材料和试剂

1.带锁头的玻璃注射器 2 mL（Cadence Science， S库存单位：2407）
2.带锁头的玻璃注射器 5 mL（Cadence Science， S库存单位：2417）
3.不锈钢304注射器针头，非取芯点2英寸12G（Sigma-Aldrich，目录号： Z116947-1EA）
4.不锈钢304注射器针头，非取芯点6英寸20G（Sigma-Aldrich，目录号： Z102709-1EA）
5.离心管50 mL（AS One，目录号： 2-3939-03）
6.微量管 1.5 mL（AS One，L-2057）
7.VIOLAMO 5 mL管（AS One，目录号： 2-4118-01）
8.离心管15 mL（AS One，目录号： 1-3500-21）
9.圆形盖玻片Φ12mm No.1（Matsunami，目录号： C012001 ）
10.白色载玻片玻璃磨边 S1111（AS One，目录号： 2-154-01）
11.带针头的 Terumo 注射器 2.5 mL 23G 蓝色（AS One，目录号： 1-2044-03）
12.Parafilm膜（Amcor，Parafilm M，目录号：PM996）
13.CELLect ®胎牛血清，500 mL（FBS；MP Biomedicals，目录号： 2917354H）
14.高纯氩气，>99.9999 vol.%
15.钴（II）乙酰丙酮化物，97％（Co前体；Sigma-Aldrich，目录号：227129-50G）
16.铁（III）乙酰丙酮化物，99.99％（Fe前体；Sigma-Aldrich，目录号：517003-50G）
17.硝酸银，99.9999%（Ag前体；Sigma-Aldrich，目录号： 204390-10G）
18.1,2-十六烷二醇，90% （Sigma-Aldrich，目录号：213748-50G）
19.油胺，70% （Sigma-Aldrich，目录号：O7805-500G），储存于 4°C
20.油酸，90% （Sigma-Aldrich，目录号：364525-1L），储存于 4°C
21.四甘醇（Sigma-Aldrich，目录号：110175-1KG）
22.丙酮，99.5%（Kanto Chemical，目录号： 01026-70）
23.己烷，96%（Kanto Chemical，目录号： 18041-70）
24.氯仿，99%（Kanto Chemical，目录号： 07278-70）
25.甲苯，99%（Wako Pure Chemical，目录号： 201-01871）
26.1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N- [甲氧基（聚乙二醇）-350]（PEG350-DOPE；Avanti，目录编号： 880430O-25MG )，储存于 − 20°C
27.1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N- （戊二酰）（18：1戊二酰PE；Avanti，目录号： 870242C-25MG），储存于-20°C
28.2-吗啉代乙磺酸，一水合物，（MES；Dojindo，目录号： 341-01622）
29.N-羟基琥珀酰亚胺（NHS；Thermo Fisher Scientific，目录号： 24500），储存于 4°C
30.乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC；Dojindo，目录号： 346-03632），储存在 4°C
31.氨基葡聚糖，MW。 10,000（aDxt；Thermo Fisher Scientific，目录号： D1860），储存于 4°C
32.Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS；Nissui Pharmaceutical，目录号：05913），储存于 4°C
33.Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM；Nacalai Tesque，目录号： 08456-36），储存在 4°C
34.COS-1 细胞（可从美国典型培养物保藏中心获得，目录号： CRL-1650 ）
35.-L-赖氨酸（PLL）溶液，0.01%（Sigma-Aldrich，目录号： P4832-50ML ）
36.4%-多聚甲醛磷酸盐缓冲液，500 mL（PFA；Nacalai Tesque，目录号： 09154-85），储存于 4°C
37.Digitonin（Wako Pure Chemical，目录号： 043-21376），储存于 4°C
38.氯化铵（NH 4 Cl，Wako Pure Chemical，目录号： 015-02991）
39.牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich，目录号： A8022-50G），储存于 4°C
40.Alexa Fluor ® 647 小鼠抗人 CD107A（AF647@CD107A；BD Biosciences，目录号： 562622），储存于 4°C
41.4 ',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；Thermo Fisher Scientific，目录号： D1306），储存于 4°C
42.VECTASHIELD ® Antifade 封固剂（Vector Laboratories，目录号： H-1700），储存于4°C
43.MES 缓冲液（0.1 M，pH ~6）（见配方）
44.PBS 缓冲液（见配方）
45.洋地黄皂苷溶液（见配方）
46.氯化铵溶液（见配方）
47.DAPI 染色溶液（见配方）
48.蛋白酶抑制剂溶液 (PIS) （见配方）
注：标明了具体的储存温度。否则，化学品将在室温 (RT) 下储存。

设备

1.分析天平（赛多利斯，型号：ME253P）
2.三颈圆底烧瓶 50 mL，带斜颈，中心接头：ST/NS 29/42，侧接头：ST/NS 15/25（Tokyo Garasu Kikai，目录号： 371-13-06-01）
3.强力磁力搅拌器椭圆形Φ 12 × 25 mm（AS One，目录号： 4-2687-04）
4.Laboran螺旋管瓶13.5 mL（玻璃小瓶；AS One，目录号： 9-852-06）
5.Liebig冷凝器300 mm，底部接头：29/42，顶部接头：19/38（Tokyo Garasu Kikai，目录号： 330-15-51-14）
6.数字高精度温度控制器（AS One，TJA-550，目录号： 1-6124-01）
7.地幔加热器 50 mL（Tokyo Technological Labo，型号： S-05 ）
8.大功率搅拌器（AS One，HPS-100，目录号： 1-4136-01 ）
9.流量计（Kofloc，型号：RK1250）
10.隔垫橡胶，白色，天然，用于 18 mm 管（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号： 195-11771，日本商品编号：4987481378957）
11.Fisherbrand TM巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号： 22-063156）
12.双元件热电偶 WK- Φ 3.2×200（AS One，目录号： 3-9391-14）
13.陷阱球体，顶部和底部接头：29/42（Tokyo Garasu Kikai，目录号： 330-15-91-07）
14.冷冻离心机（Kubota，型号：5910（带 RS-410M 转子））
15.紫外-可见吸收分光光度计（JASCO，型号：V-750）
16.双颈圆底烧瓶 50 mL，带有倾斜的侧颈、中心接头和侧接头：14/24
17.TS 单颈圆底烧瓶 100 mL，15/25，带玻璃塞（Climbing Co., ltd., CL0070-05-11）
18.Sonicator （AS One，超声波清洁器 ASU-6，振荡频率：40 kHz）
19.高速微型离心机（日立工机，型号：Himac CF15RXII（配T16A31转子））
20.超速离心机（Eppendorf Himac Technologies，型号：CS100FNX（带 S100AT4-2004 转子））
21.37 °C和 5% CO 2培养箱（ESPEC，型号：BNA-111）
22.共焦激光扫描显微镜（CLSM；奥林巴斯，型号： FV1000D）
23.Cell Lifter（康宁，产品编号：3008）
24.MidiMACS 分离器起始试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号： 130-042-301）
25.MS 柱（Miltenyi Biotec，目录号： 130-042-201）
26.高速冷藏微型离心机 [Tomy Seiko，型号：MDX-310（配 AR015-24 转子）]

软件

1.斐济（NIH/ https://imagej.net/software/fiji/ ），带有颜色聚类和 coloc 2 插件

程序

A.通过多元醇和一锅法合成制备 MPNPs
注：使用该方法形成 MPNPs 的详细信息可参见 Takahashi 等人。（2015 年）。
用于合成 MPNPs 的玻璃器皿如图 1 所示。

图1。用于制备 MPNP 的玻璃器皿。
(A) 捕集球，(B) 三颈圆底烧瓶，(C)李比希型回流冷凝器，(D) 带针头的玻璃注射器，(E) 夹子，(F) 椭圆形磁力搅拌棒，(G) 巴斯德吸管, (H) 玻璃小瓶, (I) 隔垫橡胶, (J) 针和 (K) 热电偶。

1.称取 0.1 mmol 硝酸银和 1.0 mmol 1,2-十六烷二醇。
2.在三颈圆底烧瓶中放置一个椭圆形磁力搅拌棒，然后将称重的硝酸银和 1,2-十六烷二醇转移到烧瓶中。然后，依次使用移液器加入10 mL 的四甘醇、10 mmol（3.29 mL）的油胺和 8 mmol（2.55 mL）的油酸。
注意：从冰箱中取出油胺和油酸瓶后，将它们放入 35°C 的水浴中直至完全融化，然后使用移液器吸取所需体积。
3.准备两个 13.5 mL 玻璃小瓶。
4.称重 0.2 毫摩尔的钴 (II) 乙酰丙酮化物和 0.2 毫摩尔的铁 (III) 乙酰丙酮化物。将它们转移到标记为 Co 和 Fe 前体的玻璃小瓶中。然后，依次加入 2 mL 油胺和 1 mL 甲苯。
5.称量 0.1 毫摩尔的硝酸银，并将其转移到标记为 Ag 前体的剩余玻璃瓶中。然后，依次加入 1 ml 油胺和 1 mL 甲苯。
6.用封口膜密封两个小瓶的盖子，并将它们放在具有高功率模式的超声波仪中，以完全溶解所有试剂。
注意：为了快速溶解试剂，在此过程中可以将小瓶加热到大约 40 °C 。此步骤没有时间限制，但应在注射步骤之前准备好。
7.准备两个隔垫，如图 2 所示。
注意：使用 12G 针打孔，将巴斯德吸管插入橡胶隔垫。在孔中加入一些乙醇可以使插入更容易。插入后乙醇会蒸发。

图 2 。为 Ar 起泡准备的隔垫橡胶。
稍后，将针从隔垫（顶部）中取出以插入热电偶。

8.装有反应原料（步骤A2制备）的三颈圆底烧瓶放在套式加热器上。
9.将捕集球连接到烧瓶的中心颈部，并用夹子夹住它们。然后，插入冷凝器管，并将冷凝器的另一端连接到含有液体石蜡的捕集器（图 3）。
注意：回流冷凝器使用空气，没有自来水。

图 3. (A) 用于制备 MPNP 的实验装置的插图和 (B) 照片。

10.使用图 2 所示的隔膜密封剩余的两个开口颈部。
注意：用于 Ar 鼓泡的巴斯德吸管的尖端应浸入反应溶液中，但不要接触磁力搅拌棒。
11.以 150 rpm 的速度打开磁力搅拌器，并通过巴斯德吸管以 0.35 L/min 的流速泵入 Ar 气体。气体通过 12G 针流出。静置 5 分钟，完成用 Ar 气置换烧瓶中的气氛。
12.取下针头，插入热电偶。
13.打开温度控制器，并将温度设置为 100 °C。
注意：由于溶液在室温下的高粘度，搅拌速度不能立即设置为 500 rpm。因此，在温度升高的同时，慢慢提高搅拌速度。在 50°C 时，搅拌速度可完全设置为 500 rpm。该步骤的升温速率约为12-13 ° C/min 。
14.从温度达到100°C 的那一刻起，保持 10 分钟。在此步骤中，形成了银种子。
注意：可能会观察到过热，其中温度升高到 100°C 以上。稍微降低加热套以减少其与烧瓶的接触会降低温度。
15.通过将温度控制器设置为 300°C ，将温度提高到 250° C。注意：此设置的目的是将温度线性升高到250°C （图 4）。

图 4。 MPNPs制备过程的温度曲线。

16.在温度升高期间，一旦达到 170°C，使用玻璃注射器和 20 G 针注入预先制备的 Fe 和 Co 前体混合物。
注意：针通过包含热电偶的隔膜插入。以快速的速度逐滴注入溶液，持续 1 分钟。通过稍微降低加热罩以减少与烧瓶的接触，温度应保持在 170°C 左右。从 100°C到 170°C的加热速率约为 12 ° C/min 。
17.一旦温度达到 250°C ，使用玻璃注射器和另一个 20G 针注入预先制备的 Ag 前体。然后，立即将控制器的温度重置为 230°C。保持反应10分钟。
注意：这是最重要的一步。 Ag 前驱体的注入通常在大约 20 秒内完成。它不应小于 10 秒，或长于 30 秒。注射后，稍微降低加热套以减少与烧瓶的接触，以免过热。我们确认反应时间可以延长到 15 分钟，但 MPNP 的质量没有受到影响。从 170°C到 250°C的加热速率约为 9 °C/min 。
18.将温度控制器设置为 0 °C 以停止加热，然后取下地幔加热器。等待反应体系自然冷却，同时继续搅拌和Ar鼓泡。此时，部分合成颗粒会附着在磁力搅拌棒上，但在冷却过程中会再次重新分散。
19.一旦反应溶液的温度低于 70°C ，停止 Ar 气流，并关闭磁力搅拌器。
20.小心拆卸装置，用移液器将反应溶液从三颈瓶中均匀转移到两个 50 mL 离心管中。
21.加入丙酮，将管子填充至 45 mL。然后，使用 Kubota 5910 在 4,640 × g和RT下进行离心5 分钟。
22.丢弃所有上清液，并在每管中加入 400 μL 的己烷，以重新分散 MPNP。
23.使用微移液器将 200 μL 的再分散 MPNP 溶液转移到另外两个 50 mL 管中。随后，总共填充高达 45 mL 的丙酮，并使用 Kubota 5910 在 4,640 × g和RT下进行离心5 分钟。
24.丢弃上清液，将获得的 MPNPs 重新分散在 3 mL 的氯仿中。使用紫外-可见吸收分光光度计通过吸收光谱确定MPNP 分散体的浓度。
注：MPNPs 的浓度使用y = 0.024x的校准曲线确定，其中 y 是 MPNPs 的局部表面等离子共振的吸收峰值， x是 MPNPs 的浓度 (µg/mL)。
25.将获得的 MPNPs 储存在 4°C 的氯仿中，放入带封闭顶盖的玻璃小瓶中。用封口膜密封。

B.聚乙二醇化磷脂中 MPNP 的封装
1.准备一个 50 mL 的双颈圆底烧瓶（图 5A）。
2.将 3 mL 的 MPNPs 以 1 mg/mL 的浓度分散在氯仿中，倒入烧瓶中。随后，在氯仿中加入 1，350 μL 的 18:1 戊二酰 PE（5.5 mM），在氯仿中加入 900 μL 的 PEG350-DOPE（5.5 mM）到分散体中。
3.使用隔膜橡胶密封，将装有巴斯德移液器的隔膜放在中心颈部，将含有针头的隔膜放在倾斜的颈部。
注意：巴斯德移液器的尖端不应浸入分散液中。
4.以 0.5 L/min 的速率泵入 Ar 气体，以完全蒸发氯仿（图 5B）。
注意：在此步骤中，惰性气体可以是 Ar 或 N 2 。

图 5. (A) 玻璃器皿和 (B) 在聚乙二醇化磷脂中封装 MPNP 的实验装置。

5.添加 1.5 mL 的去离子水以重新分散获得的沉淀。将分散液收集到两个 1.5 mL 离心管中。
6.Hitachi CF15RXII高速微型离心机以 1,400 × g和RT离心5 分钟，以消除大的聚集颗粒。
7.小心地将离心管中的上清液转移到两个新的 1.5 mL 管中。然后，使用CS100FNX超速离心机在 86,600 × g和4°C下离心10 分钟，以去除空胶束。
注意：在此步骤中，如果 MPNP 未完全收集，则将离心速度提高到 100,000 × g。
8.丢弃上清液，将获得的颗粒重新分散在 1 mL 的去离子水中。
9.从吸收光谱中确定磷脂包裹的 MPNPs 的浓度。

C.使用 EDC 偶联反应偶联 aDxt
1.将 20 mL 的 MES 缓冲液（pH ~6）添加到包含磁力搅拌器的 100 mL 单颈圆底烧瓶中。
2.将磁力搅拌器设置为 600 rpm。
3.在烧瓶中加入 1 mL 的磷脂封装 MPNPs 分散体（1 mg/mL）。然后，在去离子水中依次添加 125 μL 的 EDC（200 mM）和 MES 缓冲液中的 250 μL NHS（200 mM）。将其留在RT 30 分钟。
注意：从冰箱中取出后，使用前将 EDC 和 NHS 平衡至 RT。
4.将得到的反应混合物转移到 20 × 1.5 毫升管。
5.CS100FNX在 86,600 × g和4°C 下离心10 分钟，小心去除上清液。
6.使用微移液器收集并将获得的颗粒重新分散在 1 mL 的 PBS 中。
7.准备一个 100 mL 的单颈圆底烧瓶，其中含有 19 mL 的 PBS。
8.将 50 mg aDxt 加入烧瓶中的 PBS 溶液中（步骤 C7 中制备），并在磁力搅拌下等待其完全溶解。
9.将 MPNPs 的 PBS 分散体（在步骤 C6 中制备）添加到 aDxt 的 PBS 溶液中（在步骤 C8 中制备）。然后，在 RT 下保持反应 90 分钟。
10.将获得的混合物转移到 20 × 1.5-mL 管中。然后，使用CS100FNX在 60,000 × g和4°C 下离心10 分钟。在 1 mL 的 PBS 中收集并重新分散获得的颗粒。
11.确定分散体中 aDxt 共轭 MPNP (aDxt-MPNP) 的浓度，使用吸收光谱。

D.用于研究 MPNPs 细胞内运输的脉冲追踪实验
笔记：
a.在脉冲追踪实验中，脉冲是 aDxt-MPNPs 与 COS-1 细胞孵育一段时间（t load ）。在加载步骤之后，去除未掺入细胞中的过量 aDxt-MPNP。细胞在新鲜培养基中进一步培养一段给定的时间，t追逐。本实验的目的是找到最佳的t追逐，以使 aDxt-MPNPs 通过内溶酶体途径到达溶酶体区室。
b.这些实验是在无菌条件下的洁净工作台上进行的。
1.将 10 – 20 个灭菌的圆形盖玻片放入 10 厘米的培养皿中。
2.在 10 厘米的盘子中加入 5 mL 的 0.01% PLL 溶液，并使用镊子在 RT 的 PLL 溶液中浸入圆形盖玻片 5 分钟。
3.取出 PLL 溶液，用铝箔覆盖，铝箔部分打开，在干净的工作台上自然干燥过夜。
4.第二天，使用 5 mL 的 PBS 缓冲液清洗 PLL 涂层盖玻璃三次。
5.使用镊子将四个盖玻璃放在 24 孔板的每个孔中，这对应于1 小时、2 小时、4 小时和 7 小时的不同t追逐值。
注：盖玻片的数量根据被调查的数量增加。在 COS-1 细胞的情况下，最大 t追踪在 7 小时进行。但需要注意的是，t追逐的长度取决于不同的细胞系。因此，本实验的孵育时间可以轻松定制。
6.°C下 5% CO 2下在 DMEM (+10% FBS) 中孵育过夜。
7.提前在明场显微镜（Keyence，型号： BZ-X810）下检查细胞的健康和融合情况。
8.第二天，取出培养基，在 RT 处用 500 μL 的 PBS 清洗细胞。
9.°C下在 5% CO 2下孵育 30 分钟。
10.在完成饥饿过程前大约 10 分钟，将 MPNPs 添加到 DMEM（+10% FBS）中，以制备浓度为 100 μg/mL 的 MPNPs 分散体。
11.饥饿后立即用 500 μL 的 MPNPs 分散在 DMEM（+10% FBS）（在步骤 D10 中准备）替换没有 FBS 的 DMEM，并在 37 °C下在 5% CO 2下孵育t负载= 1 小时。
12.孵育 1 小时后，去除分散液，并用 500 μL 的 PBS 洗涤一次。然后，添加 500 μL 的预热 DMEM（+10% FBS），并在 5% CO 2下在 37 °C下孵育t追逐：0 小时、2 小时、4 小时和 7 小时。
注意：t追逐在不同的细胞系中会有所不同。因此，可以适当地定制潜伏期。
13.完成t追逐后，用 500 μL 的 PBS 洗涤 3 次，并在 RT 下向每个孔中加入 500 μL 的 4% PFA 15 分钟。
注意：由于 PFA 是一种有毒化学物质，工作人员必须穿实验室外套和化学防护手套。此步骤应在配备通风系统和防护窗扇的洁净工作台中进行。此外，使PFA溶液远离火焰或热源。 PFA 应作为危险废物妥善处置。固定后，可在洁净工作台外进行以下步骤。不需要无菌条件。
14.用 500 μL 的 PBS 洗涤 3 次，加入 500 μL 的 50 μg/mL 地黄皂苷-PBS 对每个孔进行渗透，然后等待 5 分钟。
15.用 500 μL 的 PBS 洗涤 3 次，在每口井中加入 500 μL 的 50 mM NH 4 Cl-PBS，等待 10 分钟。
16.用 500 μL 的 PBS 洗涤 3 次，每孔加入 500 μL 的 3 wt% BSA-PBS，等待 30 分钟进行封闭。
17.对于每口井，加入 500 μL 的 3 wt% BSA-PBS，其中含有 2 μL 的 AF647@CD107A 用于染色溶酶体，并添加 0.25 μL 的 100 μg/mL DAPI 用于染色细胞核。在室温下等待 1 小时，或在 4°C 下过夜。
18.用 500 μL 的 PBS 洗涤三次。对于每个洗涤步骤，加入 PBS 后等待 5 分钟。
19.将一滴防褪色封固剂加到白色载玻片磨边上，用镊子小心地取下盖玻片，然后将其放在玻璃基板上进行观察，使细胞表面与封固剂接触。确保没有气泡并在必要时去除多余的液体。
20.将它放在黑暗的地方几个小时，直到它完全干燥。然后，使用 CLSM观察样本。

E.在 CLSM 下观察加载 MPNPs 的细胞
1.选择 405、473 和 635 nm 激光器分别用于激发 DAPI、aDxt-MPNP 和 AF647。
2.对于 DAPI 染料，选择屏障滤光片 (BA) 435 – 455 nm。
3.对于 aDxt-MPNPs 的等离子体散射信号，请选择无屏障滤波器，因为与荧光染料不同，来自 aDxt-MPNPs 的散射信号具有与激光波长相同的波长。
4.对于 AF647 染料，选择 BA 655–755 nm。
5.捕获超过五个不同随机选择区域的 CLSM 图像。将 DAPI 信号分别记录到等离子体散射信号和 AF647 荧光（图 6）。
6.使用 ImageJ 软件确定阈值 Manders 的共定位系数 ( R t )，对 aDxt-MPNP 和溶酶体进行共定位分析。

图 6。由 CLSM 捕获的 0 h、2 h、4 h 和 7 h 的不同t追踪值下加载 aDxt-MPNP 的 COS-1 细胞的 CLSM 图像（比例尺：20 µm）。
如文中所述，细胞核（蓝色）和溶酶体（红色）分别被 DAPI 和 AF647 染色。通过等离子体散射信号观察到 aDxt-MPNP。使用 ImageJ 获得合并的图像。经Le等人的许可改编。（ 2022 年）。版权所有 2022 美国化学学会。

F.aDxt-MPNPs 在溶酶体中的积累、均质化和溶酶体的磁分离
1.种子 2 × 10 6 COS-1 细胞/培养皿用于两个 10 厘米培养皿，并在 DMEM（+10% FBS）中孵育 24 小时。
2.提前在明场显微镜（Keyence，型号： BZ-X810）下检查细胞的健康和融合情况。
注意：通过使用明场显微镜确认它们在细胞培养皿上的贴壁状态来检查 COS-1 细胞的健康状况。此外，还同时检查了污染的可能性。在这个特定的实验中，细胞的汇合率估计低于 80%。但是，它会根据细胞类型而改变。所需的细胞汇合率为 70% 至 80%。如果细胞很好地粘附在培养皿上而没有被污染，并且融合度在 70-80% 左右，则可以进行下一步。
3.对于细胞饥饿，在每个细胞培养皿中加入 5 mL 不含 FBS 的预热 DMEM，并在 37°C、5% CO 2下孵育30 分钟。
4.在完成饥饿过程前约 10 分钟，将 MPNPs 添加到 DMEM（+10% FBS）中，以制备 10 mL 的 MPNPs 分散体，浓度为 100 μg/mL。
5.DMEM (+10% FBS)中的 MPNPs（在步骤 F4 中制备）替换没有 FBS 的DMEM ，并在 37ºC 下在 5% CO 2下孵育8 小时。
注：在本研究中，我们选择 t load = 8 小时装载。 t load强烈影响溶酶体的分离产量。根据 MPNP 对细胞的细胞毒性，该参数可以延长。
6.丢弃含有培养基的 aDxt-MPNPs，并用预热的 PBS 洗涤一次。
7.添加 5 mL 的 DMEM（+10% FBS），并进一步孵育t追逐= 7 小时。最佳t追逐已经在脉冲追逐实验部分确定。根据细胞类型，此参数可能会有所不同。
8.将必要的设备，包括磁柱、MidiMACS 分离器、带 23G 针头的 2.5-mL 注射器（带针头的 Terumo 注射器 2.5mL 23G 蓝色）和 5-mL 试管放入温度保持在 4° 的冷藏室中C，在脉冲追踪实验前至少 30 分钟，以平衡温度。如果没有冷藏室，请使用冰盒来存放设备。
9.丢弃培养基，用 PBS 清洗细胞。
10.在每个培养皿中加入 1.5 mL 的冷 PBS，并将它们放在冰上。
11.使用 Cell Lifter 刮掉细胞，并将它们从两个培养皿转移到 15 mL 离心管中。使用带有 ST-720 摆动斗式转子的 Kubota 5910在 190 × g和 4°C 下离心 4 分钟。
注意：在此步骤中，可以通过细胞颗粒的颜色对颗粒吸收量进行定性评估（图 7）。颜色越深，内化的粒子数量越多。如果细胞颜色仍然是白色，则意味着吸收效率非常低。溶酶体的分离可能会失败。
12.弃去上清液，加入 1 mL 冰冷的 PIS 以重新悬浮细胞颗粒。然后，转移到 5 mL 管中，并保存在冰箱中。
注：此步骤后，实验在低温室继续进行，温度保持在 4°C。

图 7。 aDxt-MPNPs 加载 COS-1 细胞的照片， t负载= 8 小时， t追逐= 7 小时。

13.使用带有 23G 针头的 2.5 mL 注射器，反复（15 次）将细胞悬液通过注射器，以使细胞均质化。
注意：必须通过实验确定最佳通道数（图 8）。均质效率低会明显影响溶酶体分离的产量。相反，通过增加通道数来提高均质化效率也可能导致溶酶体被破坏。因此，在这项研究中，留下了一小部分未破碎的细胞或大细胞碎片。

图 8。相衬模式下COS-1细胞的明场图像。
(A) 之前和 (B) 使用带有 23G 针头 (15通道) 的注射器进行均质化之后。在均质化之前，可以清楚地看到细胞被明亮的光晕包围的高密度暗区。均质化后，细胞数量减少，由于细胞膜破裂，细胞混合物变成浆液。因此，明亮光晕的数量显着减少。仍然可以观察到一小部分未破碎的细胞或浆液中的大细胞碎片。比例尺，100 µm。

14.在 MidiMACS 分隔符中放置一个 MS 列。
注意：本实验也可以使用另一种 MACS ®色谱柱，例如 LS 色谱柱。
15.通过添加 1 mL 的 PIS 来平衡 MS 色谱柱。丢弃流通。
16.将细胞裂解物（在步骤F13中制备）转移到 MS 色谱柱，并让细胞裂解物通过色谱柱。磁性部分将被困在色谱柱内，而非磁性部分将通过色谱柱。
17.丢弃流过。使用 1 mL 的 PIS 清洗色谱柱两次，以进一步消除未结合的材料。
18.从 MidiMACS 分离器中移除 MS 色谱柱。
19.添加 0.5 mL 的 PIS，并插入柱塞以在 1.5 mL 微管中收集含有溶酶体的磁性部分。再次重复此步骤。
20.将获得的悬浮液以 5,000 × g离心和 4°C 10 分钟，使用 MDX-310系统。
注意：此步骤是去除分离部分中剩余的可溶性蛋白质。
21.丢弃上清液，将获得的溶酶体颗粒重新分散在 100 μL 的 PIS 中。
注意：如果对分离的溶酶体部分进行蛋白质组分析，则将颗粒重新悬浮在 50 mM 三乙基碳酸氢铵中。

数据分析

aDxt-MPNPs 和溶酶体的共定位分析使用 ImageJ 进行。首先，打开图像，然后选择“插件” “分割” “颜色聚类”。之后，在新窗口的“通道”部分中，为图像选择合适的颜色。对于这种特定情况，aDxt-MPNP 和溶酶体的图示颜色分别为绿色和红色。接下来，按“运行”，然后选择“显示结果”，得到分割后的图像。请注意，一次只能处理一张 aDxt-MPNP 或溶酶体的图像（图 9）。获得分割图像后， R t 表示与 aDxt-MPNP 重叠的溶酶体的百分比。要打开 aDxt-MPNP 和溶酶体的彩色聚类图像，请选择“分析” “共定位” “Coloc 2”。在新窗口中，选择通道 1 的 aDxt-MPNPs 图像和通道 2 的溶酶体图像，然后选中 Manders 相关框，并按 OK（图 10）。对来自每个实验条件的五对图像重复此步骤。

图 9。使用颜色聚类对 CLSM 图像进行分割。
(A) 选择“插件”>“分割”>“颜色聚类”。 (B) 对于 aDxt-MPNP 图像，纳米粒子的图示颜色为绿色，因此，选择绿色（在通道部分），然后单击“运行”。对染色溶酶体的 CLSM 图像重复此步骤，并相应地选择适当的颜色进行分割。

在 ImageJ 软件中使用 Coloc 2 插件确定R t的过程。
(A) 在前面的步骤中打开两个分割图像，选择“分析”>“共定位”>“Coloc 2”。 (B) 在新窗口中，选择通道 1 和通道 2 的图像。然后，检查 Manders 的相关性框，然后单击确定。

完成图像分析后，可以构建R t与孵育时间的关系图（图 11A）。孵育时间是t load和t chaos之和。随着 aDxt-MPNPs 被转运到溶酶体， R t值增加。然而，由于 CLSM 图像的空间分辨率有限， R t值是饱和的。从该图中，可以确定值tchas 。通常情况下，追在R t达到一个平台期后选择。这背后的原因是，在内溶酶体途径中，晚期内体与溶酶体融合，这也可能导致 aDxt-MPNPs 与溶酶体的高度共定位。然而，建议在获得分离的溶酶体部分后，应使用西方印迹分析评估晚期内体的水平（图 11B）。如果晚期内体仍然存在，则需要进一步延长t追踪。

图 11。 aDxt-MPNPs 与溶酶体的延时共定位以及细胞裂解物、PS 和 NS 部分的蛋白质印迹。
(A) R t与孵化时间的关系图。 ADxt-MPNPs 在溶酶体中的积累表现为R t随着时间的增加。 (B) 分离溶酶体部分的蛋白质印迹。 PS：正选择（磁性分数）； NS：负选择（非磁性部分）； GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（胞质蛋白作为对照）； LAMP2：溶酶体相关膜蛋白 2（溶酶体标记），Rab7：晚期内体标记蛋白。经Le等人的许可改编。（ 2022 年）。版权所有 2022 美国化学学会。

食谱

1.MES 缓冲液（0.1 M，pH ~6）
将 3.90 g MES 溶解在 180 mL 的去离子水中。使用 pH 计监测溶液的 pH 值，然后使用微量移液器吸取 10 N 氢氧化钠水溶液，将溶液的 pH 值调节到大约 6。然后，加水至 200 mL。使用前通过 0.2- µ m 过滤器过滤对溶液进行消毒。存放在深色瓶子中。
2.PBS缓冲液
将 9.6 克 PBS 溶解在 1 L 的去离子水中。该溶液在使用前应通过高压灭菌器进行灭菌。将溶液储存在 4°C。
3.洋地黄皂苷溶液
在 500 μL 二甲基亚砜 (DMSO) 中溶解 25 mg 地黄皂苷。将溶液分成微管，15 μL/管。将溶液储存在 -20°C 。用 PBS 稀释，用于透化。
4.氯化铵溶液
在 60 mL 的 PBS 缓冲液中溶解 0.160 g NH 4 Cl。将溶液储存在 4°C 。
5.DAPI染色液
从市售产品中制备浓度为 100 µg/mL 的 DAPI 原液，储存在 4°C 的冰箱中。对于细胞核染色，将原液进一步稀释 2000 倍。
6.蛋白酶抑制剂溶液 (PIS)
a.在 50 mL 管中准备 20 mL 的 PBS。
b.中加入 20 μL的 0.1 M苯甲基磺酰氟和 100 μL的蛋白酶抑制剂混合物。苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物的稀释倍数分别约为 1000倍和 200倍。
c.使用涡流均匀地分散溶液。然后，将溶液保存在冰盒中。
注意：此溶液应在使用时准备好。不建议长期存放。抑制剂混合物的组成为： 0.1 mg/mL 亮肽素半硫酸盐一水合物； 0.14 毫克/毫升胃酶抑素A； 14 mg/mL N-对甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮； 15 mg/mL Nα-对甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯盐酸盐； 0.4 毫克/毫升抑肽酶;溶解在 DMSO 中的 32 mg/mL 苯甲脒。抑制剂混合物可以提前制备并储存在 -20°C 的小管中。

致谢

该协议源自原始研究论文 Le等人。 “完整溶酶体的快速温和分离使用磁-等离子体混合纳米粒子” ACS Nano 2022 年 1 月 3 日； 16（1）：885-896。 doi：10.1021/acsnano.1c08474（Le等人，2022）。这项工作的部分资金来自日本社会的青年科学家资助科学促进会（授权号 21K14506）给 MT

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

本研究未使用人类或脊椎动物受试者。

参考

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