材料和试剂

1. 一次性小贴士
a. 10 μL容量（ Thermo Fisher Scientific ，QSP，目录号：104-Q ，Rockford，US）
b. 200 μL容量（ Thermo Fisher Scientific，QSP，目录号：TF140-200-Q，Rockford，US）
c. 1 mL 容量（Thermo Fisher Scientific，QSP，目录号：112NXL-Q，Rockford，US）
2. 1.5 mL 微量离心管（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：AM12400，美国卡尔斯巴德）
3. 100 mm培养皿（Corning，Falcon，目录号： 353003 ，美国格伦代尔）
4. Amicon Ultra-15 离心过滤器单元，10 kDa MWCO（Sigma，Millipore，目录号： UFC901024 ，Darmstadt，Germany）
5. 碳酸氢盐涂层缓冲液（Medicago，目录号： 09-8922-100 ，Uppsala，Sweden）
6. 牛血清白蛋白（Sigma，目录号：90604-29-8，美国圣路易斯）
7. Tween-20（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP337500，Carlsbad，US）
8. pcDNA3 表达载体（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen™，目录号： V79020 ，美国卡尔斯巴德）
9. HEK293 电池（ATCC，目录号： CRL-1573 ，美国马纳萨斯）
10. Lipofectamine 2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：11668027，Carlsbad，US）
11. Geneticin / G418（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：11811023，Carlsbad，US）
12. Dulbecco's Modified Eagle's Medium（Life Sciences，Corning，目录号：10-017-CV， Glendale，US ）
13. 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：10099141，美国卡尔斯巴德）
14. 商业CD89蛋白，人，重组（Sino Biological，目录号：10414-H08H，Beijing，China）
15. 人 IgA1 标准品，骨髓瘤（Sigma，目录号：400109，Saint Louis，US）
16. PBS粉末（Sigma，目录号：P3813，Saint Louis，US）
17. 3 × FLAG肽（Sigma，目录号：F4799，Saint Louis，US）
18. ANTI-FLAG M2 亲和凝胶（Sigma，目录号：A2220，Saint Louis，US）
19. Slide-A- Lyzer透析盒（ Thermo Scientific，目录号：66380，Carlsbad，US）
20. Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent（ Bio-Rad，目录号：#5000006 ， Hercules，US）
21. 一抗和二抗
a. HRP缀合的抗DDDDK标签抗体[M2]（Abcam，目录号： ab49763 ，美国沃尔瑟姆）
b. HRP缀合的抗人IgA抗体[1H9]（Abcam，目录号：ab7383，Waltham，US）
c. 重组抗CD89抗体（Abcam，目录号：ab124717，Waltham，US）
22. ECL Western Blotting Substrate（ Thermo Scientific，目录号： 32209 ，Carlsbad，US）
23. Nunc MaxiSorp 96 孔板（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 44-2404-21 ，Glendale，US）
24. Immuno Clear 标准模块（Thermo Scientific，目录号：468667 ，Carlsbad，美国）
25. 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物组（BD，目录号：555214，Franklin Lakes，US）
26. 硫酸（Thermo Scientific，目录号：N600，Carlsbad，US）
27. 青霉素和链霉素（ Thermo Scientific，目录号：15140122， Carlsbad，US）
28. 细胞培养基（见配方）
生长培养基
选择培养基
冻存培养基
29. 0.05 M 碳酸钠缓冲液（pH 9.6）（见配方）
30. 0.01 M 磷酸盐缓冲盐水(PBS) 缓冲液（参见配方）
31. ELISA 洗涤缓冲液（0.1% PBST 缓冲液，pH 7.4）（参见食谱）
32. ELISA 封闭缓冲液（1% BSA/PBST 缓冲液）（参见配方）
33. ELISA终止溶液（1 M H 2 SO 4 ）（见配方）

设备

1. -80°C 冰箱（例如Thermo Scientific Forma 900 系列）
2. 固定体积单通道移液器（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：4651140）
3. 冷冻台式离心机（例如， Thermo Sorvall Legend XTR 冷冻离心机）
4. 微孔板吸光度读数器（例如，Bio -Rad，目录号： 1681130XTU ）
5. CO 2培养箱（例如， Thermo Fisher Scientific，目录号：51032875）
6. 液氮罐（例如，Thermo Scientific）
7. 凝胶成像系统（例如， Biorad Gel Doc XRS+ 成像系统，目录号：1708265）

程序

A. 产生用于表达重组 CD89 的稳定细胞系
如果使用义翘神州的商业 CD89，请跳过 A 和 B 部分，直接进入 C 部分。
1. 为了生成重组可溶性 CD89 蛋白 (rCD89)，合成编码人 FcαRI/CD89 胞外域的 DNA（Met 1 -Asn 227基于RefSeq登录：NP_001991.1）融合到DYKDHD-G-DYKDHD- 的 C 端 3×Flag- I-DYKDDDDK 序列。
2. 将 cDNA 片段克隆到 pcDNA3 载体中，以便使用哺乳动物细胞进行表达。
3. 按照标准转染方案，在 6 孔板中使用Lipofectamine 2000将 pcDNA3-rCD89-Flag 质粒转染到在生长培养基中培养的 HEK293 细胞中。将质粒（2.5 μg ，在 100 μL Opti-MEM 培养基中稀释）和 Lipofectamine 2000（7.5 μL ，在 100 μL Opti-MEM 培养基中稀释）混合并在室温下孵育 15 分钟，然后加入孔中并通过轻轻吹打与培养基混合。
4. 一天后，通过胰蛋白酶消化分离转染的细胞，并将细胞转移到 100 mm 细胞培养皿中，连续稀释 5 倍（使用 5 个 100 mm 培养皿，稀释范围从 1:5 到 1:3125）。将细胞保持在 15 mL 的选择培养基中。
5. 每 3 天更换一次选择培养基，持续 14 天，直到形成不同的细胞克隆，每个克隆平均有100-500个细胞。
6. μL移液器（通过轻轻刮擦然后捕捉分离的细胞克隆）在显微镜下分离形成良好的单个稳定细胞菌落，并将其播种在 96 孔板中。
7. 中保持5-7 天，无需更换培养基。通过使用 HRP偶联的斑点印迹法测试每个孔中的培养基中rCD89-Flag的重组表达抗 DDDDK 标签抗体。
a. 准备一条硝酸纤维素膜，用铅笔在上面画出网格（1 厘米× 1 厘米）。
b. 将 5 μL 的介质样品点到网格中心的硝酸纤维素膜上。通过缓慢应用将样品穿透的区域最小化（通常直径小于 4 毫米）。等到膜变干。
c. 用 TBST 中的 5% 干牛奶封闭膜，并在室温下孵育 1 小时。
d. 倒掉封闭缓冲液，并在剩余的程序中保持膜始终湿润。
e. 将膜与HRP 偶联的抗 DDDDK 标签抗体（在TBST中用 2% 脱脂牛奶以 1:1,000的比例稀释）在室温下孵育 1 小时。
f. 洗膜三遍 TBST。
g. 用 ECL 试剂孵育膜，并用化学发光成像系统成像。 ECL 试剂可检测皮克级别的蛋白质。
8. 选择 2 – 3 个具有最高重组蛋白表达的稳定细胞克隆，并将这些单个克隆用于 100 mm 培养皿中的培养。
9. 使用细胞冷冻容器（例如，Nalgene 5100-0036）用冷冻保存培养基（2 × 10 7 个细胞/mL）冷冻稳定的细胞克隆，然后将细胞库储存在液氮罐中。
B. 重组CD89-Flag的表达和纯化
1. 在 100 mm 培养皿中培养高产的稳定细胞克隆，DMEM 辅以 10% FBS 和 500 μg / mL G418。
2. 当细胞生长到约 90% 融合时，将培养基更换为无血清 DMEM 并再培养 5 天，以允许在培养基中产生 rCD89-Flag 蛋白。
3. 收获培养基 (~ 100 m L), 然后用Amicon Ultra-15 过滤器浓缩培养基, 分子量截止为 10,000 Da。在室温下以 4,000 × g旋转过滤器，直到样品浓缩至小于 5 mL。
4. 组装一个 5 mL 重力柱，其中装有 2 mL 的反标志 M2 抗体结合亲和凝胶。加载浓缩介质入列。
5. 用 PBS 清洗重力柱 3 次（每次 30 mL）。然后用 5 mL 的 3 × Flag 肽在 PBS 中以 150 μ g /mL洗脱重组蛋白。
6. 收集含有 rCD89 蛋白的洗脱缓冲液，用 PBS 缓冲液在 4°C 下透析纯化的蛋白过夜使用截留分子量为 10,000 Da 的Slide-A- Lyzer透析盒。
7. 按照制造商的说明，使用 Bio-Rad 蛋白质测定试剂测量总蛋白质浓度。
8. 将重组蛋白储存在 -80°C。

C. 通过执行 rCD89 定向 ELISA 检测血浆中的多聚 IgA 复合物
1. 板准备
a. 在碳酸钠缓冲液 (pH = 9.6) 中稀释rCD89 蛋白至最终浓度为 10 μg / mL 。立即用每孔 100 μL的 rCD89 蛋白涂覆 96 孔 ELISA 微孔板或条带。密封板并在 4°C 下孵育反应过夜。
b. 吸出每个孔，然后用 300 μL洗涤缓冲液清洗孔。再重复该过程两次，总共进行三轮洗涤。最后一次洗涤后，通过抽吸去除任何剩余的洗涤缓冲液，然后将盘子倒置以拍打在一堆干净的纸巾上。
c. 添加 300 μL的阻塞缓冲液来阻塞板。在 37°C 下孵育封闭反应 1 小时。
d. 重复步骤 C1b 中所述的吸液和洗涤循环。板现在可以测量样品了。但是，避免让空井长时间风干。

2. 制备血浆样品和 IgA 标准品
a. 在封闭缓冲液中按 1:1,000 稀释血浆样品（血浆可以来自新鲜采集的样品，也可以来自从 -80°C 储存中取出的冷冻原液。根据我们的测试结果，2 – 3 轮冻融循环，储存温度为 - 80°C 不会显着改变使用该测定法对 poly-IgA 含量的读数。如果冻融有任何沉淀过程中，血浆样品应在3000 x下离心以去除沉淀物克在4 °C 15 分钟）。
b. 在封闭缓冲液中稀释纯化的人 IgA1 标准品，浓度范围为 500 μg /mL 至 7.8125 μg / mL。

3. 检测程序
a. 加入 100 μL稀释的血浆样品或 IgA1 标准品的封闭缓冲液。用胶带盖住板并在 37°C 下孵育反应 3 小时。
b. 执行上述步骤 C1b 中所述的抽吸/洗涤循环。
c. 在封闭缓冲液中稀释检测抗体（HRP 偶联的抗人 IgA 抗体）1:1,000。每孔加入 100 μL检测抗体溶液。用新的胶条盖住板并在 37°C 下孵育反应 1 小时。
d. 如步骤 C1b 中所述，将水井清洗 3 次。
e. 加入 100 μL的 TMB 底物溶液。在室温下孵育反应 25 分钟。避免将板置于直射光下。
f. 加入 100 μL的停止溶液。
g. 在 450/570 nm 的双波长下使用酶标仪测量每个孔的光密度。

数据分析

1. 为了测试板间变异性，除了人类 IgA1 标准系列外，每个板上还包括一个样品标准作为质量控制。只有当不同测试板之间的质量控制变异系数小于10%时，测试光密度值才被认为是稳定可靠的。
2. 通过四参数逻辑方程估计每个样品在血浆中测量的聚 IgA 复合物的浓度：
[y = (A - D) / [1 + (x/C) ^ B] + D
其中 y = 光密度值，x = 浓度，A = 最小渐近线，B = 斜率因子，C = 对应于 A 和 D 中间响应的浓度，D = 最大渐近线]（图 2）（Zhang等人， 2021) ]。

rCD89 -directed ELISA 测量的用于确定血浆 poly-IgA 复合物浓度的标准曲线。
y轴值是 TMB 反应在 450 nm 处的光密度读数。 x轴值标记为人 IgA1 标准的相应浓度 ( μg / mL)。数据系列（红点）是通过测量 7.8125 和 500 μg / mL 之间的人类 IgA1 标准获得的。拟合曲线来源于四参数逻辑回归模型，随后用于计算患者样本中多聚 IgA 复合物的单位浓度。

3. 在该协议中，聚 IgA 复合物的浓度单位被索引为 U/mL，它同样从测量 IgA 的μg /mL 值转换而来。此处使用 U/mL 而不是μg /mL的原因是为了澄清测量的含量是 poly-IgA，而不是总 IgA。

食谱

1. 生长培养基
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)
10% 胎牛血清 (FBS)
100 U/mL 青霉素和链霉素

2. 选择培养基
mL的生长培养基。

3. 冻存培养基
生长培养基添加 DMSO 至终浓度为 10%。

4. 0.05 M 碳酸钠缓冲液 (pH 9.6)
a. 将一片药片放入放置在磁力搅拌器上的烧杯中。
b. 加入 50 mL 去离子水，搅拌溶液几分钟。
c. 将水调至 100 mL，搅拌至完全溶解，即可使用缓冲液。

5. 0.01 M 磷酸盐缓冲盐水(PBS) 缓冲液
a. 将 1 L 袋 PBS 粉末溶解在 500 mL 的去离子水中。
b. 将水调至 1,000 mL，搅拌至完全溶解，即可使用缓冲液。

6. ELISA 洗涤缓冲液（0.1% PBST 缓冲液，pH 7.4）
试剂最终浓度数量
0.01 M PBS 缓冲液 0.01M 999 毫升
吐温-20 不适用 1毫升
全部的不适用 1,000 毫升

7. ELISA 封闭缓冲液（1% BSA/PBST 缓冲液）
试剂最终浓度数量
牛血清白蛋白 1% 1克
0.1%PBST 缓冲液 0.1% 100 毫升
全部的不适用 100 毫升
* 通过轻轻摇动加盖的容器将 BSA 溶解在 PBST 缓冲液中。

8. ELISA终止溶液（1 M H 2 SO 4 ）
试剂最终浓度数量
98% 浓硫酸 1M 27.8 毫升
ddH 2 O 0.1% 472.2 毫升
全部的不适用 500 毫升

致谢

本研究得到国家自然科学基金 81670649 和 81925006、首都健康发展研究项目 2018-2-4073、北京市科技计划项目 D181100000118003、中国医学科学院医学科学创新基金资助2019-I2M-5-046（致 J. Lv ）。该协议改编自张等人发表的程序。（2021 年）。

利益争夺

J. Jin报告拥有Accubit Inc. 的所有权权益；作为一个深圳市陆景生物科技有限公司顾问，该公司正在开发该技术在诊断中的临床应用；有咨询与Alebund Pharmaceuticals、 Mannin的协议 Research Inc. 和Qbio Med, Inc.；并担任科学顾问为，或成员，科学报告。 J. Jin , J. Lv , and H. Zhang 申请与所述方法相关的专利的报告在此协议中用于测量临床中多聚 IgA 复合物的水平样品。 H. Zhang 自述担任北京医学会肾病专业委员会委员中华医学会肾病专业委员会委员协会会员、中国学会理事国际肾脏病学会会员 (ISN)——推进临床试验委员会和 ISN 成员姐妹肾脏中心全球外展委员会并提供咨询服务与Calliditas 、Janssen、Novartis 和欧梅罗斯。十、李是深圳绿景生物科技股份有限公司的员工。所有剩下的作者都没有什么可透露的。

伦理

该研究是按照符合赫尔辛基宣言的原则，由当地伦理委员会批准。

参考

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