材料和试剂

1. 聚丙烯开口超速离心管（Beckman Coulter，目录号：326823）
2. Nalgene Rapid-Flow 无菌一次性真空 0.2 µm过滤器 500 mL 装置（Thermo Fisher，目录号：566-0020）
3. Amicon超离心过滤器Ultracell 10,000 MWCO（Millipore Sigma，目录号：UFC801024）
4. 注射器过滤器，聚醚砜（PES）膜，0.22 µm（ GenClone ，目录号：25-244）
5. Greiner Bio-One CellStar μClear 96孔，细胞培养处理，平底微孔板（Greiner Bio-One，目录号： 655090）
6. 目录'; DiIC18(7) (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindotricarbocyanine Iodide) （Thermo Fisher Scientific，目录号：D12731）
7. Pierce 蛋白酶抑制剂片剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：A32963）
8. 1 × Dulbecco 's磷酸盐缓冲盐水（DPBS），含钙和镁（Thermo Fisher Scientific，目录号：14040117）
9. OptiMEM I 减少血清培养基，无酚红（Thermo Fisher，目录号：11058021）
10. 磷酸盐缓冲盐水（PBS，1 × ），无菌过滤（Thermo Fisher，目录号：J61196.AP）
11. DAPI 溶液（1 mg/mL，Thermo Fisher，目录号：62248）
12. Pierce 蛋白酶抑制剂片剂，不含 EDTA（Thermo Fisher，目录号：A32955）（参见食谱）
13. MicroBCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher，目录号：23235）
14. 含有去除外泌体的胎牛血清 (FBS) 和青霉素/链霉素的培养基（参见食谱）
15. NanoSight量化的对照样品（参见配方）
16. 蛋白酶抑制剂混合物 (PI) ，不含 EDTA（参见食谱）

设备

1. 带有 SW 32 Ti摆桶转子（Beckman，目录号：369650）的 Optima XPN-90 IVD 超速离心机（ Beckman，目录号： B10052 ）
2. Sorvall Legend Micro 21R 微量离心机（Thermo Scientific，目录号：75002447）
3. Cytation 5 多模式阅读器（Agilent，目录号：BTCYT5V）
4. NanoSight LM10（Malvern Panalytical ，目录号：EOS3085）

软件

1. GraphPad Prism 9（GraphPad 软件）
2. Gen5 软件（安捷伦）

程序

DiR染料标记的总体方案如图 1 所示。

图 1. EV 纯化和DiR 标记的实验装置。
A. EV 纯化和标记方案。 B. EV 用DiR或类似的荧光染料标记。

A. 细胞培养条件培养基的收集
1. 在收集上清液前大约 30 分钟，将超速离心机和台式冷冻离心机设置为 4°C。在收集细胞培养基之前准备一个装有冰的桶（条件细胞培养基；有关培养基示例，请参阅食谱）。
备注：
a. 在所有步骤中使用无菌试剂和适当的无菌技术以避免污染。
b. 在装入试管之前，建议将转子和试管冷藏。
2. 在所需时间（如 24 小时）收集 15 mL 的条件细胞培养基。将 1% (v/v) 的蛋白酶抑制剂鸡尾酒 (PI) 添加到条件培养基中。
3. 在 500 × g和 4°C 下将培养基离心 10 分钟，以去除细胞。小心地将上清液倒入无菌离心管中——可以使用 25 mL 血清移液器。
4. 在 4,000 × g和 4°C 下离心上清液 10 分钟。小心地将上清液倒入新的无菌离心管中。
5. 以 16,000 × g和 4°C 离心上清液 30 分钟。小心地将上清液倒入新的无菌离心管中。
6. 过滤消毒到新的无菌离心管中。

B. 方向标记
1. DiIC18 (7) (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindotricarbocyanine Iodide) ( DiR ) 库存。
2. 从上述步骤,将适当体积的DiR库存添加到过滤的上清液中，以达到 5 μM 的最终浓度。通过移液混合。
3. 在室温 (RT) 下在黑暗中将,DiR与过滤的上清液一起孵育30 分钟，每 5 分钟轻轻倒置一次。

C. 小型电动汽车的净化
1. 通过对水桶、离心管和镊子（用于从水桶/转子中取出超速离心管）进行紫外线照射，对用于超速离心的物品进行消毒至少 30 分钟。
2. 将超离心管填充到大约 37 mL的体积。
注意：当没有足够的上清液填充管时，用无菌 PBS 填充体积的平衡。如果超速离心管没有装满并且没有正确平衡，则超速离心管可能会塌陷。
3. 称量桶，记下重量，使相对的桶保持平衡。相对的铲斗应在 0.01 g 范围内。
4. 在 BSL-2 机柜或洁净工作台中，为了使试管不被污染，必要时将 PBS 添加到桶中较轻的试管中以平衡离心机转子。
5. 将装有样品的转子转移到超速离心机中，将上清液在 100,000 × g和 4°C 下离心 3 小时。
6. 对于离心步骤，在无菌条件下小心倒出并丢弃上清液。使用带有无菌尖端的微量移液器去除在管尖端形成但不会脱落的液体。
注意：小心不要污染试管。在这一步中，游离的DiR与倾析的上清液一起消失，因此可以倾析溶液，但始终注意不要丢失颗粒。
7. 将 400 μL (360 μL) PI 添加到每个管中，并通过上下轻轻吹打来重新悬浮颗粒。在每管中加入约 36.5 mL (35 mL) 的 PBS。
8. 称量桶，并适当添加 PBS 以平衡转子至 0.01 g 的精度。
9. 在 100,000 × g和 4°C 下离心 18 小时。非常小心地倒出上清液，并用移液器去除唇部残留的液体。
10. 在 PBS 中用 100–150 μL PI（蛋白酶抑制剂鸡尾酒）重新悬浮颗粒（参见食谱）。轻轻吸管上下溶液。使用尖端轻轻刮擦管底部，以重新悬浮囊泡。如果需要，将所有样品合并到一个微量离心管中。
11. Amicon Ultra 4 中用 10,000 MWCO清洗DiR标记的外泌体，以去除游离的DiR。将样品添加到Amicon Ultra，并使用 PBS 补充 1% (v/v) PI 使体积达到 4 mL 总体积（即，如果需要 2 mL 以达到 4 mL 总体积，则添加 2 mL PBS 和20 µL PI)。
12. Amicon Ultra 中以 4,000 × g离心DiR标记的外泌体（在摆动斗式转子中，如果使用固定角度转子，请检查× g限制），4°C，间隔大约 3 分钟。检查体积，并确保顶部腔室不会干涸，因为那是 EV 所在的位置。将体积减少到大约 250–400 µL。丢弃下室滤液并继续下一步。
13. 通过轻轻吹打并使用尖端从腔室中收集尽可能多的液体，将上腔室中含有DiR标记的外泌体的样品转移到新鲜的离心管中。一些游离的DiR可能被视为不溶性沉淀。
14. DiR标记的外泌体中去除沉淀的游离DiR染料，请将样品在 16,000 × g和 4°C 下离心 20 分钟。将上清液轻轻移至新鲜的微量离心管中。
注意：在这个阶段，上清液可能只出现非常浅的蓝色到蓝色。
15. 使用微型 BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher）进行蛋白质浓度测定。使用纳米颗粒表征系统（例如NanoSight LM10）对颗粒进行计数。

D. 进行 EV 吸收实验
1. 在细胞摄取实验的前一天准备一个 96 孔板的细胞，融合度为 70%。所需的汇合度可能取决于所使用的细胞类型。
2. 通过纳米粒子跟踪分析（如NanoSight ）确定 EV 浓度，为细胞摄取实验准备标准化数量的 EV。
3. 的无血清OptiMEM中制备 2e 7 EV（2e 6 /mL EV）的 10 mL 溶液，用于细胞。
4. 从 96 孔板上生长的细胞中取出培养基，并用无菌 1 × PBS 洗涤两次。
5. 在 96 孔板中的每个孔中添加 100 μL 的 2e 6 /mL EV 的制备溶液，该溶液在含有适当抗生素的无血清OptiMEM中。
6. 作为DiR标记的外泌体的对照，除了标记的外泌体样品外，还可以使用5 µM DiR在OptiMEM中的 500 µL 溶液。
7. 2和 37°C 每 2 小时的 Cytation5 仪器可在 24 小时内对细胞进行成像。参见图 2 和图 3，其中使用了 L442 小鼠衍生淋巴细胞。
8. 活细胞摄取成像完成后，可将细胞用 4% PFA（多聚甲醛）在室温下固定 15 分钟，然后用 DAPI 在室温下避光染色 10 分钟以计数 DAPI 对象，并归一化EV 计数到 1,000 个细胞。
9. 使用 Microsoft Excel 和 GraphPad Prism 进行数据和统计分析。

图 2. EV 吸收实验的实验装置。

图 3. 量化细胞中 EV 的丰度。
(A)根据 Cytation5 中的特定参数，在 24 小时内每 1,000 个细胞检测到标记的外泌体丰度。在 96 孔板上制备 L442 小鼠淋巴细胞的三个复制品，并在添加外泌体之前生长至 70% 融合。将特定的无血清OptiMEM和抗生素添加到细胞中，每毫升含有 2e 6 个标记的外泌体。细胞在 10倍放大倍率下使用明场和 CY7 荧光滤光片成像，每 2 小时至 16 小时时间点，然后每 4 小时至 24 小时。完成 24 小时读数后，用 4% PFA 清洗和固定细胞，并用 DAPI 染色，使外泌体计数标准化为 1,000 个细胞。此处的图表显示了 L442 小鼠淋巴细胞 (GraphPad Prism) 三个孔中的平均外泌体丰度。 (B) L442 小鼠淋巴细胞中荧光外显子在 12 小时时间点的代表性图像。 (C)在 Cytation5 软件中特异性检测到的外泌体细胞摄取外泌体的完全处理图像以黄色边框突出显示。为每个孔采集、预处理、解卷积和缝合的 10倍放大图像的 3 × 3 区域。

食谱

1. 含有去除外泌体的胎牛血清 (FBS) 和青霉素/链霉素的培养基
在 BSL-2 柜中，制备 500 mL 的OptiMEM ，其中含有 3% (v/v) 外显子耗尽的 FBS，以及 1% (v/v) 的青霉素/链霉素抗生素溶液。然后可以通过真空过滤器对培养基进行无菌过滤，并在使用前将其储存在 4°C。

2. NanoSight定量对照样品
可以使用带有 1% (v/v) PI 的DiR和 PBS 制备对照。
从 2.5 mg/mL 的库存DiR ，在 PBS 和 PI 溶液中制备 5 μM 稀释液，然后在室温下在黑暗中孵育 30 分钟，偶尔轻轻倒置。按照程序的步骤 C11 到 C13 清洁和浓缩对照样品，与DiR处理的样品一样。样品制备好后，可在NanoSight实验中用作DiR处理样品的空白。

3. 蛋白酶抑制剂混合物 (PI) ，不含 EDTA
蛋白酶抑制剂混合物 (PI)可以从 Pierce 蛋白酶抑制剂片剂中制备，方法是每 5 mL PBS 溶解一片片剂以制成 10% 的原液。该 PI 以 1% (v/v) 的比例添加到条件培养基和每个洗涤步骤中（例如，将 500 µL的PI 添加到 50 mL 的条件培养基中）。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院的美国公共卫生拨款 R03 AI-135610 (MJE)、R01 AI158749-02 (MJE) 和 1R21NS113649-01 的支持。资助者在研究设计、数据收集、分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺

作者宣称不存在竞争利益。

参考

1. Busato, A.、Bonafede, R.、Bontempi, P.、Scambi, I.、Schiaffino, L.、Benati, D.、Malatesta, M.、Sbarbati, A.、Marzola, P. 和 Mariotti, R.（ 2016）。来自干细胞的超小超顺磁性氧化铁标记外泌体的磁共振成像：一种获得标记外泌体的新方法。 Int J Nanomedicine 11：2481-2490。
2. Busato, A.、Bonafede, R.、Bontempi, P.、Scambi, I.、Schiaffino, L.、Benati, D.、Malatesta, M.、Sbarbati, A.、Marzola, P. 和 Mariotti, R.（ 2017）。从脂肪干细胞中分离的外泌体的标记和磁共振成像。 Curr Protoc Cell Biol 75：3.44.41-43.44.15。
3. Cook, RL, Householder, KT, Chung, EP, Prakapenka, AV, DiPerna, DM 和 Sirianni, RW (2015)。配体修饰纳米粒子药物递送的关键评估：混淆小分子在中枢神经系统中的分布和功效。 J 控制版本220（Pt A）：89-97。
4. Corso，G.，Heusermann，W.，Trojer，D.，Görgens，A.，Steib，E.，Voshol，J.，Graff，A.，Genoud，C.，Lee，Y.，Hean，J.，等人。（2019）。通过荧光相关光谱和单粒子成像对细胞外囊泡分选域和单分子 - 单囊泡水平的定量进行系统表征。 J 细胞外囊泡8（1）：1663043。
5. Gangadaran，P.，Li，XJ，Lee，HW，Oh，JM，Kalimuthu，S.，Rajendran，RL，Son，SH，Baek，SH，Singh，TD，Zhu，L.，等。（2017）。一种新的生物发光报告系统，用于研究系统注射的肿瘤衍生的生物发光细胞外囊泡在小鼠体内的生物分布。 Oncotarget 8（66）：109894-109914。
6. Huotari, J. 和 Helenius, A. (2011)。内体成熟。 EMBO J 30（17）：3481-3500。
7. SS 索曼奇 (2016)。过继免疫疗法临床前模型中 NK 细胞的无创体内荧光成像。方法 Mol Biol 1441：307-316。
8. Théry, C.、Zitvogel, L. 和 Amigorena, S. (2002)。外泌体：组成、生物发生和功能。 Nat Rev Immunol 2（8）：569-579。
9. Zhao, Q.、Hai, B.、Kelly, J.、Wu, S. 和 Liu, F. (2021)。由 iPS 细胞衍生的间充质干细胞制成的细胞外囊泡模拟物可改善转移性前列腺癌的治疗。干细胞研究12（1）：29。