材料和试剂

所有化学品均为分析试剂分子生物学/组织培养级。

产品名称目录号公司名称
（3-（N-吗啉代）丙磺酸）MOPM1254Sigma-Aldrich
2 × 央视传媒G034-500G海美达
无水乙醇24102Sigma-Aldrich
醋酸W200603-1KG-KSigma-Aldrich
丙烯酰胺A8887-100GSigma-Aldrich
琼脂糖MB080-100G海美达
碱性磷酸酶蓝膜底物溶液AB0300
Sigma-Aldrich
氨苄青霉素SD002海美达
抗兔HRP代码：111-035-144杰克逊免疫研究
β-巯基乙醇21985023赛默飞世尔
双丙烯酰胺A2792-100mlSigma-Aldrich
硼酸MB007海美达
牛血清白蛋白 (BSA)A3059-10GSigma-Aldrich
Bright-Glo 萤光素酶检测系统E2610普罗米加
溴酚蓝B0126-25GSigma-Aldrich
氯化钙GRM710海美达
剪切智能缓冲区B6004S新英格兰生物实验室
环孢素RM8155海美达
DEAE-葡聚糖MB145海美达
二乙醇胺RM8218海美达
焦碳酸二乙酯 (DEPC)D43060RPI –国际研究产品
二甲基亚砜( DMSO)673439Sigma-Aldrich
DpnI酶R0176S新英格兰生物实验室
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)11965118吉布科_
乙二胺四乙酸GRM678海美达
EXpi 293F 细胞100044202赛默飞世尔
菲科尔26873-85-8Sigma-Aldrich
凝胶提取套件28706X4奇根
明胶G2500Sigma-Aldrich
葡萄糖MB037海美达
甘油MB060海美达
甘氨酸MB013海美达
HisPur TM Ni-NTA 磁珠88832热科学技术
不透明10771Sigma-Aldrich
氢化可的松RM556海美达
氯化氢18-603-211赛默飞世尔
咪唑MB019-100G海美达
异丙基β-D-硫代半乳糖苷RM2578海美达
卡那霉素硫酸盐MB105海美达
L-谷氨酰胺25030081吉布科_
连接酶15224017英杰公司
连接酶缓冲液46300018英杰公司
LMB3 底漆定制 DNA 寡核苷酸集成 DNA 技术 IDT
卢里亚肉汤M1245海美达
Luria 肉汤琼脂M1151-500G海美达
氯化镁MB237海美达
硫酸镁GRM1281海美达
甲醇322415-250mlSigma-Aldrich
迷你准备套件27106X4奇根
磷酸一钠GRM3964海美达
NcoI -HF ®R3193S新英格兰生物实验室
镍 NTA 珠子88221赛默飞世尔
NotI -HF ® R3189S新英格兰生物实验室
青霉素SD028海美达
PHEN 底漆定制 DNA 寡核苷酸集成 DNA 技术 IDT
磷酸盐缓冲溶液TS1101-20L海美达
植物血凝素 (PHA)10576015吉布科_
Pierce TM蛋白 G 磁珠88848热科学技术
聚凝胺（溴化己二甲胺）H9268Sigma-Aldrich
聚乙二醇MB149-500G海美达
醋酸钾W292001Sigma-Aldrich
氯化钾P3911-25GSigma-Aldrich
磷酸二氢钾PO662-25GSigma-Aldrich
核糖核酸酶AEN0531赛默飞世尔
RPMI-1640 培养基11875093吉布科_
脱脂牛奶GRM1254海美达
SnakeSkin TM透析管88244热科学技术
叠氮化钠GRM1038海美达
碳酸氢钠GRM849海美达
碳酸钠GRM851海美达
氯化钠MB023-1KG海美达
十二烷基硫酸钠0227-10GVWR 生命科学
氢氧化钠72064Sigma-Aldrich
磷酸氢二钠生物试剂NIST2186IISigma-Aldrich
停止解决方案N600赛默飞世尔科技
硫酸链霉素CMS220海美达
蔗糖MB025海美达
TG1 电感受态细胞23227卢西根
TMB （四甲基联苯胺）底物溶液N301赛默飞世尔科技
三碱基TC072海美达
Tris 缓冲盐水R017R.0000赛默飞世尔
Tris 游离碱MB029-500G海美达
Tris-HClMB030海美达
海卫 X100MB031海美达
台盼蓝T8154Sigma-Aldrich
胰蛋白酶TC598海美达
吐温 20MB067海美达
•山羊亲和纯化的人 IgG Fc 抗体、碱性磷酸酶缀合的山羊亲和纯化的 IgG Fc 抗体和纯化的人 IgG 全分子购自Cappel , MP Bio, USA。
•Zolla博士赠送了一种针对细小病毒 B19 的人mAb 1418 帕兹纳, NYU SoM , 美国

塑料制品
使用的所有塑料器皿都是一次性的（这项工作中不使用玻璃器皿）。
姓名目录号公司名称
用于 ELISA 的 96 孔平底免疫板CLS3370康宁
用于 ELISA 的 96 孔圆底免疫板CLS3367康宁
96孔组织培养板CLS 3628康宁
5 mL、10 mL 和 20 mL 一次性移液器CLS4487康宁
微量离心管 1.5 mLCLS3620康宁
0.2 mL PCR 管PCR-02-A氧气
培养皿460062塔森
移液器吸头 0.5–10 μLAXYT300RS康宁
移液器吸头 1–200 μLCLS4860康宁
T-25 cm 3组织培养瓶C6231康宁
T-75 cm 3组织培养瓶C7231康宁

缓冲区
1.10 ×凝胶上样染料库存（见配方）
2.2 ×样品缓冲液（参见配方）
3.丙烯酰胺：Bis (100 mL)（参见食谱）
4.抗生素浓度（见食谱）
5.琼脂糖凝胶电泳缓冲液（见配方）
6.包衣缓冲液（见配方）
7.试剂组成（见配方）
8.Expi293F TM人类细胞计数（见食谱）
9.脱色溶液 I（见配方）
10.洗脱缓冲液 (1 L)（参见配方）
11.下凝胶缓冲液 [pH 8.8] 200 mL（参见配方）
12.裂解缓冲液（1 L）（见配方）
13.磷酸盐缓冲盐水（见配方）
14.scFv的纯化（见配方）
15.Tank Buffer 1 × 2L (pH 8.3)（见配方）
16.上凝胶缓冲液 [pH 6.8] 100 毫升 (见食谱)
17.洗涤缓冲液（1 L）（见配方）
18.洗涤缓冲液（见配方）
19.Western Blotting 溶液（见配方）

程序

A.辅助噬菌体生产
辅助噬菌体对于将噬菌粒颗粒转移到大肠杆菌中是必需的。噬菌粒颗粒包含 ( i ) 抗生素制造商，(ii) 抗体-G3P 融合蛋白，和 (iii) 噬菌体复制起点。
噬菌粒文库与抗体-G3P 融合蛋白和辅助噬菌体基因一起扩增，这些基因是感染、复制、组装和出芽所必需的。

1.取三个 Corning ® 50 mL Falcon 离心管 (FCT) 并将它们标记为 A、B 和 C。
2.在每个 FCT 管中添加 5 mL 的 2 × YT 介质。
3.以 B 和 C 作为阴性对照，其中一个加入氨苄青霉素，另一个加入卡那霉素。
4.添加 20 μL的 TG1大肠杆菌细胞。
5.将 FCT 在 37°C 下摇动孵育过夜生长。
6.5 mL 新鲜的 2 × YT 培养基中继代培养 20 μL先前接种的 TG1 细胞在FCT A（步骤A1）中；孵育 2 – 4 小时在 37°C 下摇动。
7.在培养的 TG1 细胞中加入 40 μL的辅助噬菌体。
8.在 37°C 下生长 30 分钟，不要摇晃。
9.在 37°C 下振荡培养 30 分钟。
10.将此培养物添加到 200 mL 的新鲜 2 × YT 培养基中，其中含有 50 μg / mL 工作浓度的卡那霉素。
11.允许在 30°C 下摇晃过夜生长。
12.从培养箱中取出烧瓶，将培养物收集在高压灭菌的铯瓶中。
13.14,260 × g离心机在 4°C 下 30 分钟。
14.将上清液倒入另一个新鲜的铯瓶中，以 14,260 × g离心和 4°C 30 分钟。
15.在不干扰颗粒的情况下，将上清液收集在玻璃瓶中，加入 PEG/NaCl [20% ( wt /vol) 聚乙二醇 6000, 2.5 M NaCl]，保持上清液和 PEG/NaCl 的比例为 50:15。
16.在 4°C 的冷藏室中存放 4 – 5 小时，或过夜以获得更好的效果。
17.以 14,260 × g旋转培养物和 4°C 1 小时，让细胞沉淀下来。
18.在不干扰颗粒的情况下，丢弃上清液，并用 1 × PBS 重新悬浮颗粒，将其保存在 1.5 mL 管中。
19.以 16,200 × g离心微管 5分钟。如果形成沉淀，将上清液转移到新试管中并储存在 4°C（图 1）。

图1。辅助噬菌体制备步骤的示意图。

B.成长汤姆林森 I + J 并制作二级股票
1.取 100 mL 的 2 × YT 培养基，其中含有氨苄青霉素和 1%（体积/体积）葡萄糖。在此介质中，添加 500 μL的 Tomlinson I + J 噬菌体库库存。
2.孵育 1 – 2 小时，直到 600 nm 处的 OD 约为 0.4。
3.将 100 mL 的培养基分成两部分。首先，使用 50 mL 培养文库；然后，使用剩余的媒体制作图书馆的二级库存。

培养图书馆（噬菌体库存）：
4.取 100 mL 生长培养基中的 50 mL，加入 200 μL辅助噬菌体。
5.在 37°C 下孵育30 分钟，不要摇晃。
6.1,200 × g离心 10分钟。
7.小心丢弃上清液，不要干扰沉淀。
8.将颗粒溶解在 100 mL 的 2 × YT 介质中，该介质含有 100 μg / mL 氨苄青霉素、50 μg / mL 卡那霉素和 0.1%（重量/体积）葡萄糖。
9.将重悬的沉淀在 30°C 下摇动孵育过夜。
10.过夜孵育后，将培养物转移到离心瓶（铯瓶）中并以 14,260 × g离心和 4°C 30 分钟。
11.将上清液转移到另一个铯瓶中，再次以 14,260 × g离心和 4°C 30 分钟。
12.小心地将上清液转移到另一个高压灭菌的玻璃瓶中并丢弃沉淀。将 PEG/NaCl（20% 聚乙二醇 6000、2.5 M NaCl）添加到收集的上清液中（15 mL 的 PEG/NaCl 到 50 mL 上清液）。
13.将其存放在 4°C 的冷藏室中 4 – 5 小时，或过夜以获得更好的效果。
14.以 14,260 × g旋转培养物和 4°C 1 小时，让细胞沉淀下来。
15.在不干扰沉淀的情况下，弃去上清液并用 1 × PBS 重悬沉淀；将其保存在 1.5 mL 管中。
16.× g f或 10 分钟离心微管。如果形成沉淀，将上清液转移到新鲜的试管中，并在 4°C 下短期储存。添加 15% (vol/vol) 甘油可在 -80°C 下更长时间储存（图 2）。

制作噬菌体文库二级储备：
17.将剩余的 50 mL 培养基在 37°C 下摇动培养 2 小时。
18.在 1,500下离心培养物，让细胞沉淀下来 × 克 15分钟。
19.含有 15% (vol/vol) 甘油的 3 mL 2 × YT 介质中重新悬浮颗粒。
20.储存在 -80°C 直至进一步使用（图 2）。

图 2.用于筛选目的的文库扩增和文库二级库存制备所涉及步骤的示意图。

C.生物平移
在这一步中，目标蛋白被固定在微量滴定板的表面。第一步是添加获救的汤姆林森噬菌体文库。第二步涉及结合，其中展示最高亲和力抗体的scFvs的噬菌体结合抗原的表位，而具有低结合亲和力的那些通过洗涤去除。通过使用胰蛋白酶的酶消化来洗脱结合抗原的噬菌体。洗脱的噬菌体感染TG1，然后添加辅助噬菌体进行扩增。为了积累展示高亲和力抗体片段的噬菌体，这些步骤对前一轮淘选的扩增噬菌体重复3次，每次都增加洗涤循环的次数。

第1轮
1.实验前一天，在ELISA板的一排（比如C排），即A板，涂上所需的抗原（每孔100 μL ），浓度为5 μg 。用包被缓冲液包被抗原。
2.将板 A 在 4°C 下孵育过夜。
3.第二天，在 5 mL PBS 中制备 3%BSA，并在 37°C 下孵育 10 分钟。然后，涂上另一块板，即板B；涂上两排（例如 C 和 D 排）并在 37°C 下孵育板 1 小时。
4.μL的噬菌体原液中涂上一小撮脱脂牛奶（比如 C 行）。每口井涂 100 μL 。
5.在室温下孵育板 C 30 分钟。然后，将涂层从 C 行转移到任何其他行，例如 D 行。再孵育30 分钟。
6.涂板 B 1 小时后，用高压灭菌 PBS（每孔 250 μL ）清洗一次板，并将板 C 的内容转移到板 B 的 C 行上。
7.再次，在室温下孵育板 B 30 分钟，然后将 C 行的内容转移到 D 行，然后再孵育 30 分钟。
8.在清洗板 B 的同时，使用高压灭菌的 PBS（每孔 250 μL ）清洗板 A，然后用 3%（重量/体积）BSA（每孔 200 μL ）封闭。在室温下孵育 1 小时。
9.用高压灭菌的 PBS 清洗板 A 三次。
10.然后，将板 B 的内容转移到板 A 上；然后在室温下孵育 1 小时。
11.孵育后，用 PBST 清洗板 A 10 次。制作 1 mL 的 PBS，其中含有 50 μL的胰蛋白酶，并在每口井中加入 95 μL这种溶液。
12.将板在 37°C 下保持 10 分钟。
13.胰蛋白酶化的内容收集到一个等分试样中。这将是第一轮生物淘选的输出。
14.使用生物平移 1 的输出来计算换能单元 (T U) (图 3)。

图 3.生物淘选过程中涉及的步骤的示意图。

准备下一轮生物淘选
15.将 500 μL的生物平移输出添加到 5 mL 的 TG1 细胞生长培养基中。
16.在 37°C 下振荡保持 30 分钟。
17.以700 × g离心10 分钟。
18.使用 1 mL 上清液溶解离心过程中形成的沉淀，并将剩余的上清液倒出。
19.将其涂抹在含有 2 × YT 琼脂和氨苄青霉素的生物测定皿上。
20.让细菌在 37°C 下过夜生长。
21.第二天，将 3 – 5 mL 的含有 15% 甘油的 2 × YT 培养基添加到生物测定皿中，并刮掉所有过夜生长的菌落。将它们收集在新管中。
22.使用 100 μL的刮去菌落并储存其余部分。
23.含有氨苄青霉素 (100 µg/mL) 和 1% (vol/vol) 葡萄糖的 50 mL 2 × YT 介质中加入 100 μL的刮除菌落。
24.让它在 37°C 下振荡生长 2 小时。
25.取上述培养物 10 mL，加入 40 μL辅助噬菌体。在 37°C 下孵育 30 分钟，不要摇晃。
26.以 700 × g离心培养15 分钟，弃去上清液，不要干扰沉淀。
27.将颗粒溶解在 50 mL 的 2 × YT 介质中，其中含有 100 μg / mL 氨苄青霉素、50 μg / mL 卡那霉素和 0.1% 葡萄糖。在 30°C 下孵育过夜颤抖着。
28.将过夜培养的培养物在 14260 × g和 4°C 下离心 30 分钟，将上清液收集在新鲜的铯瓶中，并在 14260 × g和 4°C 下再次离心 30 分钟。
29.小心地将上清液转移到高压灭菌的玻璃瓶中并丢弃沉淀。将 PEG/NaCl（20% 聚乙二醇 6000、2.5 M NaCl）添加到收集的上清液中（15 mL 的 PEG/NaCl 到 50 mL 的上清液）。
30.将其存放在 4°C 的冷藏室中 4-5 小时，或过夜以获得更好的效果。
31.14260 × g旋转培养物1 小时，使细胞沉淀下来。
32.在不干扰颗粒的情况下，丢弃上清液并用 1 × PBS 重新悬浮颗粒，将其保存在 1.5 mL 管中。
33.× g将微管离心10 分钟。如果形成沉淀，将上清液转移到新试管中并储存在 4°C。
34.收集的噬菌体将用作下一轮生物淘选的输入，方法是将其涂在板 C 上，而不是噬菌体原液。
注意：每轮生物淘选，降低抗原包被浓度（例如，第 1 轮使用 5 μg / μL ，第 2 轮使用 3 μg / μL ，并用 1.5 μg / μL进行第 3 轮）并计算噬菌体选择期间使用的每个输入和输出的 TU。

D.噬菌体 ELISA 筛选
第 0 天：进行 ELISA 前一天
1.对于噬菌体选择过程，培养最后一轮生物淘选输出的菌落。接种在最后一轮生物淘选输出中形成的菌落；每次接种均在 5 mL含有 100 μg / mL 氨苄青霉素的 2 × YT 培养基中进行。
2.在 37°C 下孵育 30 分钟，不要摇晃。等到文化的 OD 600达到 0.4–0.6。
备份集：在此步骤中，取每个克隆的200 μL培养物，并加入 200 μL高压灭菌的 50% (vol/vol) 甘油溶液制成储备液并储存在 -80°C 以供将来实验
3.添加 20 μL的辅助噬菌体。
4.再次在 37°C 下摇动孵育 30 分钟。
5.加入 50 μg / mL 卡那霉素并在 30°C 下以 140 – 160 × g振荡孵育过夜。
6.μg / μL的所需抗原涂抹 96 孔检测板。将 BSA 涂层作为阴性对照，并将板在 4 °C 下过夜（图 4）。

图 4.噬菌体 ELISA 筛选过程中涉及的步骤的示意图。

酶联免疫吸附试验
7.第二天，将抗原包被板从 4°C 中取出并用 PBS 洗涤一次。
8.中 200 μL的 5% 脱脂牛奶块板。
9.在室温下孵育板 1 小时。
10.将所有菌落接种物从培养箱中取出，以 3,900 × g离心管20分钟。
11.μL ）清洗 ELISA 板 3 次。
注意：如果需要，阻塞可以延长到 90 分钟，具体取决于并行步骤的时间
12.孵育 1 小时后，用 PBS 洗板 3 次。
13.然后每孔加入100 μL一抗，即从所有离心管中取50 μL上清液和50 μL脱脂牛奶（按1:1稀释）。
14.在室温下孵育 1 小时。
15.用 250 μL的 0.1% PBST 清洗盘子四次。
16.加入 100 μL的二级抗体（1:2,000）。随后在黑暗中在室温下孵育 1 小时。
17.用 250 μL的 0.1% PBST 清洗盘子六次。
18.加入 100 μL的底物 (TMB)。
19.让反应在黑暗中进行 15 – 20 分钟。
要停止反应，每孔加入 50 μL停止溶液 (2 NH 2 SO 4 )，并在多模式 ELISA 阅读器上以 450 nm 读取板。

E.质粒 DNA 的分离
1.在噬菌体 ELISA 中识别阳性结合克隆（至少是阴性对照的四倍）。
2.取两个 FCT 并将它们标记为 A 和 B；向每个 FCT添加 5 mL 的 2 × YT 介质。
3.取 B 并添加氨苄青霉素 (100 µg/mL) 和 C 作为阴性对照，在其中添加卡那霉素 (50 µg/mL)。
4.在 FCT A 和 B 中，从保存在 -80°C 的甘油原液中接种。
5.将 FCT 在 37°C 下摇动孵育过夜生长。
6.第二天早上，检查管 A 和 B。管 A 培养物应该是混浊的，管 B 中应该没有生长。
7.通过在 2,820 × g下将培养物离心15 分钟来降速。
8.对于质粒分离，请按照制造商的说明使用 Qiagen Miniprep 试剂盒。
9.使用 nanodrop 分光光度计检查分离质粒 DNA 的质量和浓度。分离 DNA 的 260/280 比率应为 1.8。
10.准备 0.8% 琼脂糖凝胶并检查凝胶上分离质粒 DNA 的质量。
11.制作 10 μL的质粒 DNA 等分试样，并使用 LMB3 和 PHEN 测序引物对scFv插入序列进行测序。

可溶性ELISA
12.如噬菌体 ELISA 部分所述执行 ELISA。
13.加入 100 μL纯化的scFv ，在室温下孵育 1 小时。
14.用 0.1% PBST洗板3 次。
15.在 2% MPBS 中使用 1:1,000 稀释的初级抗体（抗 His 标签）并在室温下孵育。
16.0.1% PBST洗涤 3 次。
17.如上所述，在 2% MPBS 中使用 1:2,000 稀释的抗兔 HRP 偶联二抗并在室温下孵育，然后洗涤。
18.添加 100 μL 的 TMB 底物，让颜色显色。一旦颜色出现，加入 8 NH 2 SO 4以停止反应。
19.在 ELISA 阅读器中读取 450 nm 处的板。

F.用于转换单位 (TU) 计算的稀释和电镀

图 5.显示辅助噬菌体/文库 TU 计算的稀释制备策略的代表性图像。

1.每个稀释液的铺板在含有氨苄青霉素的不同板上进行。
2.将噬菌体和细菌的混合物倒在盘子上，并使用吊具缓慢扩散。用它包含的稀释度标记每个板。
3.将板在 37°C 下孵育过夜生长。第二天，计算 TU 计算的菌落（图 5）。

G.计算换能器
TU = (菌落数 × 1000) /(10 × 稀释度)。对于 10 -8稀释板，我们得到了 9 个菌落；
那么TU计算为： (9 × 1000) /( 10 × 10 -8 ) = 9 × 10 10

H.感受态细胞的制备
1.划线大肠杆菌TG1 细胞，让细胞在 37°C 下过夜生长。
2.在 5 mL LB 培养基中接种单个菌落，并在 37°C 下生长过夜。
3.通过接种 1 mL 过夜培养的大肠杆菌，在 100 mL LB 中进行继代培养，并在 37°C 的摇床上生长，直到 600 nm 处的 OD 达到约 0.6。
4.立即在冰上冷却培养物，并通过在 4,200 × g和 4°C 下离心 5 分钟来收获细胞。
5.小心取出上清液；将离心管倒置在纸巾上，去除任何上清液痕迹。
6.将细菌颗粒重新悬浮在 10 mL 的冰冷 0.1 M CaCl 2 （高压灭菌）中，并在冰上孵育 30 分钟。
7.如上所述通过离心回收细胞，重悬于 5 mL 的 0.1 M CaCl 2中，并在微量离心管中分装 200 μL细胞。

I.矢量设计
图 6 显示了矢量设计的代表性策略。
一组设计的 PCR 引物在scFv-pIII连接处将 TAG 琥珀密码子替换为 TAA，用于载体构建。
正向引物：5'CACATCATCATCACCATCACGGGTAATAAGAACAAAAACTCATCTC3'
反向引物：5'GAGATGAGTTTTTGTTCTTATTACCCGTGATGGTGATGATGATGTG3'。
PCR反应设置：
脚步初始变性骑行 16 ×扩大抓住
温度95°C95°C52°C72°C72°C10°C
时间2 分钟30 秒50 秒4 分钟5分钟∞

PCR产物被Dpn 1酶消化
PCR产物20 µL
Dpn 1酶1 µL
剪切智能缓冲区2.5 µL
将反应混合物在 37°C 下孵育 2 小时。轻敲中间的管子。

1.将两瓶感受态细胞从 -80°C 冰箱中置于冰上解冻 5-10 分钟。不要在这一步点击。
2.将 5 μL 的Dpn 1 消化产物添加到一个管中，并将另一管保持为空白或阴性对照。在冰上孵育细胞 30 分钟。
3.30 分钟后，将两根管子放入浮子中热休克 60 秒（在此步骤中，将水浴设置为 42°C）。
4.立即将试管置于冰中 5 分钟；在此步骤中，将介质预热至 37°C。
5.在管中的细胞中加入 900 μL 的预热 2 × YT 培养基。
6.以 220 rpm 的速度在摇床中孵育管子 60 分钟以生长细胞。
7.从摇床中取出管子，吸出 100 μL 的细胞悬浮液，并在 LB-Agar-氨苄青霉素板上进行平板/涂抹。将板在 37°C 培养箱中孵育 16 小时或过夜。
8.第二天早上，取出平板，计数菌落，并在 4°C 下储存直至进一步使用。
9.将 5 mL 的 2 × YT 添加到五管中，并辅以标准浓度的氨苄青霉素。挑取单个菌落对平板上获得的菌落进行接种培养；在 37°C 下以 220 rpm 振荡孵育。还孵育一管培养基作为对照。
10.第二天早上，按照制造商的说明，使用 Qiagen 质粒分离试剂盒从所有四个管中分离质粒 DNA。
11.通过观察 260/280 DNA 比率，使用分光光度计检查分离质粒的质量。
12.分装 DNA 并将这些样本发送到使用载体特异性引物进行测序。
13.分析点突变的 DNA 序列数据并标记阳性克隆以供进一步使用。丢弃阴性克隆。

设计载体的消化
限制性消化的反应混合物：
零件体积（ μL ）
质粒 DNA (250 ng · μL -1 )10微升
10 × CutSmart 缓冲器 (NEB)5微升
Nco I -HF (NEB)2微升
不是I -HF (NEB)2微升
无核酸酶水31微升
将反应在 37°C 下孵育 2 小时。

1.2 小时后，加入 10 μL的 5 ×凝胶上样染料，并在 0.8% 琼脂糖凝胶上以 100 V 运行样品约 60 分钟。
2.使用锋利的手术刀片从琼脂糖凝胶中切割和切除消化的载体 DNA。将切除的片段放入 1.5 mL Eppendorf 管中。根据制造商的协议，使用 Qiagen 凝胶提取试剂盒从切除的 DNA 中纯化消化的载体。
3.通过计算 260/280 比率，使用分光光度计评估纯化的消化载体 DNA 的质量。这种纯化的载体用于未来的克隆反应。

scFv克隆的消化
进一步使用在可溶性ELISA中未显示结合的噬菌体ELISA结合阳性克隆从单菌落中分离质粒DNA 。
消化反应设置如下：
零件体积（ μL ） _
质粒 DNA (250 ng · μL -1 )10微升
10 × CutSmart 缓冲器 (NEB)5微升
Nco I -HF (NEB)2微升
不是I -HF (NEB)2微升
无核酸酶水31微升

1.2 小时后，加入 10 μL的 5 ×凝胶上样染料，并在 1% 琼脂糖凝胶上以 100 V 运行样品约 40-60 分钟。
2.在琼脂糖凝胶中应观察到两条条带，一条条带大小约为 4 kb，对应于载体 DNA，另一条条带大小为 800 bp，对应于scFv DNA。
3.切除含有相关 DNA 片段的琼脂糖凝胶切片（ scFv插入 800 bp）并去除多余的琼脂糖以最小化凝胶切片。
4.根据制造商的说明，将凝胶切片转移到微量离心管中并使用 Qiagen 凝胶提取试剂盒进行纯化。
5.使用这种纯化的scFv DNA 克隆到新设计的载体中。

scFv DNA克隆到新设计的载体中
零件体积（ μL ） _
scFv DNA插入10微升
设计的矢量5微升
10 ×连接酶缓冲液2微升
连接酶2微升
无核酸酶水31微升

1.将连接反应混合物在室温下孵育 4-6 小时。或者，这可以在室温下保持过夜。
2.后，将 TG1 感受态细胞在冰上解冻 5 分钟。
3.将 5 μL的结扎混合物添加到一个管中，并保持第二个管没有插入和/或结扎混合物作为阴性对照。
4.热休克细胞 60 秒，并立即在冰上保持 5 分钟。
5.加入 900 μL的 2 × YT 培养基，在 37°C 的摇床培养箱中孵育试管 1 小时。
6.× g离心管5 分钟。倒出上清液并将颗粒重新悬浮在扩孔剩余介质中。将其置于预热的 2 × YT-Agar 平板上，添加氨苄青霉素，或者您可以选择使用带有氨苄青霉素的 LB-Agar 平板。
7.将板在 37°C 培养箱中孵育过夜或 12-16 小时。
8.第二天早上，计数反应板上的菌落。控制板中不应有菌落；否则，用所有新的和新制备的试剂重复实验。
9.在两个 50 mL FCT 中接种含有标准浓度氨苄青霉素的5 mL 2 × YT 中的单个菌落。将一根管标记为反应管，另一管标记为空白管，并在 37°C 的摇床培养箱（200 至 220 rpm）中孵育两管过夜。
10.将小接种物（约 4 mL）从过夜原代培养物转移到 2 L 烧瓶（400 mL 培养基）2 × TY 中，其中含有 100 μg /mL 氨苄青霉素和 0.1% 葡萄糖。在 37°C 下逐渐摇动 (250 rpm)，直到 OD 600约为 0.9（约 3 至 3.5 小时）。
11.一旦培养物的 OD 达到 0.9，加入异丙基 β-D-硫代半乳糖苷，最终浓度为 1 mM IPTG。继续在 30°C 下摇动 (250 rpm) 过夜。
12.× g下离心15 分钟来收获细胞。如果需要，将细胞沉淀储存在 -20°C 或立即处理。

图 6. 修改后的矢量设计策略的示意图。
用琥珀终止密码子对scFv基因进行可溶性表达的改进方法。原始载体中scFv-pIII基因之间的琥珀终止密码子 (TAG)被更改为 TAA，从而阻止了scFv-pIII融合蛋白的产生。使用用于将scFv基因克隆到原始载体中的相同限制性位点 Nco1/Not1将scFv基因直接克隆到修饰载体中（Perween等人，2021a）。

重悬细胞沉淀和细胞提取物制剂
a.使用 NaOH 将 pH 值调节至 8.0 。
b.将颗粒重新悬浮在 30 mM Tris-HCl、20%（重量/体积）蔗糖、pH 8.0、湿重 80 mL/g 中。在冰上孵育并滴加 500 mM EDTA 至终浓度为 1 mM；然后将细胞在冰上孵育 20 分钟，同时轻轻搅拌。
c.× g和 4°C下离心 20 分钟来澄清细胞悬液。
d.收集上清液并将细胞重新悬浮在相同体积的冰冷 5 mM MgSO 4中，并在冰上孵育 20 分钟，同时轻轻搅拌。
e.× g和 4°C 下将细胞离心20 分钟。收集上清液（上清液是含有周质蛋白的渗透性休克液）并针对裂解缓冲液进行广泛透析。
f.在继续纯化之前，通过0.2 μm过滤器过滤透析的上清液。在使用 Ni++ 离子之前，用裂解缓冲液（50 mM NaH 2 PO 4、300 mM NaCl、10 mM 咪唑和 pH = 8.0）平衡树脂。

scFv的纯化
a.对于纯化，使用 Ni-NTA 珠子；在纯化柱中加入 5 mL 的 50% Ni-NTA-琼脂糖树脂浆液，让珠子沉淀下来。
b.MilliQ (MQ) 水清洗珠子；添加 10 列体积 (CV) 的 MQ。
c.使用 10 CV 的结合缓冲液（20 mM Tris；pH = 7.2、500 mM NaCl 和 10 mM 咪唑）平衡柱。因此，与 Ni++ 离子树脂相同的 pH 值和缓冲液成分可确保样品正确结合
d.将过滤后的上清液加入柱中，使其通过重力。
e.上清液通过后，清洗柱子以去除任何杂质。添加 20 – 30 CV 的洗涤缓冲液（20 mM Tris；pH = 7.2、500 mM NaCl 和 25 mM 咪唑）。
f.从珠子中洗脱结合的蛋白质，并使用 5 – 6 CV 的洗脱缓冲液（20 mM Tris pH = 7.2、500 mM NaCl 和 500 mM 咪唑）。在 15% 三甘氨酸 SDS-PAGE 上分析纯度方面的蛋白质质量。
g.使用激活的透析管透析蛋白质，将管的两端紧紧夹住，然后将其放入装有冷 PBS 的烧杯中。在磁力搅拌器的帮助下，让它在 4°C 的冷室中旋转过夜。
h.在 AKTA FPLC 系统中安装 Superdex75 增加柱。用 PBS 彻底清洗泵。
i.使用 2 CV 的 PBS 平衡色谱柱；通过循环加载大约 500 μL的纯化浓缩蛋白，体积为 0.5 mL。
j.收集不同的派系并通过SDS PAGE进行分析。将蛋白质分装在 -80°C 下储存以备进一步使用。将 30 μL 的样品与 5 × SDS 凝胶加载染料（6 μL）混合。加载前在 100 °C 下加热样品 10 分钟。

食谱

1.裂解缓冲液 (1 L)
50 mM NaH 2 PO 4 (6.90 g NaH 2 PO 4 ·H 2 O；MW 137.99 g mol -1 )
300 mM NaCl（17.54 g NaCl；MW 58.44 g mol -1 ）
10 mM 咪唑（0.68 g 咪唑；MW 68.08 g mol -1 ）
使用 NaOH 将 pH 值调节至 8.0。
2.洗涤缓冲液 (1 L)
50 mM NaH 2 PO 4 (6.90 g NaH 2 PO 4 ·H 2 O；MW 137.99 g mol -1 )
300 mM NaCl（17.54 g NaCl；MW 58.44 g mol -1 ）
30 mM 咪唑（2.04 g 咪唑；MW 68.08 g mol -1 ）
使用 NaOH 将 pH 值调节至 8.0。
3.洗脱缓冲液 (1 L)
50 mM NaH 2 PO 4 (6.90 g NaH 2 PO 4 ·H 2 O；MW 137.99 g mol -1 )
300 mM NaCl（17.54 g NaCl；MW 58.44 g mol -1 ）
300 mM 咪唑（20.4 g 咪唑；MW 68.08 g mol -1 ）
4.琼脂糖凝胶电泳缓冲液
TBE（Tris 硼酸 EDTA）缓冲液，pH = 8.0
对于 10 × TBE 缓冲液，将 108 g Tris碱、55 g 硼酸和 7.4 g EDTA 溶解在 750 mL 水中。将溶液的 pH 值调节至 8.0，使最终体积达到 1 升。 1 × TBE 缓冲液用作工作溶液。
5.洗涤缓冲液
PBS-Tween-20，pH = 7.4
200 毫升 10 × PBS
1 毫升吐温 20
用 MQ 水将体积调整到 2 L
6.涂层缓冲液
碳酸盐缓冲液，pH = 9.6
1.59 克 Na 2 CO 3
2.93 克碳酸氢钠3
0.2 克 NaN 3
用 MQ 水将体积调节至 1 L
7.Expi293F TM人类细胞的计数。
a.从单细胞悬浮液中吸出 0.1 mL 的细胞悬浮液，并用 0.1 mL 的台盼蓝（0.4%）染色。
b.计算死细胞和活细胞以计算百分比活力。
c.计算：
细胞计数 = 活细胞数 × 2 × 10 4细胞/mL
8.10 ×凝胶上样染料 (10 mL)：
a.在 30 mL 螺旋盖管中称量 25 mg 溴酚蓝并溶解在 7 mL 的 ddH 2 O 中。
b.加入 2.5 g Ficoll并溶解（在摇床中放置过夜，使其完全溶解）。
c.2 O补足 10 mL 。标记并储存在 4 °C 。
d.最终浓度为 0.25%。
e.溴酚蓝和 25% Ficoll 。
9.抗生素浓度
a.库存浓度 = 100 毫克/毫升
b.工作浓度= 100 μ g /mL
c.因此，对于 2 mL
d.N1V1=N2V2
e.X*100000 = 200*100
f.X = 200微升
10.磷酸盐缓冲盐水 [pH 7.2]
•氯化钠 = 8.0 克
•氯化钾= 0.2 克
•Na 2 HPO 4 = 1.15 克
•KH 2 PO 4 = 0.2 克
将所有组分溶解在 700 mL 蒸馏水中，检查 pH 值为 7.2 并定容至 1,000 mL。
11.丙烯酰胺：双（100 mL，30% 库存）
a.丙烯酰胺 = 29.2 克
b.双丙烯酰胺 = 0.8 g
c.ddH 2 O = 7 毫升
称取丙烯酰胺和双丙烯酰胺，溶于70mL水中，定容至100mL。将溶液通过 Whatman No.2 纸过滤并在 4 °C 下储存在琥珀色瓶中。
12.上凝胶缓冲液 [pH 6.8] 100 mL
这不过是浓缩胶缓冲液，即., 0.5 摩尔 Tris-HCl (4 × )。将 6.6 g Tris 碱溶解在 70 mL ddH 2 O 中，检查 pH 值并使用 5 N HCl 将其调节至 6.8。将体积定容至 100 mL 并在 4 °C 下储存。
13.下凝胶缓冲液 [pH 8.8] 200 mL
分离凝胶缓冲液 (1.5 M Tris-HCl (4 × ))
将 36.3 g Tris 溶解在 125 mL ddH 2 O 中。使用 5 N HCl 将 pH 调节至 8.8。体积定容至 200 mL 并高压灭菌。将溶液储存在 4 °C 。
14.罐缓冲液 1 × ( pH 8.3) 2 L
Tris碱 = 6.0 g最终浓度0.025 M
甘氨酸 = 28.8 g最终浓度0.192 米
SDS = 2 g最终浓度0.1M
ddH 2 O = 1,750 毫升
检查 pH 值约为 8.3，并将体积定容至 2 L。
15.脱色液 I
甲醇 = 250 毫升 (50%)
乙酸 = 35 毫升 (7%)
ddH 2 O= 215 毫升
16.2 ×样品缓冲液 (5 mL)
•Tris-HCl (Ph 6.8) = 1.25 mL (0.12 M)
•SDS = 0.2克 (4%)
•BME = 500 µL (10%)
•甘油= 1 毫升 (20%)
•溴酚蓝 (0.15%) = 500 µL (0.015%)
•ddH 2 O = 1.75毫升
•总计 = 5 毫升
将其溶解成等分试样并在 -20°C 中冷冻[通过将 15 mg 溶解在 0.2 mL 甲醇中，然后加入 9.8 mL 水来制备 0.15% 溴酚蓝]。
17.Western Blotting 溶液制备
传输缓冲器
Tris = 0.6 g (0.025 M)
甘氨酸 = 2.88 g (0.192 M)
甲醇 = 40 毫升 (20%)
SDS = 60 毫克 (0.03%)
体积增至160 mL 并高压灭菌。向其中加入 40 mL 甲醇并在 4°C 下储存。

TBS（Tris 缓冲盐水）（ 400 毫升）
Tris = 4.84 克 (0.1 M)
氯化钠 = 3.6 克 (0.9%)
将组分溶解，用 HCl 将 pH 调节至 7.5，并定容至 400 mL。

TTBS (250 毫升)
TBS = 250 毫升
吐温 20 = 250 µL

封闭溶液（30 毫升）
TTBS = 12 毫升
5% 明胶 = 18 毫升 (3%)

试剂组成：
缓冲液 P1 [重悬缓冲液]
50 mM Tris-HCl (pH 8)
10 毫米乙二胺四乙酸
100 µL/mL RNase A

缓冲液 P2 [裂解缓冲液]
200 毫米氢氧化钠
1% SDS (w/v)

缓冲液 P3 [中和缓冲液]
3 mM 醋酸钾 (pH 5.5)

缓冲液 QBT [平衡缓冲液]
750 毫米氯化钠
50 毫米拖把 (pH 7)
15% 异丙醇 (v/v)
0.15% Triton X-100 (v/v)

缓冲液质量控制 [ 洗涤缓冲液]
1 毫米氯化钠
50 毫米拖把 (pH 7)
15% 异丙醇 (v/v)

致谢

请承认支持这项工作的资金来源；如果此协议是从以前的工作中改编或修改的，也请在此处确认以前的工作。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

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