材料和试剂
体外材料和试剂
1. Corning ® CELLBIND ® 6孔板（Corning Inc.，目录号：734-1210）
2. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS wo/Ca 2+和 Mg 2+ ）（Gibco ® ，Invitrogen，Gibco Life Technologies，目录号：14190169）
3. DMEM，低葡萄糖， GlutaMAX （Gibco ® ，目录号：21885025）
4. 胰岛素， Actrapid penfil 100 IU（Novo Nordisk A/S，目录号：014398）
5. Fungizone ® （250 µg/mL 两性霉素 B）（Gibco ® ，Invitrogen，Gibco Life Technologies，目录号：15290026）
6. 青霉素/链霉素（1,0000 U/mL，10 mg/mL）（Gibco ® ，Invitrogen，Gibco Life Technologies，目录号：15140122）
7. 胎牛血清（FBS）（ Gibco®，Invitrogen，Gibco Life Technologies，目录号：10500064 ）
8. HBSS wo/Ca 2+和 Mg 2+ （ Hyclone TM ，GE Healthcare，目录号：SH30588.01）
9. 锥虫蓝0.4％溶液（Sigma- Aldrich TM ，目录号：T10282）
10. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma- Aldrich TM ，目录号：A8412）
11. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma- AldrichTM ，目录号：D2650）
12. 活组织检查，股外侧肌，来自四名男性供体（年龄 24 - 29）
13. 增殖培养基（见配方）
14. 分化培养基（见配方）

体内材料和试剂
1. 雌性 Lewis 大鼠，20 周大（150 – 200 g）（LEW/ OrlRj ，Janvier Labs，法国）
2. 异氟醚（ESDG9623C，Baxter International Inc.，美国）
3. 乙醇（ Kemetyl AS，目录号：600068）
4. 肝素 5000 IE/mL（LEO Pharma AS，目录号：009165-07）
5. Micropore TM手术胶带（3M Health Care，目录号：1535-1）
6. RNA-Solv ®试剂（Omega Bio-Tek，目录号：R6830）

设备

体外设备
1. Countess TM自动细胞计数器，计数室载玻片（Gibco ® ， Invitrogen TM ，Gibco Life Technologies，目录号： C10227/C10228）
2. 水浴（ Hetofrig ，目录号：CB11）
3. CO 2水套式培养箱（ Nuaire ，型号：NU-4500）
4. 显微镜和cellSens入门软件（Olympus，型号：CKX41）
5. 细胞刮刀24 cm（ Sarstedt Inc.，目录号：83.3951）
6. 热块：铝块串有铜灌注管， HI - CONTACT TM 6 - PASS COLD PLATE （部件号 416101u00000g， Aavid 热合金SRL，意大利）
7. 不锈钢绝缘柔性热电偶温度探头（K 型228-7445； RS Components AS，挪威）
8. PicoLog软件连接到便携式 PC 的 USB TC-08 数据记录器（Pico Technology，目录号：PP222）
9. Swip Shaker（Edmund Bühler GmbH，型号：SM25-B）

体内设备
1. Miniplus ® 3 蠕动泵（Gilson Inc.，目录号：GFAM00051）
2. 恒温毯控制单元（ Harvard Apparatus Ltd.，目录号：50-7137）
3. 仅大鼠毯子，15 × 20 cm（Harvard Apparatus Ltd.，目录号：50-7214）
4. 哈佛仪器蒸发器（Baxter International Inc.，目录号：34-0387）
5. 冷却板EchoTherm （Torrey Pines，目录号：IC25XR）
6. 手术工具：
弹簧剪刀（Fine Science Tools，目录号：15000-08）
精细剪刀（Fine Science Tools，目录号：14058.09）
镊子（精细科学工具，目录号：11252-00）
镊子（精细科学工具，目录号：11006-12）
7. Haldenwanger TM瓷喷砂浆（Fisher Scientific，目录号：12373328）

分析设备
1. 2100生物分析仪（Agilent Technologies，型号：G2938C）
2. StepOnePlus TM实时荧光定量 PCR 系统（Applied Biosystems，型号：4376592）
3. Mastercycler ® nexus（Eppendorf ® AG，型号：6333）
4. NanoDrop TM 8000 分光光度计（Thermo Scientific TM ，型号：ND-8000-GL）

软件

1. PicoLog软件（ PicoLog 6.2.4，Pico Technology，英国）

程序

A. 人骨骼肌细胞的培养
1. 收获m 的活组织检查。来自健康志愿者的股外侧肌、卫星细胞分离和传代已在前面进行了描述（Lund等，2017）。
2. 在-196 °C （1 × 10 6 – 2 × 10 6细胞/瓶）下将活检分离的卫星细胞储存在冷冻瓶中。
3. 在 6 孔 Corning ® CELLBIND ®板中播种成肌细胞（第 3 和 4 段）。每孔使用 2.0 mL 的增殖培养基和每 mL 50,000 个细胞的细胞浓度，在 37 °C和 5% CO 2下孵育。
4. 在 80 – 90% 汇合（一周后），用 2.0 mL 分化培养基更换培养基，以促进肌管形成。孵育 6-7天。

B. 孵化器设置
1. 在同一培养箱中设置具有冷却 (18 °C ) 和常规 (37 °C ) 条件的平行培养箱系统。概述如图 1 所示。

图1 。在 CO 2培养箱中设置肌管的体外暴露，同时将细胞平行暴露于温暖或寒冷的温度。
热块（用虚线突出显示，蓝色表示冷暴露或红色表示 37°C 的控制条件）温度通过连接的水循环器控制（控制 =红色管；冷 = 蓝色管）。使用热电偶探头和PicoLog软件监测培养条件（实际暴露温度）。未显示聚苯乙烯泡沫塑料绝缘材料，但应安装在管道和热水瓶块周围。在BioRender (bioRender.com)中创建的图。

a. 带有连接管开口的普通 CO 2培养箱。设置在 37 °C和 5% CO 2 。
b. 设置保持各自温度的水循环器。冷循环器的温度必须大大低于所需的暴露温度，因为返回的水通过培养箱升温。 B.2 节“方法验证”中描述了如何建立正确温度的概要。
c. 在培养箱中安装两个温度调节块。为了确保对热块进行充分的温度调节，在培养箱的架子上安装了一个用铜灌注管串成的铝块（图 2）。通过将凹槽铣入铝热块（图 2A），允许培养井表面和热块之间的紧密连接。

图2 。热块。
铝制热块（浅蓝色）的背面和正面，用蛇形铜管串成（棕色），并在其中磨出凹槽（深蓝色），使热块和培养板孔之间形成紧密接触. B) 热块中的铜管及其尺寸 (mm)。

d. 通过用来自水循环器（培养箱外）的冷水或热水灌注来冷却或加热热块。通过硅管将水循环器与热块连接。
e. 使用聚苯乙烯泡沫塑料对热块、培养板和试管进行绝缘。
2. 方法验证
a. 在三个 6 孔培养板中的每个孔中加入 2.0 mL 的培养基。将 6 孔板放在热块上。
b. 穿孔板盖并将热电偶温度探头浸入每个孔的孔介质中。
c. 监测培养井中的温度。
将热电偶温度探头连接到 USB TC-08 数据记录器，并使用PicoLog软件在便携式 PC 上监控温度数据。验证循环器中所需条件所需的温度。
d. 分钟测量一次培养井温度，持续 60 分钟，以确定调节循环器温度后温度稳定所需的时间。
e. 每 30 分钟测量一次培养井和热块温度（在我们的实验室中达到温度稳定的时间）。将水循环器设置为 8 °C ，温度增量为 5 °C ，产生六次测量曲线。
f. 根据获得的方程调整水循环器的温度, 以获得细胞暴露前细胞培养基中所需的温度。
3. 体外冷暴露
a. 在 18 °C井温或 37 °C （对照）下孵育 A.7 节中建立的细胞 18 小时。
b. 让细胞在 37 °C 下恢复3 小时。
c. 通过仔细抽吸培养基收获细胞，然后（出于基因表达分析的目的）向每个孔中加入 500 µL Isol -RNA 裂解试剂。如果需要 RNA 以外的其他产品，请使用合适的裂解试剂。
d. 用细胞刮刀分离细胞并摇动板 5 分钟以确保完全裂解。将悬浮液转移到适当的管中并储存在-80 °C 。
4. 根据裂解制造商的程序建议继续进行 RNA 分离，或进行其他首选的下游分析。

C. 体内冷暴露
1. 麻醉
a. 把老鼠放在麻醉箱里麻醉。盖上盖子，用哈佛仪器蒸发器与 2开始镇静。 0 L (O 2 )/min 和 5% 异氟醚流量。监测以确保完全镇静， 2-3分钟。
b. 将大鼠放在桌子上，仰卧位。将麻醉重定向到吸入面罩，并将流量调整为 0.5 L/min 和 3% 异氟醚。
c. 定期（每 15 分钟）检查是否存在戒断反射，以确保在整个实验过程中完全镇静。通过用镊子夹住爪子来检查反射。
d. 将带有反馈的直肠探头插入加热垫（恒温毯控制单元），将核心温度保持在 36-37 °C 。
2. 肌肉冷暴露
a. 剃掉老鼠的后腿
b. 将后肢放在37°C 的加热垫上。用手术胶带固定肢体，将左后肢放在保持 10°C 的冷却板上，如图 3 所示。将肢体放在冷却板上 1 小时。热暴露后，将肌肉放在加热垫上再加热 2 小时，以重新加热肌肉。

图3 。体内冷暴露的设置。
异氟醚麻醉（面罩）大鼠仰卧位放置在加热垫（红色）上，左后肢用手术胶带固定在冷却板上（蓝色）；右后肢作为对侧控制。直肠探头和蒸发器未显示。在BioRender (bioRender.com)中创建的图。

3. 进行经心灌注。
a. 用 70% 乙醇喷洒胸部和腹部。
b. 用手术剪刀和镊子，在腹部中心穿过皮肤和腹壁做一个 5-7 厘米的横向切口。
c. 通过横膈膜做一个水平切口以充分识别心脏。
d. 将 0.1 毫升（50 毫克）肝素注入左心室。
e. 用剪刀在两侧横向切割肋骨，从下肋骨开始，向上朝向锁骨。在剑突上使用动脉夹，将前肋骨表面向上倾斜，远离心脏。
f. 在心包上做一个小切口，露出心肌
g. 在心尖做一个小切口，大约2-3 毫米，进入左心室。将灌注针通过左心室5-10 毫米插入主动脉。用夹子固定针的位置。
h. 在右心房切开以确保引流并开始灌注。使用不含 Ca 2+和 Mg 2+的汉克平衡盐溶液 (HBSS) 。使用 Gilson Miniplus ® 3 泵以 20 mL/min 进行灌注。当肝脏颜色从红色变为浅棕色时终止预灌注。
4. 收获米。 N 2 (ℓ)中的腓肠肌和速冻。储存在-80 °C以供进一步分析。
5. 在 N 2 (l)中用研钵和杵将组织均质化。
6. 例如，继续进行 RNA 或蛋白质分离。

数据分析

通过评估达到稳定温度的时间、培养孔和热块之间的顺应性以及培养孔、热块和水循环器温度之间的关系来验证培养箱各部分的体外温度。在我们的特定设置中，30 分钟后观察到稳定的温度。此后，在水循环器的六种不同温度下检查了热块和培养井之间的关系（图 4）。

图4 。在六种不同的水循环器温度下 30 分钟后热块和培养井中的温度。
显示了三个 6 孔板 (N = 18) 中 18 个培养孔的平均值 + SEM 值。

在我们的具体设置中，水循环器和培养井中的温度之间的关系（图 5）给出了以下等式： y = 0.75 x + 9.01
该方程用于确定水循环器的温度，以获得 18°C 的培养井温度。

图5 。培养井和水循环器温度之间的线性关系（R 2 = 0.99）。
显示了三个 6 孔板 (N = 18) 中 18 个培养孔的平均值 + SEM 值。

我们之前的结果（Krapf等人，2021 年）表明，这些新方法可用于研究骨骼肌的冷暴露。为此，我们已经证明肌动蛋白的产生受体内和体外肌肉温度的调节。下游分析包括 mRNA 水平的基因表达以及蛋白质分泌到培养基中。此外，我们研究了直接冷暴露和复温对培养的人肌管中葡萄糖和脂肪酸代谢的影响（手稿审查中）。这是通过使用同位素示踪剂标记和测量 CO 2产生来实现的。当前的协议可用于收集对直接冷暴露和温度变化对组织和细胞的生物学影响的新见解。

食谱

1. 增殖培养基
试剂数量
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)，含Glutamax （含 1.0 g 葡萄糖） 500 毫升
胎牛血清 50 毫升
青霉素/链霉素，10,000 单位/mL 2.5 毫升
Fungizone (250 µg/mL 两性霉素 B) 2.5 毫升
全部的 555 毫升

2. 分化培养基
试剂数量
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)，含Glutamax （含 1.0 g 葡萄糖） 500 毫升
胎牛血清 10 毫升
青霉素/链霉素，10,000 单位/mL 2.5 毫升
Fungizone (250 µg/mL 两性霉素 B) 2.5 毫升
胰岛素 (25 pmol /L) 21.5 µL
全部的 536.5 毫升

致谢

该协议源自我们之前发表的论文(Krapf et al ., 2021) 。

利益争夺

作者没有财务和非财务竞争利益。

伦理

动物研究按照法规执行并获得挪威食品安全局 (FOTS, ID9483) 的批准。在所有参与者的知情同意下获得人体肌肉活检，所有研究均按照所有相关指南和法规进行，并获得挪威国家研究伦理委员会的批准（参考编号 2011/2007 REK sør-øst B） .

参考文献

1. Bouzigon , R., Grappe , F., Ravier , G. 和Dugue , B. (2016)。全身和局部冷冻刺激/冷冻疗法：当前技术和实际应用。热生物学杂志 61：67-81 。
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3. Farbu , EH, Skandfer , M.,Nielsen , C., Brenn , T., Stubhaug , A. 和 Hoper, AC (2019)在寒冷的环境中工作，在工作中感到寒冷和慢性疼痛：横断面分析特罗姆瑟研究。 BMJ 公开赛9：e031248。
4. ISO15743:2008。（2008 年）。热环境的人体工程学——寒冷的工作场所——风险评估和管理。 https://www.iso.org/standard/38895.html 。
5. Jaworska , J., Micielska , K., Kozlowska , M., Wnorowski , K., Skrobecki , J., Radziminski , L., Babinska , A., Rodziewicz , E., Lombardi, G. 和Ziemann , E. ( 2018）。由全身冷冻刺激方案支持的为期 2 周的特定排球训练诱导了生长因子的增加并抵消了身体表现的恶化。前生理学9：1711。
6. Krapf, S., Schjolberg , T., Asoawe, L., Honkanen, SK, Kase, ET, Thoresen, GH 和 Haugen, F. (2021)。体内和体外骨骼肌冷暴露的新方法显示出温度依赖性肌因子的产生。热生物学杂志 98：102930 。
7. Lund，J.，Rustan，AC，Lovsletten，NG，Mudry，JM，Langleite，TM，Feng，YZ，Stensrud，C.，Brubak，MG，Drevon，CA，Birkeland，KI等。（2017）。体内运动标记人体肌管体外: 训练诱导的脂质代谢增加。公共科学图书馆一号12（4）：e0175441。
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9. Saltin , B., Gagge , AP 和Stolwijk , JA (1968)。人体次最大运动期间的肌肉温度。应用生理学杂志25（6）：679-688 。
10. SSB LKU-A。（2019）。工作环境，生活条件调查。挪威统计局 (SSB)。
11. Vale, TA, Symmonds , M., Polydefkis , M., Byrnes, K., Rice, ASC, Themistocleous , AC 和 Bennett, DLH (2017)。由于感觉神经病变，慢性非冷冻性冷伤会导致神经性疼痛。大脑140（10）：2557-2569。