第一部分：微菌落食物制备规程

材料和试剂

1. 新鲜或新鲜冷冻的蜜蜂采集的球状花粉（参见微生物群食物制备说明#1 的协议），来自研究者维护的蜜蜂群或商业供应商（ Swarmbustin ' Honey，目录号： BP-DKLB ）。
2. 山梨酸（ Amresco ，目录号： 0667-500G）
3. 无水柠檬酸（Fisher，目录号： A940-500）
4. 纯蔗糖（例如，多米诺糖）
5. 蒸馏水（Gibco，目录号： 15230）
6. 山梨酸钾溶液（见食谱）

设备

1. 层流罩
2. 4°C实验室冰箱（Thermo Scientific，目录号：TSV18CPSA）
3. -20°C实验室冰箱（Thermo Scientific，目录号：TSX3020FARP）
4. 基本咖啡研磨机或（理想情况下）商用搅拌机（Waring，目录号：7010S）
5. 真空食品封口机（ FoodSaver ，目录号：FM2100）
6. 用于真空食品密封机的冷冻储存袋（ FoodSaver ，目录号：FSFSBF0226NP）
7. 分析顶部装载秤/天平（Ohaus，目录号：AX2202/E）
8. 分析天平标准品：200 mg、500 mg、1 g、2 g、10 g、20 g、30 g、100 g、200 g、300 g、500 g和1 kg
9. 用于大容量的手动电子移液器（Drummond Pipet-Aid，目录号：4-000-101）
10. 具有搅拌功能的热板（2）（ Cimarec ，目录号：SP195025）
11. pH计（Orion Star，目录号：STARA2110）
12. pH 计校准标准：pH 4.0 和 pH 7.0（VWR，目录号：E452-500ML 和 E459-500ML）

一般用品

1. N95 一次性呼吸器（VWR，目录号：89201-508）
2. 研钵和杵（VWR，目录号：470019-978）
3. 无菌瓶口0.45 µm 过滤器（VWR，目录号：10042-462）
4. 60 mL Luer滑动注射器，尖端被切断（ Exel International，目录号：ES60）
5. 25 mL刻度玻璃移液管（VWR，目录号：76003-570）
6. 铝箔
7. 用于覆盖工作表面的一次性纸垫（ Versi -Dry Lab Table Soakers，目录号：62080-00）
8. 2升耐热玻璃瓶（康宁，目录号：1395-2L）
9. 磁力搅拌棒（Komet，目录号：50087909）
10. 35 mm × 10 mm 一次性培养皿盖（Falcon，目录号： 351008）
11. 43 mm铝制称重盘（ QORPAK，目录号：MET-03105 ）
12. 1 L Pyrex 烧杯（2）（Corning，目录号：1000-1L）

程序

A. 50/50 转化糖浆：1 升瓶装（生产 1.5 升）
1. 为了更容易清理，在使用前用铝箔盖住热板。
2. 将 1,000 mL 蒸馏水与 850 g 纯蔗糖混合，在热板上搅拌直至所有糖颗粒溶解。
3. 加入 0.85 g 无水柠檬酸并继续搅拌，同时加热至沸腾。
4. 用铝箔盖住烧杯并煮沸 20 分钟（见图 2）。

图 2. 糖浆滚沸并用柠檬酸处理。

5. 在室温搅拌板上冷却，同时盖上盖子并用搅拌棒搅拌。
6. 冷却后，加入 7.5 mL（每生产 1 L 5 mL）山梨酸钾溶液（参见下面的配方）。
7. 记录 pH 值并适当地标记容器（参见Microcolony食品制备说明 #2 协议）。
8. 封口膜瓶盖并在 4°C 下储存 50/50倒置糖浆，一旦打开，最多可保存 14 天（未开封 30 天）。

B. 准备花粉（参见Microcolony食物准备说明 # 3 和 4 的协议）
1. 用咖啡研磨机或（理想情况下）商用搅拌机将冷冻花粉研磨成细粉（图 3A-C）。

图 3. 花粉一致性。
(A)冷冻新鲜采集的蜜蜂球状花粉。 (B)搅拌杯中的蜜蜂圆形花粉。 (C)蜜蜂球状花粉研磨成细粉，用于制作肉饼和糊状物。

2. 使用前校准分析天平。
3. 将地面花粉储存在真空密封冷冻袋中，每袋重量为 500 克。
4. 将地面花粉储存在 -20°C 直至准备使用。

C. 为筑巢和常规喂养准备花粉糊
1. 准备使用时，从 -20°C 冰箱中取出一袋真空密封的新鲜收集的蜜蜂花粉。
2. 一次以 100 克的增量称出所需数量的冷冻花粉。
3. 将任何未使用的地面花粉重新密封在新的真空密封袋中，适当贴上标签，然后在 -20°C 下储存。
4. 使用商业搅拌机将花粉混合成细粉稠度（图 4A-C）。
5. 将 38.5 mL 的 50/50倒糖浆添加到 100 g 地面花粉中，并用勺子混合成花生酱般的稠度（图 4A）。
6. 在工作时将湿纸巾放在花粉糊上以防止蒸发。
7. 将花粉糊转移到一次性 43 毫米铝制称重盘中。筑巢时，称出 3.0–3.25 g 花粉糊，并将偏移量放在预先称重的 35 mm ×盖子的一侧 10 毫米一次性培养皿（图 4B）。对于日常喂养，填充到盘子的顶部，但在一侧留出一个小空间，以便用镊子将其转移到微菌落室（图 4C ）。如果使用花粉作为农药暴露影响研究的给药载体，则要么从最低浓度到最高浓度，要么在切换到新剂量组时使用干净的镊子。

图 4.花粉处理。
(A)具有类似花生酱稠度的花粉糊。 (B)用于在喂食盘中进行常规喂食的花粉糊。留出一个小空隙，以便用镊子操纵喂食盘，同时将交叉污染暴露组的风险降至最低。 (C)带有初始肉饼偏移的巢菜，以便在第 5 天添加额外的花粉糊。

8. 用于筑巢的花粉饼和用于常规喂食和筑巢的糊状物应在开始或喂食当天新鲜制作。

Microcolony食品制备说明协议
1. 新鲜冷冻的花粉应在 -20°C 下储存在真空密封袋或其他密封容器中长达 2 年。如果储存时间更长，研究人员应在进行大型、耗时的实验之前确认相对于新鲜收集的花粉的适口性。
2. 50/50转化糖浆的 pH 值应在 4 到 5 之间。
3. 为了最大限度地提高实验的连续性，一项研究所需的所有花粉都应汇集和混合，以产生单一、统一的食物储备。
4. 提前研磨花粉并将其分配到一次性袋子或足以满足一次一周实验需求的袋子中，这将在实验过程中节省大量时间。

第二部分：微菌落启动和监测方案

材料和试剂

1. 新出现的B. impatiens工人（ Biobest (Romulus, MI)、 Koppert Biological Systems (Howell, MI) 或其他商业供应商；见微生物启动和监测说明 #3协议）。
2. 50/50倒糖浆和按照第一部分（上图）所述制备的花粉糊/馅饼
3. 用于记录数据的数据表（参见支持信息图 1 – 6 ）
4. 头灯（例如， Petzl Tactikka ）和/或带红光过滤器的小型手持手电筒（例如，Mini Maglight PRO LED）
5. 封口膜包装（ Masterflex ，目录号：PM992）
6. 研钵和杵（VWR，目录号：470019-978）
7. 用于覆盖工作表面的一次性纸垫（ Versi -Dry Lab Table Soakers，目录号：62080-00）
8. 20 mL 口服给药注射器（Medi-dose，目录号： NAW-2000），带有制造商提供的紧密盖（使用前在每个注射器上钻孔 1/8 英寸孔位于 2 mL 标记处）
9. 43 mm铝称重盘（ Qorpak ，目录号： MET-03105）
10. 标本钳（12 英寸长；VWR，目录号：82027-382）
11. 通用实验室胶带（VWR，目录号： 89097-912 )
12. 矩形冰盘，近似尺寸 15” L × 10” W × 6” D（VWR，目录号：10146-216）
13. 矩形塑料容器，近似尺寸 7.5” L × 5” W × 2.5” D（Cambro，目录号：42PP190）
14. 50 mL锥形管（ Corning，目录号：352070）
15. 一次性 35 mm × 10 mm 培养皿（Falcon，目录号： 351008）
16. 43 mm铝制称重盘（ QORPAK，目录号：MET-03105 ）

设备

1. 4°C实验室冰箱（Thermo Scientific，目录号：TSV18CPSA）
2. -20°C实验室冰箱（Thermo Scientific，目录号：TSX3020FARP）
3. 分析顶部装载秤/天平，0.1 mg（OHAUS，目录号：30100604）
4. 分析天平标准品：10 g、20 g 和 30 g
5. 5” 不锈钢地质筛（1.57” 深度× 5” 直径），#10 目（ SciOptic ，ASTM 10，目录号： 305 不锈钢）
6. 清除带盖的地质筛的观察顶部（参见微生物启动和监测说明 #1协议）。
7. 底板上钻有通风孔，用于放置地质筛（参见微生物启动和监测说明 #2的协议）。
8. 带温度和湿度控制的环境室

软件

1. Microsoft Excel 电子表格软件® (v16.0; Redmond, WA)
2. GraphPad Prism® （ v6；加利福尼亚州拉霍亚）

程序

A. 准备巢穴和喂食器（见微生物启动和监测说明#4协议）
1. 使用 20 mL 口服给药注射器准备糖浆进料器，在 2 mL 标记处有一个预先钻孔的 1/8” 孔。应将孔封上封口膜，以方便用对照 50/50倒置糖浆填充注射器或者，如果实验需要，可以测试含有 50/50转化糖浆的物品。
2. 通过将注射器尖端浸入含有 50/50倒置糖浆的烧杯或锥形管中填充注射器进料器或含有50/50转化糖浆的试验品通过拉起柱塞。填充糖浆后盖上注射器。
3. 取下封口膜并在实验数据表中记录糖浆重量（参见支持信息图 1以获取示例数据收集表）。
4. 按照第一部分（上图）所述准备花粉饼。

B. 为巢开始准备微菌落室
1. 用开始日期和分配的微菌落编号标记每个微菌落观察顶部。
2. 将不锈钢筛子放在底板上，将吸水纸巾放在碎片之间，并在顶部清除观察盖。
3. 将底部标有微菌落编号的 35 毫米× 10 毫米一次性培养皿的盖子放在带有 3–3.25 克筑巢起始肉饼的微菌落室中（图 5）。

图 5. 微菌落室组件。
不锈钢地质筛（1.57 英寸深× 5 英寸直径），带穿透底板（#10 目），带钻孔通风孔的底板，用于收集观察结果的透明顶部，用于进入腔室内部的可拆卸盖子和注射器进料器.采用拜耳作物科学的设计。

C. 用新出现的B. impatiens工人称重和播种微菌落（微生物启动和监测说明 #5协议）
1. 填充冰盘并将矩形塑料容器放置在冰盘中心，在冰盘内边缘放置 50 mL 锥形管，用于存放收集到的新出现的工人。
2. 将足够的新出现的工人转移到 4°C 冰箱中 10-15 分钟以支持实验（即，需要的工人数量 = [（5 个工人/微群 x 所需的微群数量）+ 10% 额外的蜜蜂占死/受伤的蜜蜂]）。
3. 将蜜蜂从 4°C 中取出，并将它们转移到冰上的浅矩形塑料容器中。
4. 接下来，一次将五只随机选择的蜜蜂转移到 50 mL 锥形管中。将锥形管转移到实验室工作台上，让蜜蜂再次活跃起来。
5. 称重前检查锥形管是否有蜜蜂死亡或损坏；根据需要更换死亡或受损的蜜蜂。
6. 五只新出现的蜜蜂为第一个微群称重锥形管。将蜜蜂添加到它们的微群中，然后称量空锥形管以确定蜜蜂的重量。在实验数据表中记录这些数字（参见支持信息图 2以获取示例数据收集表）。

D. 补充筑巢馅饼
1. 微菌落开始后五天，用额外的 ~ 2 克花粉糊补充巢开始馅饼。

E. 常规喂养（参见微菌落启动和监测说明 #6 - 9协议）
1. 小菌落开始后 7 天，给每个小菌落约 2 克花粉糊，用于在一次性 43 毫米铝称重盘中喂食。
2. 为微菌落提供新鲜的、预先称重的约 3.5 g 花粉糊和对照 50/50倒置糖浆或含有 50/50转化糖浆的试验品每周一、周三和周五，从启蒙后一周开始。
3. 将带有新花粉糊和新糖浆进料器的新盘子的重量记录到实验数据表中（有关数据收集表的示例，请参见支持信息图 1 ）。
4. 用原来的盘子和以前的糖浆进料器记录旧花粉糊的重量，以确定消耗量。
5. 为了更准确地量化花粉/糖浆消耗水平，在研究设计中包括两个蒸发控制。这些控制应该像所有其他微菌落一样设置和处理，除了它们不包含蜜蜂（参见支持信息图 3 和图 4以获取示例数据收集表）。

F. 监测微菌落和数据收集（参见微生物启动和监测说明 #10 – 12协议）
1. 整个研究期间将微菌落保持在 25°C ± 0.5°C 和 50% ± 5% 相对湿度的黑暗中。当微菌落在工作台上的环境室之外时，可以使用红光。尽可能避免使用白光。
2. 评估从开始到研究终止的每个微菌落（参见支持信息图 5以获取示例数据收集表）。
3. 在每次观察期间，收集以下信息： 1）死亡工人的数量； 2) 距首次无人机出现的天数； 3）出现的无人机数量； 4) 无人机重量。
4. 可选的，可以收集其他信息，包括 1) 首次打开蛋室的时间； 2) 天数到第一次封盖蛋室； 3) 到第一个幼虫质量的天数； 4) 第一个蛹细胞的天数。
5. 即周一、周三和周五），应移除任何出现的无人机。移除后，分别称量每架无人机（参见支持信息图 6以获取示例数据收集表）。
6. 可选但鼓励：从每个实验组中随机选择并拍摄至少一个微菌落（建议在星期三），以捕捉微菌落的进展和发育里程碑。

G. 终止微菌落
1. 2麻醉对工人、无人机和剩余的育雏实施安乐死，然后转移到 -80°C。

微生物启动和监测记录协议
1. 可以根据图 6A 和 6B 中详述的规格制作观察顶部。按照设计，顶部有一个 5 英寸直径的凹槽环，可防止盖子从筛子顶部滑落。但是，可以使用其他顶部设计，只要它们 1) 足够大以覆盖筛子 [蜜蜂将被安置在筛子的网状底板和观察顶部之间的空间中（参见图 7）]，具有注射器进料器的开口，并有通风孔以允许空气流通。

图 6. 微菌落观察顶部、可拆卸盖子和底板的材料和测量值。
可以根据所示规格重建先前使用的微菌落室观察顶部(A) 、可拆卸盖子(B)和底板和(C) （Camp等人， 2020a，2020c；Weitekamp等人， 2022）。直径= 直径。

2. 底板可以根据图 8C 中详述的规格制造。底板的设计是为了防止蜜蜂排泄物和其他通过筛孔底板的碎屑污染其他微菌落并污染环境室。底板的设计包括一个直径为 5 英寸的凹陷环，筛子落入该环。然而，调查人员可以使用任何底板设计，只要底部有通风孔以允许空气流通，并且足够大，筛子可以放在上面。
3. 使用此协议时，不应由随机年龄的工人启动微菌落。使用年龄匹配的新出现的工作人员可以减少将与年龄相关的死亡与治疗效果混淆的可能性，并促进实验中和实验之间微菌落之间的一致性。使用本协议时，调查人员应使用本协议的新鲜或新鲜冷冻的蜜蜂采集的球状花粉。使用旧的（即>2 岁）或不正确储存的花粉提供微菌落可能会影响微菌落的进展和生产力。
4. 用于筑巢的花粉饼和用于常规喂食的糊状物应在开始或喂食当天新鲜制作。
5. 由于工人规模会影响微群落巢的发育和工人的食物消耗率（Peat 和 Goulson，2005 年；Couvillon 和 Dornhaus，2010 年；Amsalem 和 Hefetz，2011 年；Roger等人， 2017a，2017b），因此鼓励协议用户播种微群落与质量相似的蜜蜂。
6. 必须向微菌落提供随意接触花粉和糖浆的机会。限制获取食物供应将破坏小菌落的发展，降低生产力，并使实验结果的解释复杂化。
7. 延迟提供专门用于喂食的花粉是为了减少工人试图在花粉喂食和筑巢肉饼上产卵的可能性。
8. 在喂养发育中的幼虫时，小菌落会消耗更多的花粉。因此，最好给生产性微菌落约 3.5 克花粉糊，以尽量减少花粉耗尽的风险。
9. 除非需要保留以进行其他分析，否则请丢弃旧的花粉盘。
10. 为了帮助保持蜜蜂在操纵微菌落时保持冷静，请将腔室放在可吸收振动的一次性纸垫上。
11. 为了促进整个微菌落的一致性，请在环境室内旋转单个微菌落的位置。
12. 如果创始工人在前 24 小时内死亡，则将其替换为新出现的工人（获取新工人的权重）。
13. 由于微群落中工蜂的数量会影响巢穴生产力（Gradish等人， 2013 年）和食物消耗率，因此鼓励协议用户在整个实验过程中跟踪死亡工蜂的数量。
14. 无人机的生产是微殖民地成功的关键指标。首次无人机出现的时间、无人机数量和无人机重量都可以轻松量化。重要的是，所有这些措施都可能受到实验处理的影响，这些处理提供了关于测试材料如何影响微菌落的见解。

数据分析

这对协议旨在探索农药暴露对微菌落进展和生产力的影响（参见 Camp等人，2020a、2020c； Eitekamp 等。 , 2022)。在这种情况下，这些协议可以很容易地用于解决各种研究问题，从而使研究人员能够深入了解大黄蜂生物学的其他方面。根据使用该系统的经验，每个实验组应使用 8-10 个微菌落。下面概述了如何使用该协议处理和分析从农药暴露影响研究中收集的数据。可以在Camp等人中找到处理和分析这些端点数据的详细方法。 (2020a, 2020c) 和 Weitekamp等人。（2022 年）。为了帮助新的调查人员，样本数据收集表以及有关如何记录和处理微菌落数据的指南在本协议末尾作为补充信息提供。
微菌落数据的分析可以分为两个相互关联的部分。对于第一部分，应目视检查微菌落并拍照，以确定与处理相关的对巢进展的影响。根据该协议建立的微菌落将根据图 7 所示的时间线进行。每周收集观察时，未封盖的蛋室将在第 1 周结束时出现。封盖的蛋室有时会在第 1 周后期出现，但最常见的是在结束时第 2 周。在第 2 周和第 3 周可以检测到幼虫团块。蛹细胞将在第 3 周和第 4 周出现。第一批雄蜂在第 5 周出现，并将在研究的剩余时间里继续出现。如果需要，可以更频繁地收集观察结果，以梳理出对微菌落发育的微妙影响。但是，收集观察结果非常耗时，并且频繁的中断可能会影响工人的行为并最终影响研究结果。

图 7. 七周发育过程中的微菌落进展。
由五名新出现的B. 凤仙花工人启动微菌落，并提供花粉糊 (3 g) 和 50/50倒置糖浆的巢启动肉饼刺激筑巢。 5天后，给巢穴额外添加2克花粉糊。从第 7 天开始，每周一、周三和周五给微菌落提供新鲜的花粉糊和糖浆。从第 0 天开始（即巢开始），照片显示了从无盖卵室到第 49 天研究终止的微菌落进展。上面带有标签的条形表示特征通常出现的范围。编号的圆圈表示微菌落的特征，包括 1 = 巢起始肉饼，2 = 第 5 天给予的花粉补充剂，3 = 未封盖的卵室，4 = 幼虫质量，5 = 蛹细胞和 6 = 疏散的蛹细胞。

除了定性评估微菌落状态外，还应统计分析来自不同终点的数据，包括微菌落发育里程碑（即，第一次开盖卵室的时间、第一次加盖卵室的天数、第一次幼虫质量的天数和第一次蛹的天数细胞）、糖浆和花粉的消耗、无人机的生产和重量以及工人的生存。这些数据应表示为平均值±标准偏差 (STDEV)。使用 GraphPad Prism ® (v6; La Jolla, CA)，可以通过单向方差分析 (ANOVA) 和 Dunn 的多重比较检验来评估对照组和治疗组之间的差异。如果根据 Brown-Forsythe 或 Bartlett 检验，方差显着不同，则使用具有 Dunnett 多重比较检验的非参数 Kruskal-Wallis。

数据报告
为了在研究之间进行比较并促进研究复制，鼓励研究人员报告 1) 用于喂养的糖浆配方，2) 花粉来源和年龄，3) 工蜂的年龄和来源，以及 4) 环境条件（即，温度、相对湿度和光照方案）在实验期间使用。此外，还应记录和报告开始、结束和数据收集日期。所有数据都应作为补充信息或通过科学数据的公共存储库提供给其他研究人员。

数据分析笔记
1. 在调查农药暴露对微菌落发育和生产力的影响时，研究人员应在研究设计中包括未处理的对照组、阳性对照组和溶剂对照组（如果适用）。在进行农药暴露研究时，还应包括蒸发控制以纠正食物消耗估计。
2. 需要时，可以通过糖浆和/或花粉供应将杀虫剂递送至小菌落。通过糖浆施用杀虫剂通常比花粉更容易。然而，并非所有农药都是水溶性的，因此，可能需要溶剂来溶解测试材料。在这种情况下，研究人员需要凭经验确定用于实验的合适溶剂浓度 [例如，1% 丙酮（Camp等人， 2020b） ]。
3. 在评估农药暴露对微菌落的影响时，传递载体（即花粉或糖浆）会影响研究结果。发育中的大黄蜂育雏会消耗大量花粉，因此，通过花粉传递测试材料可能会针对育雏。至此，啶虫脒在花粉中递送，但在糖浆中递送时，降低了无人机的平均重量（Camp等人， 2020a，2020c；Weitekamp等人， 2022）。因此，仅通过糖浆给药可能会错过重要的育雏效果。
4. 糖浆和花粉消耗值应根据蒸发进行校正，在确定每只蜜蜂的消耗量时，应根据工人死亡率进行校正。此外，如果装满糖浆的注射器泄漏，导致消耗值不准确，则应将该值替换为该治疗组和当天的平均糖浆消耗值。
5. 已发表的结果表明，微菌落模型可能仅适用于评估对成年工人具有低毒性的物质的育雏效应（Krueger等人， 2021 年）。

食谱

1. 山梨酸钾溶液
通过将 25 g 山梨酸溶解在蒸馏水中以达到 100 mL 的最终体积，制备 25% w/v 山梨酸和钾盐溶液；无菌过滤器 (0.45 µm) 并在 4°C 下储存长达 90 天。

致谢

作者感谢 Drs。 JE Simmons、C. Weitekamp 和 YH。 Kim 对这份手稿进行了深思熟虑和批判性的审查。作者也感谢 Drs。 D. Schmehl、A. Cabrera、J. Strange 和 D. Cox-Foster 的慷慨和指导。该协议改编自之前发表的同行评审期刊（Camp等人， 2020a，2020c；Weitekamp等人， 2022）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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