材料和试剂

1. 移液器吸头 SR LTS 20 µL F 960A/5（ Rainin ，目录号：17005860），储存温度：室温
2. 移液器吸头 SR LTS 200 µL F 960A/5（ Rainin ，目录号：17005859），储存温度：室温
3. 移液器吸头 SR LTS 1,200 µL F 768A/4（ Rainin ，目录号：17007084），储存温度：室温
4. 一次性血清移液管，聚苯乙烯，无菌，堵塞，5 mL （例如， VWR ，目录号： 89130-896 ），储存温度：室温
5. 一次性血清移液管，聚苯乙烯，无菌，堵塞，10 mL （例如， VWR ，目录号： 89130-898 ），储存温度：室温
6. 一次性血清移液管，聚苯乙烯，无菌，堵塞，25 mL （例如， VWR ，目录号： 89130-900 ），储存温度：室温
7. 一次性血清移液管，聚苯乙烯，无菌，堵塞，50 mL （例如， VWR ，目录号： 89130-902 ），储存温度：室温
8. 试剂容器，无菌（例如， Corning，Costar，目录号：4870），储存温度：室温
9. 无菌过滤器储存瓶/接收器（例如， Thermo Fisher， Nalgene，目录号：455-0500），储存温度：室温
10. 深孔板，96 孔，PP，1.1 mL，标准，U 形底（Cole-Parmer， BrandTech ，目录号：EW-07904-04），储存温度：室温
11. Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes（Kimberly-Clark，目录号：34155），储存温度：室温
12. 密封桨（ USA Scientific，目录号： 2928-7355），储存温度：室温
13. MicroAmp光学胶膜（Thermo Fisher，Applied Biosystems，目录号： 4311971），储存温度：室温
14. 彩色标签胶带，Rainbow Pack （ Fisher Scientific， Fisherbrand ，目录号： 15-901-10R），储存温度：室温
15. PCR板，96孔（例如， VWR，目录号： 82006-704），储存温度：室温
16. Bravo Lab 一次性移液器吸头（Agilent，目录号：19477-022），储存温度：室温
注意：如果使用 Agilent Bravo 执行磁珠清洗，这些是必需的。
17. Nunc 96 孔聚丙烯DeepWell储存板，无菌（Thermo Fisher，Thermo Scientific，目录号：260251），储存温度：室温
18. Nalgene 一次性聚丙烯机器人储存器，无菌（Thermo Fisher，Thermo Scientific，目录号： 1200-1301），储存温度：室温
注意：如果使用 Agilent Bravo 执行磁珠清洗，这些是必需的。
19. 康宁 96孔透明V型底2 mL聚丙烯深孔板，无菌（Corning，目录号：3960），储存温度：室温
(注意：如果使用 Agilent Bravo 执行磁珠清洗，这些是必需的。
20. MicroAmp快速光学 96 孔反应板，0.1 mL （Thermo Fisher，Applied Biosystems，目录号： 4346906 ），储存温度：室温
(注意：如果使用 Applied Biosystems Fast 7500 系统执行 qPCR，这些是必需的。
21. Qubit Assay Tubes （ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： Q32856），储存温度：室温
22. （可选）IgG（总）人ELISA试剂盒（例如， Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： BMS2091），储存温度： 4 °C
23. Tris 缓冲盐水与 Tween 20（TBST-10X）（Cell Signaling，目录号：9997），储存温度：室温
24. 牛血清白蛋白（BSA）（ VWR ，目录号：0332-500G），储存温度：4 °C
25. PBS，pH 7.4（例如， Thermo Fisher，目录号：10010023 ），储存温度：室温
26. VirScan T7 噬菌体展示文库（可根据要求提供，储存温度：-80 °C）
注意：基于 T7Select 包装套件（Millipore-Sigma，目录号：70014）存储温度： -80 °C。
27. UltraPure 1M Tris-HCI，pH 8.0 （ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： 15568025 ），储存温度：4 °C
28. NaCl（5 M），无RNase （ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： AM9759），储存温度：室温
29. 硫酸镁溶液（Millipore Sigma，目录号： M3409-100ML），储存温度：室温
30. 氯霉素（Millipore Sigma，目录号： C0378-100G ），储存温度：粉末室温或-20 ℃重构溶液
31. 霉素B硫酸盐（Millipore Sigma，目录号： B5264-250MG ），储存温度：粉末和重构溶液的-20 °C
32. NP-40 Surfact -Amps 洗涤剂溶液（ Thermo Fisher，目录号： 85124），储存温度：室温
33. Dynabeads蛋白A（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： 10008D），储存温度：4 °C
34. Dynabeads Protein G（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： 10009D），储存温度：4 °C
35. UltraPure 1 M Tris-HCI 缓冲液，pH 7.5 （ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：15567027），储存温度：4 °C
36. UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water （ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： 10977023），储存温度：室温
37. Q5热启动高保真DNA聚合酶（ New England Biolabs，目录号： M0493L）储存温度：-20 °C
38. dNTP Set（100 mM）（ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： 10297018），储存温度：-20 °C
39. TaqMan Gene Expression Master Mix（Thermo Fisher，Applied Biosystems ，目录号：4369016 ），储存温度： 4 °C
40. UltraPure Agarose （Thermo Fisher， Invitrogen，目录号： 16500100），储存温度：室温
41. UltraPure DNA Typing Grade 50 × TAE Buffer （Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： 24710030），储存温度：室温
42. QIAquick Gel Extraction Kit（250）（QIAGEN，目录号：28706 ），储存温度：室温
43. QIAquick PCR Purification Kit（250）（QIAGEN，目录号：28106 ），储存温度：室温
44. Qubit dsDNA HS Assay Kit （ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： Q32851），储存温度：混合，室温和4 °C
45. HPLC纯化的引物（IDT ，储存温度：-20 °C ）

引物名称引物序列 (5' – 3')
IS7 ACACTCTTTCCCTACACGACTCCAGTCAGGTGTGATGCTC
IS8 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCCGAGCTTATCGTCGTCATCC
IS4 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACTCC AGT
索引引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNGTGACTGGAGTTTCAGACGTGT
5'NEST-qPCR TCGGGGATCCAGGAATTC
3'NEST-qPCR CGTCGTCATCCTTGTAATCG
NEST_probe /56-FAM/TAATCGCGG/ZEN/CCGCAAGCTTGTC/3IABkFQ/
T7-Illumina-READ1-A TGCTCGGGGATCCAGGAATTCCGCTGCGT
注意：索引引物的正交 7 nt条形码可根据要求提供。

46. 噬菌体提取缓冲液（配方如下），储存温度：4 °C
47. PhIP -Seq 洗涤缓冲液（配方如下），储存温度：4 °C

设备

1. Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+（ Rainin ，目录号：17013808）
2. Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+（ Rainin ，目录号：17013810）
3. E4 Pipette Multi E12-1200XLS+（ Rainin ，目录号：17014499）
4. 便携式 Pipet-Aid XP 移液器控制器（Drummond，目录号：4-000-101）
5. 旋转器（例如，Barnstead/ Thermolyne ，型号：415110 ）
6. 带有摆桶转子组件和微孔板载体的台式离心机（例如Beckman Coulter，型号： Allegra X-15R 或 Avanti J-15R，摆桶转子组件：SX4750A 或 JS-4. 750，微孔板载体： SX4750 ）
7. Bravo NGS 自动化液体处理平台（Agilent，目录号： G5573AA）
8. 96孔微量滴定板磁分离架（NEB，目录号： S1511S ）
注意：如果手动执行磁珠清洗，这是必要的。
9. 热循环仪（例如， Bio-Rad，型号：C1000 Touch with 96-well Fast Reaction Module，目录号：1851196）
10. 用于 0.2 mL 管的 96 孔铝块（ Universal Medical，目录号：81001 ）
11. 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument，带笔记本电脑（Thermo Fisher，Applied Biosystems，目录号：4406984）
12. Qubit 4荧光计（ Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：Q33238 ）

软件

1. 领结（Langmead等人，2009 年）
2. samtools (Li et al. , 2009)
3. python（ Python 软件基金会。Python 语言参考，2.7 版。可在http://www.python.org获得）
4. gcc （GNU 编译器集合，版本 6.2.0。文档位于https://gcc.gnu.org/onlinedocs/gcc.pdf ）
5. R （R 核心团队，2017 年）

程序

视频 1. 简介

A. 挡板（视频2）

视频 2. 挡板

1. 为每个 96 孔深孔板 ( Cole-Parmer )准备 100 m L 的 TBST 3% BSA。转移到试剂容器。
2. 在 96 孔深孔板的每个孔中加入 1 mL 的 TBST 3% BSA。
3. 用 kimwipes 吸干板顶部以去除多余的液体。
4. MicroAmp光学胶膜密封板。
注意：可以通过从板的中心向外按压以消除大气泡来密封板，然后使用密封桨消除所有剩余的气穴。
5. 反转板数次以确保液体在整个板中移动。
6. °C 下将 96 孔深孔板粘贴到板旋转器上，并在一夜之间端到端旋转。

B. 噬菌体抗体复合物的形成（视频 3 ）

视频 3. 噬菌体抗体复合物的形成

1. 在冰上解冻VirScan T7 噬菌体文库。文库的特征如表 1 所示。
2. 为每个 96 孔深孔板准备 110 mL 的稀释 T7 噬菌体库。有关如何准备稀释的噬菌体库的信息，请参见表 2。
3. 混合得很好。

表1 。 VirScan T7 噬菌体文库特征
复杂性（Vir3 版本） 115,753 名成员
所需的最终浓度 2 × 10 5 pfu/mL 每个文库成员，或大约 2 × 10 10 pfu/mL

表 2. 制备稀释的噬菌体文库
零件库存集中度最终浓度 110次
VirScan噬菌体文库 9.9 × 10 10 pfu/mL（可能因批次而异） 2 × 10 10 pfu/mL 22.2 毫升
氯霉素 50 毫克/毫升 (1,000 × ) 50微克/毫升（1 × ） 110微升
卡那霉素 50 毫克/毫升 (1,000 × ) 50微克/毫升（1 × ） 110微升
噬菌体提取缓冲液至 110 毫升

4. 在 96 孔 PCR 板中的 PBS 中将血清等分试样稀释至 0.2 μg / μL 。
笔记：
a. 中IgG的浓度一般为5-10微克/微升。在 98 μL PBS（1:50 稀释）中稀释 2 μL血清，以达到约 0.2 μg / μL人 IgG的浓度。搅拌均匀。
b. 如果需要，可以通过 IgG ELISA 测量样品中 IgG 的浓度。
c. 血清样本通常一式两份运行。
d. 每次运行通常包括八个无血清对照。
5. 将 96 孔深孔板中的封闭溶液倒入水槽中。轻弹板数次以去除所有阻塞溶液。
6. 用kimwipe 涂抹板表面以去除液体。
7. 在每口井中加入 1 mL 的稀释噬菌体库。
8. 用kimwipe 涂抹板表面以去除多余的液体。
9. μg IgG 的血清加入每孔中，或从先前制备的 0.2 μg / μL板中加入10 μL 。
10. 用kimwipe 涂抹板表面以去除多余的液体。
11. 使用桨，用新的MicroAmp光学胶膜密封板非常好。确保孔之间没有气泡。
12. 反转板数次以确保液体在整个板中移动。在 4°C 下将板固定在旋转器上，并通过端到端混合旋转 20 小时或过夜。
13. 用稀释的血清样品密封板并储存在-80 °C。

C. 免疫沉淀（视频 4）

视频 4. 免疫沉淀

1. 将 96 孔深孔板以 500 × g离心3 分钟，以收集远离密封的液体。
2. 卸下密封件时，紧紧按住板。避免孔之间的飞溅和交叉污染。
3. 重悬 Protein A 和 Protein G Dynabeads ，直到底部没有剩余的珠子沉淀。
4. 对于每个 96 孔深孔板，将 2 mL 蛋白 A 和 2 mL 蛋白 G Dynabeads添加到试剂库中，并与血清移液器混合。
5. 添加 40 μL 蛋白 A/G 到 96 孔深孔板的每个孔中。
6. 用kimwipe 涂抹板表面以去除多余的液体。
7. 密封板用新的MicroAmp光学粘合剂密封，并用胶带将板固定在旋转器上。在室温下旋转 4 小时或在 4°C 下过夜。
8. 一次取下一个盘子进行清洗。将 96 孔深孔板以 500 × g离心3 分钟，以收集远离密封的液体。
9. 使用液体处理机器人执行三次洗涤，如视频 4 所示，每次用 170 μL的PhIP -Seq 洗涤缓冲液洗涤。在洗涤过程中的某一时刻，将珠子转移到新的 96 孔深孔板（Thermo Fisher）中，以避免可能与原始板的孔非特异性结合的噬菌体。 Bravo 协议文件可在补充材料中找到。
a. 或者，手动执行清洗。
i. 将板放在磁分离架上。
ii. 让板静置 2 分钟以收集珠子。您应该能够看到解决方案变得清晰。
iii. 从每个孔中吸出液体。在每口井后切换提示以避免交叉污染。
iv. 抽吸时，请确保将板与磁棒齐平，以避免吸出珠子。
注意：根据磁棒相对于孔的位置调整方向。
v. 从每排孔中吸出液体后，在空孔中加入 400 μL PhIP - Seq 洗涤缓冲液，以防止珠子变干。
vi. 从磁分离架上取下盘子，使用多通道移液器通过上下移液 10 次重新悬浮所有孔中的珠子。
vii. 重复步骤i -iv 总共洗涤三次。在第一次洗涤期间，将珠子转移到新的 96 孔深孔板中。
viii. 用新的MicroAmp光学胶封盖住盘子，并以 500 × g的速度将珠子离心1 分钟。吸出任何剩余的液体。
10. 将每口井中的珠子重新悬浮在 40 μL的无菌水中并转移到 PCR 板中。密封板。
11. 用重悬珠子在离心机中旋转 PCR 板约 10 秒，直到离心机达到 50 × g ，从孔的侧面收集珠子。
12. 将板加热至 95 °C 10 分钟以裂解 T7 噬菌体。
13. 板在 -80 °C 下储存长达一周或直接进行库准备以进行下一代测序。

D. 为下一代测序准备文库（视频 5）
注意：设置 PCR 时，始终将 PCR 板放在冰上的铝块上。始终将所有试剂放在冰上。

视频 5。用于下一代测序的文库制备

1. 在冰上解冻冷冻珠子，然后以 1,000 × g离心2 分钟。
2. 制作 PCR1 预混液，充分混合，然后转移到冰上的储液罐中。

零件库存集中度最终浓度 1次反应( μL ) 110次反应( μL )
无菌水 2.68 294.8
反应缓冲液 5 × 1 × 6.0 660
dNTPs 10毫米 0.3 毫米 0.90 99
底漆 IS7 100 微米_ 0.2微米_ 0.06 6.6
底漆 IS8 100微米_ 0.2微米_ 0.06 6.6
Q5 2 U/ μL 0.02 U/ μL 0.30 33
模板 2 × 1 × 20
全部的 30微升

3. 将 10 μL的 PCR1 主混合物等分到新的 96 孔 PCR 板的每个孔中。始终将盘子放在冰上的铝块上。
4. 通过移液重悬珠子，并将 20 μL的珠子添加到相应的井中。通过移液充分混合。
注意：如果对输入库进行排序，请混合 5 μL的输入库和 15 μL的无菌水，并将其用作 PCR1 的模板，而不是 20 μL的重悬珠。
5. 在离心机中旋转 PCR1 板约 10 秒，直到离心机达到 50 × g ，然后立即取出板并放回冰上的铝块。
6. 运行 PCR1。
步温度时间
初始变性 98°C 30 秒
总共 28 个周期 98°C 5 秒
66°C 10 秒
72°C 30 秒
最终扩展 72°C 2 分钟
抓住 4–10°C

7. 制作 PCR2 预混液，充分混合，然后转移到试剂槽中。
笔记：
a. 使用带条形码的 PCR2 RV 引物（索引引物）实现样品多路复用。
b. 将索引引物稀释至 2.5 μM并保存在 96 孔板中。

零件库存集中度最终浓度 1次反应( μL ) 110次反应( μL )
无菌水 4.55 500.5
反应缓冲液 5 × 1 × 2.0 220
dNTPs 10毫米 0.3 毫米 0.3 33
底漆 IS4 100微米_ 0.5微米_ 0.05 5.5
索引引物 2.5微米_ 0.5微米_ 2.0
Q5 2 U/ μL 0.02 U/ μL 0.1 11
模板 2 × 1 × 1.0
全部的 10微升

8. 7 μL的PCR2 主混合物分配到新的 96 孔 PCR 板的每个孔中。
9. 添加 2 μL 将适当的索引引物（稀释至 2.5 μ M ）加入相应的孔中。
10. 将 1 μL适当的 PCR1 产品添加到相应的井中作为模板。
11. 通过在 PCR 板底部快速运行桨几次来混合 PCR 反应，从而搅动孔。在离心机中旋转 PCR 板约 10 秒，直到离心机达到 50 × g ，然后立即将板放回冰上的铝块中。
12. 运行 PCR2。

步温度时间
初始变性 98°C 30 秒
八个周期 98°C 5 秒
68°C 10 秒
72°C 30 秒
最终扩展 72°C 2 分钟
抓住 4–10°C

注意：步骤 13 – 19 是质量控制步骤，用于验证所有合适的孔中是否存在扩增子。
13. 在无菌水中稀释 PCR2 产物 1:40,000。
a. 连续稀释 2 μL PCR2 产物在 398 μL无菌水（1:200 稀释）中两次。
14. 制作 qPCR 主混合物，混合均匀，然后转移到水库。

零件库存集中度最终浓度 1次反应( μL ) 110次反应( μL )
无菌水 8.75 962.5
通用混合 2 × 1 × 10 1100
3' NEST qPCR 引物 100微米_ 0.5微米_ 0.1 11
5' NEST qPCR 引物 100微米_ 0.5微米_ 0.1 11
NEST qPCR 探针 100微米_ 0.25微米_ 0.05 5.5
PCR2 模板，1:40,000 稀释 1.0
全部的 20微升

15. 19 μL的qPCR主混合物分配到 96 孔 qPCR 板的每个孔中。
16. 将 1 μL适当的 PCR2 产物稀释 1:40,000 添加到相应的孔中作为模板。
17. 通过在 PCR 板底部快速运行桨几次来混合 qPCR 反应，从而搅动孔。在离心机中旋转约 10 秒，直到离心机达到 50 × g 。
18. 运行 qPCR。
步温度时间
1 个周期 50°C 2 分钟
95°C 10 分钟
40 次循环 95°C 15 秒
60°C 2 分钟

19. 如果孔无法通过 qPCR 扩增，则用完相应的 PCR1 和 PCR2 产物来诊断问题。如有必要，重做 PCR1 和/或 PCR2。
20. 2 μL汇集在水库中，混合并转移到 1.5 mL 微离心管中。
笔记：
a. 分别从单个板中汇集样品。
b. 如果对输入库进行测序，则将任何给定样本的 10倍体积添加到最终池中，即，如果将每个样本合并 2 μL ，则将 20 μL的输入库添加到池中。
21. 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上从每个板上运行 40 μL的汇集 PCR2 产品。
22. QIAgen Gel Extraction Kit凝胶提取正确大小的条带。
笔记：
a. T7 VirScan文库的预期扩增子大小为 376 bp。
b. 正确大小的带子正下方可能有一条微弱的带子。不要提取这个微弱的较低波段，因为它包含截断或缺失 Primer IS4 或 Index Primer 序列的产品。
23. QIAquick PCR Purification 试剂盒对凝胶提取的样品进行PCR 纯化。
注意：在凝胶提取后进行 PCR 纯化，以确保在下一代测序之前获得更高的样品纯度。
24. 使用 dsDNA HS Qubit 测定法定量 DNA，然后将每个板的等量 (ng) 合并。

E. 新一代测序
1. 提交池库进行排序。需要以下测序参数：
NextSeq 500 仪器和NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5（ 75 个循环）的核心设施中对 192 个样本的混合文库进行测序，产生约 4 亿次读取。我们订购单读、单索引测序，详述如下。
a. 读取 1：75 个循环
注意：只需要 50 个循环，但我们通常订购 75 个循环并在数据分析步骤期间截断读数。
b. 指数 I7：7 个周期
c. 测序深度：1M 读数/样本。
d. 读取 1 的定制测序引物：T7-Illumina-READ1-A

数据分析

笔记：
a. 在下面的说明中，代码行以粗体显示。这些说明适用于使用 SLURM 的计算集群。
b. 提供了两个血清样本及其技术复制的示例VirScan数据（补充材料）。数据文件包括样本图例、 fastq文件、BAM 文件、对齐报告文件、索引 BAM 文件、计数文件、 count.combined文件（ Nextseq 500 流动槽的四个通道的计数总和）、计数表（ count.combined数据以表格形式呈现；无血清对照的总计数在“输入”列中提供），Z 分数表（同样，无血清对照的总计数出现在“输入”列中）， hits_combined表和病毒分数文件。

A. 将测序读数与参考文件对齐
1. VirScan库的参考fasta文件（“vir3.fasta”）（补充材料）并生成带有 . ebwt扩展。运行以下命令：
模块加载gcc /6.2.0

模块加载蝴蝶结/1.2.2

领结构建 vir3.fasta vir3
2. 将测序读数与参考文件对齐。请参阅“script.align.sh”并根据需要进行编辑（补充材料）。输出文件是以“.bam ”结尾的文件
笔记：
a. 测序读取通常以fastq文件的形式分发。这些fastq文件存储在名为“ raw.data ”的子目录中。
b. 在“script.align.sh”中，“bowtie -3 25”从每个测序读数的 3' 端修剪 25 个核苷酸。如果测序读数长度为 75 个核苷酸，则执行此操作。参考文件仅包括文库每个成员的前 50 个核苷酸，因此必须将测序读数缩减至 50 个核苷酸才能与参考正确对齐。
c. 在“script.align.sh”中，将“path_to_vir3_reference_fasta_and_index_files”替换为适当的路径。
./ script.align.sh
3. “.out”结尾的对齐报告文件
注意：通常，>85% 的读取与参考文件对齐。
4. 使用以下命令索引文件。输出文件是以“.bai ”结尾的文件
模块加载gcc /6.2.0

模块加载samtools /1.3.1

对于我在raw.data /*.bam;做samtools索引 $ i ;完毕
5. 使用以下命令计算索引。输出是一个以“.count.csv ”结尾的文件
模块加载gcc /6.2.0

模块加载samtools /1.3.1

对于我在raw.data /*.bam;做samtools idxstats $ i |切-f 1,3 | sed -e '/^\*\t/d' -e '1 i id\ tSAMPLE_ID ' | tr "\\t" "," >${ i %.bam }.count.csv ;完毕
6. 压缩包使用以下命令计数文件。
对于我在raw.data /*.csv;做gzip $ i ;完毕
7. 使用以下命令创建一个名为“ log_directory ”的目录。
mkdir 日志目录
8. 如果同一样品在流动槽的两个或多个通道上运行，并且为每个流动槽提供单独的文件，请使用以下命令组合来自不同通道的计数文件。这些命令需要将 python 脚本“ combine_two_lanes.py”复制到运行命令的文件夹（补充材料）。
注意：在下面的代码中，样本在 Illumina Nextseq 500 流动槽的四个通道上运行。每个计数文件的后缀是“L001_R1_001.count.csv.gz”，如果计数文件来自流动槽的第一道，“L002_R1_001.count.csv.gz”如果计数来自流动的第二道细胞等
模块加载gcc /6.2.0

模块加载python

对于我在raw.data /*L001_R1_001.count.csv.gz;做python combine_two_lanes.py $ i $ { i%1_R1_001.count.csv.gz } 2_R1_001.count.csv.gz $ {i%1_R1_001.count.csv.gz } 1_2_R1_001.count.csv ；完毕

对于我在raw.data /*L003_R1_001.count.csv.gz;做python combine_two_lanes.py $ i $ { i%3_R1_001.count.csv.gz } 4_R1_001.count.csv.gz $ {i%3_R1_001.count.csv.gz } 3_4_R1_001.count.csv;完毕

对于我在raw.data /*L001_2_R1_001.count.csv;做python combine_two_lanes.py $ i $ { i%1_2_R1_001.count.csv } 3_4_R1_001.count.csv $ {i%1_2_R1_001.count.csv } 1_2_3_4_R1_001.count.combined.csv ;完毕

9. 压缩包 count.combined文件使用以下命令。
对于我在raw.data /*1_2_3_4_R1.count.combined.csv;做gzip $ i ;完毕

B. 计算 Z 分数
注意：为了执行 Z 分数分析，将 count.combined文件合并到一个表中，并将与无血清对照对应的列汇总在一个称为“输入”的列中。
1. 编辑 R 脚本“ Zscore_analysis.R ”以包含count.combined表文件的路径和输出文件的所需路径，然后运行脚本（补充材料）。需要包“mmR_0.1.0”和“virScanR_0.1.0.9000”（补充材料）。
注意：文件“Zscores_vir3”包含此步骤后的结果（补充材料）。
2. 在样品的两个技术重复中，Z 分数至少为 3.5 才能将肽称为“命中”。
注意：文件“hits_combined_vir3_3.5_cutoff”包含此步骤之后的结果（补充材料）。

C. 计算病毒分数
1. 创建一个名为“hits”的目录。在这个目录中应该是每个样本的 .csv 文件，每个肽段 ID 的值为“True”或“False”，具体取决于肽段在样本的两个技术复制中是否得分为命中（Z 得分 > 3.5） .这些文件可以通过将“ hits_combined_vir3_3.5_cutoff”文件的每一列拆分为单独的文件（补充材料）来创建。
2. 使用以下代码生成病毒分数文件：
注意： “VIR3_clean”文件提供了寡核苷酸的注释”（补充材料）。这里是 Vir 3 库中的 115,753 个寡核苷酸。一些蛋白质片段在不同病毒中是相同的，在这种情况下，“VIR3_clean”文件中有多行对应于一个寡核苷酸。要识别给定肽的病毒来源，请在 VIR3_clean 文件中查找具有给定肽“id”值的行。

对于我在 hits/*.csv.gz 中；做 python calc_scores_nofilter.py $ i VIR3_clean.csv.gz 物种 7 >virus_scores_$ i ;完毕

D. 确定病毒血清阳性
1. 如果virus_score > VirScan_viral_threshold并且如果来自该病毒的至少一个公共表位得分为命中，则确定样品对病毒血清阳性。 “ VirScan_viral_thresholds ”文件包含每个病毒的阈值（补充材料）。
注意：可根据要求提供公共表位注释。

食谱

1. 噬菌体提取缓冲液
20 mM Tris-HCl，pH 8.0
100 毫米氯化钠
6 毫米硫酸镁4
储存于 4°C

2. PhIP -Seq 洗涤缓冲液
50 mM Tris-HCl，pH 7.5
150 毫米氯化钠
0.1% NP-40
储存于 4°C

致谢

有趣的：ELS 得到了 NSF 研究生研究奖学金计划的支持。 SJE 是霍华德休斯医学研究所的研究员。
源自该协议的原始研究论文： Larman 等。（2011），徐等人。（2015）和米娜等人。（2019）。
我们感谢 A. Kohlgruber在图形摘要中设计示意图。

利益争夺

SJE 是 TSCAN Therapeutics、MAZE Therapeutics、 Mirimus和ImmuneID的创始人。 SJE 是 Homology Medicines、TSCAN Therapeutics、MAZE Therapeutics、 XChem的科学顾问委员会成员，并且是 MPM 的顾问，这些都不会影响这项工作。 ELS曾担任ImmuneID的顾问。 SJE 是布莱根妇女医院 (US20160320406A) 提交的专利申请的发明人，该专利申请涵盖了使用VirScan库来识别血液中的病原体抗体。

伦理

在获得捐赠者的书面知情同意后，根据当地管理人类研究的协议收集人体样本。布莱根妇女医院机构审查委员会（协议号 2013P001337）豁免了出于这项工作的目的对所有人体样本的二次使用。

参考

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