 蒸馏水中并用 NaOH 将 pH 值调节至 8.0
b. 用蒸馏水将体积调整至 100 mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，并在 4 °C下储存以延长储存时间。
c. 通过添加 NaOH 将溶液的 pH 值调节至 8.0，以完全溶解 Na 2 EDTA。

6. ADH 解决方案
将 8 mg ADH 添加到 1.5 mL 管中，并溶解在 1 mL 的 bicine/NaOH 中。溶解后，立即置于冰上备用。

7. 反应混合物制备
化学成分全部的 20 毫升最终浓度
MTT 毫克 3.48（溶于 6 mL 水中） 0.42 毫米
1-甲氧基经前综合症毫克 3.72（溶于 6 mL 水中） 0.55 毫米
1 M Bicine/NaOH 毫升 2 0.1M
1 M Tris 毫升 0.4 20毫米
80 毫米 EDTA-2Na 毫升 1 4毫米
10 M 乙醇毫升 1 0.5M
H 2 O ( MilliQ ) 毫升 3.6

8. NAD标准：NAD +标准
标准曲线（ pmol /mL）空白的 50 100 150 200 250 300 350 400
1 µM NAD + (µL) 0 5 10 15 20 25 30 35 40
H 2 O ( MilliQ ) (µL) 100 95 90 85 80 75 70 65 60
从每个浓度中取 40 μL 的样品。

9. NADH标准：NADH 标准
标准曲线（ pmol /mL）空白的 10 20 40 60 80 100 120 140
100 nM NADH (µL) 0 10 20 40 60 80 100 12（1 µM 库存） 14
H 2 O ( MilliQ ) (µL) 100 90 80 60 40 20 0 88 86
从每个浓度中取 40 µL 样品。

致谢

该协议改编自Hampp 等。（1984）和泷田等。 (1999)。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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3. Dutilleul , C., Garmier , M., Noctor , G., Mathieu, C., Chetrit, P., Foyer, CH 和 de Paepe , R. (2003)。叶线粒体调节全细胞氧化还原稳态，设置抗氧化能力，并通过改变信号和昼夜调节来确定抗逆性。植物细胞15（5）：1212-1226。
4. Dutilleul , C., Lelarge , C., Prioul , JL, De Paepe , R., Foyer, CH 和Noctor , G. (2005)。线粒体驱动的叶片 NAD 状态变化对硝酸盐同化的控制和碳和氮代谢的整合产生了至关重要的影响。植物生理学139（1）：64-78。
5. 门厅，CH 和Noctor ，G.（2005 年）。氧化还原稳态和抗氧化信号：压力感知和生理反应之间的代谢界面。植物细胞17（7）：1866-1875。
6. Hampp , R.、 Goller , M. 和Fullgraf , H. (1984)。通过燕麦叶肉原生质体的快速分馏和酶循环相结合来确定分隔的代谢物池。植物生理学 75（4）：1017-1021。
7. Mittler , R., Vanderauwera , S., Gollery , M. 和 Van Breusegem , F. (2004)。植物的活性氧基因网络。趋势植物科学9（10）：490-498。
8. 穆勒，IM (2001)。植物线粒体和氧化应激：电子传递、NADPH 周转和活性氧物质的代谢。 Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52：561-591。
9. Takita , E.、Koyama, H. 和 Hara, T. (1999)。利用胡萝卜 ( Daucus carota L.)细胞中的有机酸代谢。植物和细胞生理学40（5）：489-495。