材料和试剂

1. 15 mL锥形管（ Sarstedt ，目录号：62.554.502）
2. 玻璃培养皿，直径 12 cm（ Thermo Scientific，目录号：41042030）
3. 手术刀，没有。 21（Heraco AB，目录号：7978）
4. 手术刀，没有。 4，（Heraco AB，目录号：7972）
5. 弯曲的镊子，2毫米尖端，12厘米（ Agnthos ，目录号：11003-12）
6. 石蜡（ Histolab ， Histowax ；目录号：00403）
7. 不锈钢底模1.5×1.5×0.5 cm（VWR International AB，目录号： 89498-710）
8. 载玻片（显微镜载玻片，Fisher Scientific；目录号：10149870）
9. Wheaton Coplin染色罐（Sigma-Aldrich，目录号：S5766-6EA）
10. 盖玻片24×50 mm（ Histolab ， Thermo Scientific；目录号：06660）
11. 10％中性缓冲福尔马林（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128-4L）
12. 磷酸盐缓冲溶液（PBS）（ Thermo Scientific，目录号：18912014）
13. 组织处理/包埋盒（ Histolab ，目录号：41701）
14. 无水乙醇（VWR International AB；目录号：BAKR3406.5000）
15. 异丙醇（Fisher Scientific，目录号：15518744）
16. 二甲苯（Merck，目录号：1330-20-7）
17. 苏木精（Merck，目录号：105175）
18. 冰醋酸（Sigma-Aldrich，目录号：64-19-7）
19. Pertex 封固剂（ Histolab ， Thermo Scientific；目录号：00871.0500）
20. 曙红Y溶液0.5％水溶液（工作溶液）（参见配方1 ）（VWR International AB，目录号：1098441000）
21. 分级乙醇溶液和乙醇-异丙醇混合物（配方 2 ）

设备

1. 组织处理器（ Myr ，Automated Spin Tissue Processor，型号：STP 120）（图1 ）
2. 切片机（ Leitz ，型号：1516 Automated）（图2A ）
3. 滑动加热器（ Wealtec Corp.，型号：HB-1，目录号：1092001）（图2B ）
4. 水浴（JP Selecta，型号：N291451，目录号：12027874）（图2C ）
5. 储存在 -20 °C 下的冷却盘（ 33 × 27 × 5 cm）（ Menuett ，型号：009551）（图2D ）
6. 定制的石蜡分配罐（ROYAL Catering，目录号：317320191080）改装有直径 16 毫米和外部长度 55 毫米的不锈钢龙头（The Kitchen Lab，瑞典；AM-SIGNSTEK304）（图2E ）
7. 自然对流烤箱（BINDER，目录号：ED56 8012-1018）
8. VS120-S6-096 虚拟显微镜载玻片扫描系统（Olympus，Tokyo，Japan）

图1 。旋转组织处理器 (STP 120) 显示编号为 1-12 的单个容器和可编程接口。

图 2. 组织病理学区域，使用翻新、翻新和重新利用的设备开发。
A) 手动切片机（翻新）； B) 块状加热器（翻新）； C）水浴（活化）； D) 冷却盘（重新利用）； E) 石蜡罐分配器（用不锈钢龙头改装的热水器）。

软件

1. 奥利维亚3.8 （奥林巴斯）
2. Graphpad Prism 9（加利福尼亚州拉霍亚）
3. 可选：Microsoft® PowerPoint®和Microsoft Excel® for Microsoft 365 MSO（版本 2201 Build 16.0.14827.20158）64 位
4. Adobe Acrobat Pro DC 版本：21.011.20039.0

程序

A. 组织收集
1. (Stenlo et al., 2020, 2021)，所有活检应从麻醉和机械通气猪的同一解剖位置随机取样 ADDIN EN.CITE 。样本应由同一外科医生在所有动物和时间点采集，以尽量减少采样过程中的差异。在施用任何有害剂或假治疗对照（例如盐水）之前，获得基线样品。通过小开胸手术从右下叶进行小楔形切除，用于基线样本。来自右肺和左肺（上肺和下肺）的端点样本通过胸骨切开术作为小楔形切除。活检的楔形切除在每个肺叶内的相同解剖位置内随机取样，以减少偏差。对于评分，将来自相似肺叶的活检相互比较，因为在这些模型中，不同肺叶对严重肺损伤的敏感性不同。有关猪模型中组织取样的详细信息，请参见注 1 。
2. 3的活组织检查置于无菌的 15 mL 锥形管中，其中装有 10% 中性缓冲福尔马林溶液，至少两倍于组织体积进行固定。在 4°C 下过夜（至少 12 小时至 48 小时）。
3. 固定后，用新鲜无菌的 PBS 溶液代替福尔马林。组织可以在 PBS 中储存在 4°C，直到处理。有关在这些条件下长期储存的详细信息，请参见注释 2 。
4. 为切片组织活检准备工作区（图 3A ）。
5. 组织应在镊子的帮助下稳定，并用消毒手术刀在玻璃培养皿中切成多个小块（图 3B ）。准备最长尺寸约为 5 毫米且厚度不小于 3 毫米（或卡带中插槽的厚度）的片段。使用镊子将它们放入组织处理/嵌入盒中（图 3C ）。

图 3. 组织处理前的活检组织切片。
A) 组织切片的准备工作； B) 用手术刀对组织进行切片； C) 将组织切片转移到预先标记的盒中。

6. 据_ _下一节中描述的协议。 B-D 部分中概述的步骤应编程到组织处理器中。有关组织处理器编程的详细信息，请参见注释 3 和 4 。
7. 废福尔马林溶液和所有随后描述的溶液应根据当地化学和生物危险废物法规丢弃（更多详细信息请参见注释 5 ）。

B. 脱水（分级乙醇系列和异丙醇）
1. 分级乙醇溶液应提前在去离子水或异丙醇中制备，如下所述（步骤 B3 ）并放入组织处理器容器中。有关详细信息，请参见配方 2 。
2. 装有包埋盒的篮子应缓慢浸入浓度最低的乙醇容器（容器 1）中，以每分钟 60 转的速度搅拌，每 60 秒改变一次旋转方向。与基于浸泡的方案相比，由于扩散增加，旋转搅拌有助于使脱水和乙醇混合物对组织进行更均匀和完整的浸润（Ostrander，1996 年；Suvarna 等人，2018 年）。
3. 为每种溶液和孵育时间设置自动组织处理器：
容器 1：乙醇 30% – 1.5 小时
容器 2：乙醇 50% – 1.5 小时
容器 3：乙醇 70% – 1.5 小时
容器 4：乙醇 80% – 1.5 小时
容器 5：乙醇 80% – 1.5 小时
容器 6：乙醇-异丙醇 80–20% – 1.5 小时
容器 7：乙醇-异丙醇 80–20% – 1.5 小时

C. 清算（透化）
1. 由于二甲苯与健康危害和不利的环境状况有关，异丙醇可用于代替二甲苯作为脱水剂和清洁剂。以下步骤在 B 节之后立即发生。
容器 8：异丙醇 100% – 1.5 小时
容器 9：异丙醇 100% – 1.5 小时
容器 10：异丙醇 100% – 1.5 小时

D. 石蜡浸润
1. 为确保石蜡完全渗透到整个组织厚度中，在 65 °C 控制温度下分两个不同的步骤，将盒中脱水和清除的组织片段自动移动到组织处理器中的最终容器中，其中包含熔融石蜡。
容器 11：石蜡 – 6 小时
容器 12：石蜡 – 12 小时

E. 石蜡包埋
1. 将5-10 块石蜡浸润组织放入金属基模中，肺实质朝下（或根据需要的方向）；用熔融石蜡填充组织盒和模具的底部，覆盖组织（图 4A - C ）。
2. 快速将组织学盒的底部放在熔融石蜡的顶部。让整个组件在冷却盘上冷却至少 10 分钟，直到石蜡完全凝固（图 4D）。
3. 固化完成后，可以轻松取出石蜡块和盒式外壳进行后续切片。

图 4. 组织的石蜡包埋。
A) 将熔化的石蜡倒入预热好的模具中； B) 转移试样并在适当的方向定向，考虑到块应平行于模具底部进行切割； C) 将卡匣底部放在装满石蜡的模具顶部，确保石蜡充满卡匣中的格栅； D) 在预冷的冷却盘上冷却和固化石蜡浸润组织和液体石蜡的过程的代表性图像； E) 冷却后凝固的石蜡浸润组织的代表性图像。

F. 石蜡包埋组织的切片
1. 将蜡块放在切片机样品架上，表面平行于刀片。
2. 将切片机设置为切割 5 μm 厚的部分（图 5A-B ）。有关截面厚度的更多详细信息，请参见注释 6 。
3. 使用镊子拿起切片组织，并转移到 40°C 的预热水浴中。让组织平浮在水面上（图 5C ），直到在石蜡中看不到可见的折痕（图 5D ）。（有关水浴的更多详细信息，请参见注释 7-9 ）。
4. 根据后续染色和成像的需要，小心地将浮动部分放在组织学载玻片上。
5. 应允许包含组织切片的载玻片在载玻片上干燥过夜。对于长期储存，将它们盖在室温下直到染色（更多详细信息请参见注释 10 ）。

图 5. 石蜡块的切片。
A) 用于切片石蜡块的切片机； B) 组织切片； C) 将带皱纹的切片组织转移到水浴中； D) 在安装在显微镜载玻片上之前，在水浴中放松石蜡带。

G. 苏木精和伊红 (H&E) 染色
1. 载玻片应在 65°C 的烤箱中放置在水平载玻片架中过夜，以使多余的石蜡在脱蜡和染色之前融化（图 6A ）。
2. 对于以下所有步骤，将载玻片放入装有以下溶液的Coplin罐中，并按指定的孵育时间。下面的每个步骤都根据其放置的新溶液列出（即，如果为两个后续步骤列出相同的溶液，则应将载玻片放入装有新鲜溶液的新容器中）。如果在步骤之间充分冲洗和干燥，则Coplin罐子可以在整个协议中重复使用。
3. 脱蜡
a. Coplin Jar 1：二甲苯 – 3 分钟（参见注释 11和 12关于潜在的二甲苯替代）
b. Coplin Jar 2：二甲苯 – 3 分钟
4. 补液
a. Coplin Jar 3：乙醇 100% – 3 分钟
b. Coplin Jar 4：乙醇 100% – 3 分钟
c. Coplin Jar 5：乙醇 90% – 3 分钟
d. Coplin Jar 6：乙醇 70% – 3 分钟
e. Coplin Jar 7：用去离子水冲洗 - 1 分钟
5. 染色
a. Coplin Jar 8：苏木精溶液染色 – 7 分钟
b. Coplin Jar 9：在去离子水中冲洗一次
c. 在流动的自来水中清洗，确保水流不会直接流到载玻片上（参见图 6C ）– 15 分钟
d. Coplin Jar 10：在蒸馏水中孵育/洗涤 - 2 分钟
e. Coplin Jar 11：将切片浸入 Eosin Y (0.5%) – 10 分钟
f. 在流动的自来水中清洗，确保水流不会直接流到载玻片上（参见图 6C ）– 5 分钟
6. 脱水和安装
a. Coplin Jar 12：乙醇 80% – 3 分钟
b. Coplin Jar 13：乙醇 100% – 3 分钟
c. Coplin Jar 14：乙醇 100% – 3 分钟
d. Coplin Jar 15：二甲苯 - 3 分钟（关于潜在的二甲苯替代，请参见注释 11 和 12 ）
e. Coplin Jar 16：二甲苯 - 3 分钟
f. 在载玻片上加入 2-3 滴封固剂，小心地将盖玻片加在上面，确保没有气泡
7. 让这些部分在通风柜/吸油台中过夜干燥（图 6D）。

废物清除程序的详细信息，请参见注释 5 。

图 6. 脱蜡和 H&E 染色。
A) 将示例载玻片水平放入烘箱中过夜以去除石蜡； B )将载玻片放入Coplin罐中； C )在流动的自来水中清洗，确保水流足够温和，可以缓慢地换水，而不会干扰载玻片上的组织切片； D) 染色和安装的幻灯片。

H. 通过自动幻灯片扫描收集图像
使用 20 ×和 40 ×物镜，通过VS120 虚拟显微镜载玻片扫描系统（Olympus， Tokyo，Japan）获得明场图像。每张幻灯片的图像应在OlyVIA Olympus 软件查看器中以三种不同的数字放大倍率（4 × 、10 ×和 20 × ）提取，并将每张幻灯片组装成包含小评分框（表 1 ）的 Microsoft PowerPoint 演示文稿，以供后续使用由盲法评分员进行数字评分，如下所述（参见图 7 ，例如评分表）。使用 Microsoft Excel 中的随机数生成器随机化幻灯片（有关详细信息，请参阅注释 13 ）。在所有条件下都必须使用相同的采集设置和图像亮度调整（有关详细信息，请参见注释 14 ）。

图 7. 提供给组织学评分系统评审员的三个不同评分表的代表性示例。
三个数字放大倍率（4 × 、10 ×和 20 ×以提供放大倍数的代表性视图）的三个不同的显微照片示例。评分表在每一页上使用表 1的修改版本来收集信息。

I. 计分
正如文献（Rosenthal et al., 1998; Martin and Matute-Bello, 2011; Ballard-Croft et al., 2012; Engel et al., 2020）所示，ALI 的猪模型可以具有与小动物模型（Wang 等人，2008 年）。因此，根据我们之前在 ALI 小型和大型动物模型中的经验，我们为猪评分系统选择了七种组织学特征（炎症细胞、透明膜、蛋白质碎片、肺泡壁增厚、出血、肺不张和全身损伤题为“增强损伤”的分数）（参见图 8 ）。这些主要特征的选择最近已被一个国际专家小组独立证实存在于 ARDS 动物模型中并与之相关（Matute-Bello 等人，2011 年；Kulkarni 等人，2022 年）（见注 15有关为大型动物模型选择相关特征的更多详细信息）。在更广泛地使用载玻片扫描技术之前，已经开发了以前用于肺和其他器官的组织学评分系统，用于手动显微镜方法（Gibson-Corley 等人，2013）。因此，以前的评分方法使用了多个高放大率区域的随机化，并利用二元或三点系统对特征进行评分（Guenthart 等人，2019；Frick 等人，2021；Leiphrakpam 等人，2021）。然而，小动物肺损伤模型中的评分系统已经发展为具有更大的评分范围以增加其敏感性（例如，对于肺纤维化）（Ashcroft 等人，1988 年；Hubner 等人，2008 年）。因此，我们为被选为相关的七个特征中的每一个选择了 0（无损坏）-8（大面积损坏）的范围（参见图 8 ）。

图 8. H& E 染色切片的代表性显微照片展示了为开发肺组织损伤评分系统在低和高放大倍率下选择的不同特征。
黑色箭头显示特征示例。

应为评分者提供标准化的培训表格，其中包含未包含在评分集中的示例组织学图像。这些图像应包含描述每个特征的文本，以及展示每个特征的箭头，因为一些严重受伤的动物可能在一张图像中包含多个特征。然后应指示评分员根据扫描幻灯片上这些特征的损伤严重程度给出评分。图 8展示了要评分的特征概览示例。有关评分员人数和专业知识的详细信息，请参见注释16 和 17 。

表1 。猪肺组织H& E染色组织切片急性肺损伤评分特征。提到的每个特征的得分范围是 0（零）到 8（严重）。

数据分析

一旦收到所有分数，幻灯片应该被揭开并在数据处理软件中组织，例如 Microsoft Excel。然后为每个评分者和幻灯片计算总分（参见表 1 ）。每张扫描载玻片的最高分是 56。然后可以将该总分转换为 0-100 的总分范围，如表1所示。然后，基于原始评分数据通常由少量评分者组成，无法正式测试正态性的事实，每张幻灯片的所有分数的中位数用于进一步分析（Gibson-Corley et al., 2013 ) .使用每个特征的总分中位数或在所有评分者中滑动也有助于减少异常值的潜在影响。然后使用 GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA) 对数据进行可视化和分析。图9显示了不同经验水平的研究人员的评分示例。可以使用 Kruskal- Wallis检验或 Mann-Whitney U重复测量的单向或双向 ANOVA 对所有特征或分数之间以及实验组之间的值进行比较，p 值≤0.05 被认为是显着的。非参数检验和集中趋势中位数的表示是最合适的统计分析和表示，因为半定量评分系统是有序的，因此不能假设不同分数之间的差异是线性的。图 10显示了每个特征的无损坏（最小）、轻度损坏（2/3）、中度损坏（4）、明显损坏（5/6）和广泛损坏（最大）的幻灯片示例。

图9 。具有不同经验水平（新手、中度和专家）的不同独立评分者的评分结果和相对可重复性。
图 7中所示的三个示例表的代表性总分，并转换为 0-100 的范围。根据经验，总分和用户区分不同伤害严重程度的能力没有显着差异（参见注释 17 ，根据经验进行分类）。选择这些样本来代表我们系统检测到的一系列分数（低、轻度和广泛的肺损伤水平），由盲法评分者判断。参见图 7 （评分表 34 为低度肺损伤示例，表 22 为轻度损伤，表 24 为高度肺损伤）。水平线代表每张幻灯片的所有评分者的中位数。

图10 。用 H&E 染色的切片显微照片显示了所有特征的一系列分数。
得分“最低：没有受伤”； ‘分数 2/3’：轻度损伤； “4分”：中度损伤； “分数 5/6”：明显受伤；和“最大”：广泛的伤害和给出的最高分。箭头显示特征示例。

笔记

1. 必须在实验开始之前确定合适的组织取样方法的选择，例如样本数量和随机化方法。在大型动物中，这最好根据特定模型的感兴趣结构的大体解剖位置来完成。获得代表性样本的系统性、随机化方法有助于避免系统性偏差并保证组织学处理不同步骤的一致性（Albl 等，2016；Blutke 和 Wanke，2018）。
2. 我们在 4°C 下将组织储存在 PBS 中并随后成功使用该协议进行组织处理的最长时间，H&E 染色为 18 个月。
3. 大多数自动组织处理器不附带针对不同组织类型和协议验证的预设程序。因此，重要的是在不同的自动组织处理器中使用新协议之前验证所有协议（例如，手动或使用小样本集）。
4. 对于我们协议中的某些步骤，相同的解决方案用于两个顺序容器（或类似的染色步骤）。当需要用高纯度溶液孵育组织或切片时，就会发生这种情况。例如，一些残留的异丙醇最初被转移到第一个石蜡容器中。因此，使用相同类型的熔融石蜡的第二个石蜡容器，时间更长，以确保组织完全浸润。
5. 该协议会产生化学和生物危害性废物，应根据当地废物法规进行处理。
6. 可以使用3 – 5 µm的切片厚度。我们发现 5 µm 切片更适合猪肺研究。
7. 水浴槽应经常清洗，并随时盖好盖子，以免污染。就在切片和预热之前，应取下盖子以目视检查水浴，寻找水中的颗粒或混浊迹象。如果有任何颗粒物迹象，则应将浴槽更换为新鲜的去离子水。
8. 切片前，水浴应预热至 40 °C。然后应小心地将切片转移到水浴中（单个切片或连续切片带）。如果需要连续切片，我们建议一次转移一个切片或色带，以便用户在将切片放在载玻片上时可以跟踪（单个石蜡切片或每张幻灯片多个切片）。
9. 让切片漂浮，直到石蜡中不再有可见的褶皱/皱纹，这表明石蜡被加热并且切片可以平放在玻璃显微镜载玻片上。只要水浴不太热且不熔化石蜡切片，切片在切片所需的时间内都是稳定的。在我们的正常协议中，每个石蜡块花费的时间不超过 30 分钟。在移动到下一个块之前，我们将每个块的部分粘附到玻璃侧面，以确保块之间没有样品混合。
10. 含有石蜡组织切片的显微镜载玻片可以在室温下长期保存，在染色前盖上盖子以防灰尘。
11. 虽然上面的图像和我们之前报道的论文（Stenlo 等人，2020 年，2021 年）中使用的图像是按照将二甲苯用于脱蜡步骤的程序获得的，但存在一些更可持续、更环保的替代品。特别是，我们使用了一种市售的含有 d-柠檬烯的化合物（ Histo - Clear，National Diagnostics）进行脱蜡（步骤 G3），孵育时间为3 × 10 分钟，最终清除（步骤 G4d 和 G4e）3 × 10 分钟在安装之前。按照上述无二甲苯组织处理协议，我们已成功将此协议用于猪肺组织（图 11 ）。此外，我们已将该协议用于正常、IPF 和长期 COVID-19 人体肺组织（Lindstedt 等人，2021 年）。

图 11. 使用无二甲苯组织处理、脱蜡和最终清除方案对猪肺组织进行 H&E 染色的示例。

12. 此处描述的无二甲苯组织处理和染色方案也与生物工程水凝胶材料的组织处理和评估兼容，例如含有细胞外基质成分和/或藻酸盐的生物墨水和生物打印结构（ De Santis等人，2021 年）。腐蚀性溶剂，例如二甲苯，会在加工过程中导致工程材料溶解。
13. 为了实施随机化，重复的载玻片被用作干扰物，以及本研究未评分的区域（例如，上叶）（Gibson-Corley 等人，2013 年）。
14. 高分辨率图像和相应的示例分数可在 EMBL BioImage档案登录号 S-BIAD419 中获得，并具有相应的采集设置。但是，图像采集设置必须根据最终用户的设备来确定，因为从不同显微镜和捕获软件获得的图像之间可能存在差异。对于本协议中呈现的图像，我们使用了亮度：50%、对比度：50% 和伽玛：1%。
15. 人们普遍认为，肺需要通过血管灌注固定，或通过气道重力固定，以定量测量肺不张的程度（Hsia et al., 2010; Kulkarni et al., 2022）。然而，我们经常发现，如果样本在切除后立即固定（在接受 LPS 的猪中肺不张程度更大），我们能够区分基线和接受盐水对照或 LPS 给药的动物。因此，虽然这种组织固定方法不足以定量形态学，但它允许对从同一只猪连续采集的基线样本和活检进行比较评估，从而使其成为用于半定量评分的可重复且可靠的参数。
16. 为了最大限度地减少评分异常值的影响，应由三名以上的研究人员进行评分。
17. 我们发现这个评分系统是稳健的，即使那些先验知识有限的人也能够与那些在临床前肺组织学方面接受过广泛培训（即>10 年）的人进行类似的评分。新手：非常有限到没有经验；中度：有一些组织学经验（>1 年）；和专家：在肺组织学急性和慢性临床前模型方面拥有丰富的经验（例如，>10 年）。

食谱

1. 伊红Y溶液0.5%水溶液（工作溶液）
通过每 100 mL 伊红加入 50 μL 冰醋酸来激活工作溶液中的伊红，并在使用前剧烈摇晃。工作溶液应在 1-2 周内使用。
2. 分级乙醇溶液和乙醇-异丙醇混合物
根据每个步骤所需的浓度，在室温下用去离子水或异丙醇稀释无水乙醇。可以提前准备溶液并储存在密闭容器中，以确保酒精浓度不会随时间变化。

致谢

作者感谢肺生物工程与再生 (LBR) 实验室（瑞典隆德隆德大学）的所有成员在整个手稿准备过程中的有益讨论和对最终手稿的批判性阅读。作者还要感谢评分评审人 Oskar Hallgren和Sinem Tas 以及进行试点培训的同事 Emil Rehnberg 、Victoria Ptasinski和 Martina de Santis ，感谢他们帮助改进和开发了这个项目。作者特别感谢StemTherapy成像核心设施，尤其是Emanuela Monni提供有益的讨论、幻灯片扫描培训以及捕获图像的技术援助。这项工作由 Knut 和 Alice Wallenberg 基金会的 Wallenberg 分子医学奖学金资助。

利益争夺

没有来自任何作者的竞争利益报告。

伦理

Stenlo 等人详细描述了用于动物模型的方法。（2020 年和 2021 年）。根据当地和国际法规，所有动物都接受标准护理。本研究获得了动物研究伦理委员会 ( Dnr 8401/2017) 的批准，并遵循美国国家医学研究学会的实验动物护理原则和国家出版的《实验动物护理和使用指南》。学院出版社（1996 年）。

参考

1. Albl , B.、 Haesner , S.、Braun- Reichhart , C.、 Streckel , E.、Renner, S.、 Seeliger , F.、Wolf, E.、 Wanke , R. 和Blutke , A. (2016)。猪生物医学模型的组织取样指南。毒理学病理学44（3）：414-420。
2. ARDS 定义工作组，Ranieri, VM, Rubenfeld, GD, Thompson, BT, Ferguson, ND, Caldwell, E., Fan, E., Camporota, L. 和 Slutsky, AS (2012)。急性呼吸窘迫综合征：柏林定义。 JAMA 307 (23): 2526-2533。
3. Arora, S.、Ahmad, S.、Irshad, R.、Goyal, Y.、 Rafat , S.、Siddiqui, N.、Dev, K.、Husain, M.、Ali, S.、Mohan, A. 和马萨诸塞州赛义德 (2019)。肺部疾病中的 TLR。生命科学233：116671。
4. Ashcroft, T., Simpson, JM 和Timbrell , V. (1988)。在数值尺度上估计肺纤维化严重程度的简单方法。临床病理学杂志41（4）：467-470。
5. Ballard-Croft, C.、Wang, D.、Sumpter, LR、Zhou, X. 和Zwischenberger , JB (2012)。急性呼吸窘迫综合征的大型动物模型。安胸外科杂志93（4）：1331-1339。
6. Blutke , A. 和Wanke , R. (2018)。来自猪生物医学模型的生物库组织样本的采样策略和处理。 J Vis Exp (133)。 doi:10.3791/57276。
7. de Aquino, T., Zenkner , FF, Ellwanger , JH, Pra , D. 和 Rieger, A. (2016)。暴露于有机溶剂的病理学实验室技术人员的 DNA 损伤和细胞毒性。 Acad Bras Cienc 88（1）：227-236 。
8. De Santis, MM, Alsafadi, HN, Tas, S., Bolukbas, DA, Prithiviraj, S., Da Silva, IAN, Mittendorfer, M., Ota, C., Stegmayr, J., Daoud, F., et al . （2021 年）。用于 3D 生物打印人体组织的细胞外基质增强生物墨水。 Adv Mater 33（3）：e2005476。
9. Engel, M., Nowacki , RME, Jonker, EM, Ophelders , D., Nikiforou , M., Kloosterboer , N., Zimmermann, LJI, van Waardenburg, DA 和 Kramer, BW (2020)。绵羊急性呼吸窘迫综合征四种不同模型的比较。呼吸水库21（1）：209。
10. Falkeholm , L.、Grant, CA、Magnusson, A. 和 Moller, E. (2001)。用于组织学制备的无二甲苯方法：多中心评估。实验室投资81(9)：1213-1221。
11. Ferguson, ND, Fan, E., Camporota , L., Antonelli, M., Anzueto , A., Beale, R., Brochard , L., Brower, R., Esteban, A., Gattinoni , L., et人。（2012）。 ARDS 的柏林定义：扩展的基本原理、理由和补充材料。重症监护医学38（10）：1573-1582。
12. Frick, AE, Orlitova , M., Vanstapel , A., Ordies , S., Claes, S., Schols , D., Heigl, T., Kaes , J., Saez -Gimenez, B., Vos, R. ，等人。（2021 年）。一种新的实验猪模型，用于评估差异肺血流对单侧肺移植后缺血再灌注损伤的影响。重症监护医学 Exp 9(1)：4。
13. Gibson-Corley, KN, Olivier, AK 和Meyerholz , DK (2013)。研究中有效组织病理学评分的原则。兽医病理学50（6）：1007-1015。
14. Gonzales, JN, Lucas, R. 和 Verin, AD (2015)。急性呼吸窘迫综合征：机制和透视治疗方法。 Austin J Vasc Med 2（1）：1009。
15. Guenthart BA、O'Neill JD、Kim J、Queen D、 Chicotka S、Fung K、Simpson M、 Donocoff R、 Salna M、 Marboe CC 等。（2019）。使用介入性交叉循环平台再生严重受损的肺。国家通讯10(1): 1985。
16. Hellbach , K., Baehr , A., De Marco, F., Willer, K., Gromann , LB, Herzen, J., Dmochewitz , M., Auweter , S., Fingerle , AA, Noel, PB, et al . （2018 年）。使用 X 射线暗场 X 射线照相术在大型动物模型中描绘气胸。科学代表8（1）：2602。
17. Hsia，CC，Hyde，DM，Ochs，M.，Weibel，ER 和 Structure，AEJTF o。质量保证L. (2010)。美国胸科学会/欧洲呼吸学会的官方研究政策声明：肺结构定量评估标准。 Am J Respir Crit Care Med 181（4）：394-418。
18. Hubner , RH, Gitter , W., El Mokhtari, NE, Mathiak , M., Both, M., Bolte, H., Freitag-Wolf, S. 和 Bewig, B. (2008)。组织学样本中肺纤维化的标准化量化。生物技术44（4）：507-511、514-507。
19. Kandyala , R., Raghavendra, SP 和Rajasekharan , ST (2010)。二甲苯：其健康危害和预防措施概述。口腔颌面外科杂志病理学14（1）：1-5。
20. Kulkarni，HS，Lee，JS， Bastarache ，JA， Kuebler ，WM，Downey，GP， Albaiceta ，GM， Altemeier ，WA，Artigas，A.，Bates，JHT，Calfee，CS 等。（2022 年）。动物实验性急性肺损伤特征和测量的更新：美国胸科学会官方研讨会报告。 Am J Respir Cell Mol Biol 66（2）：e1-e14。
21. 肯塔基州李 (2017)。肺炎、急性呼吸窘迫综合征和早期免疫调节剂治疗。国际分子科学杂志18（2）：388。
22. Leiphrakpam , PD, Weber, HR, McCain, A., Matas , RR, Duarte, EM 和Buesing , KL (2021)。一种新型的烟雾吸入性急性呼吸窘迫综合征大型动物模型。呼吸水库22（1）：198。
23. Lindstedt，S.，Grins，E.，Larsson，H.，Nilsson，J.，Akbarshahi，H.，Silva，I.，Hyllen，S.，Wagner，D.，Sjogren，J.，Hansson，L.，等。（2021 年）。 ECMO 支持 6 个月后肺移植治疗 SARS-CoV-2 诱导的 ARDS 并发严重的抗体介导的排斥反应。 BMJ Open Respir Res 8（1）：e001036。
24. Maca, J., Jor , O., Holub, M., Sklienka , P., Bursa, F., Burda , M., Janout , V. 和Sevcik , P. (2017)。过去和现在的 ARDS 死亡率：系统评价。呼吸护理62(1): 113-122。
25. Martin, TR 和Matute -Bello, G. (2011)。急性肺损伤的实验模型和新兴假设。 Crit Care Clin 27（3）：735-752。
26. Matthay ，MA， Zemans ，RL，Zimmerman，GA，Arabi，YM， Beitler ，JR， Mercat ，A.， Herridge ，M.，Randolph，AG 和 Calfee，CS（2019 年）。急性呼吸窘迫综合征。 Nat Rev Dis Primers 5（1）：18。
27. Matute -Bello, G., Downey, G., Moore, BB, Groshong , SD, Matthay , MA, Slutsky, AS, Kuebler , WM 和动物急性肺损伤研究, G. (2011)。美国胸科学会官方研讨会报告：动物实验性急性肺损伤的特征和测量。 Am J Respir Cell Mol Biol 44（5）：725-738。
28. Matute -Bello, G., Frevert , CW 和 Martin, TR (2008)。急性肺损伤动物模型。 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 295（3）：L379-399。
29. Meyerholz , DK 和 Beck, AP (2018)。转化研究中半定量组织评分的基本概念。 ILAR J 59（1）：13-17。
30. Moodley, Y.、Sturm, M.、Shaw, K.、 Shimbori , C.、Tan, DB、Kolb, M. 和 Graham, R. (2016)。人间充质干细胞减轻急性肺损伤通气猪模型中的早期损伤。干细胞研究17（1）：25-31。
31. 奥斯特兰德，GK (1996)。水生毒理学技术。 CRC/刘易斯出版社。
32. Potere , N., Valeriani , E., Candeloro , M., Tana, M., Porreca , E., Abbate, A., Spoto , S., Rutjes , AWS 和 Di Nisio , M. (2020)。 2019 年冠状病毒病住院患者的急性并发症和死亡率：系统评价和荟萃分析。重症监护24（1）：389。
33. Purdie, GL, Purdie, DJ 和 Harrison, AA (2011)。与溶剂一起工作的医学实验室工作人员中的雷诺现象。风湿病杂志38(9)：1940-1946。
34. Rosenthal, C.、Caronia, C.、Quinn, C.、Lugo, N. 和Sagy , M. (1998)。急性肺损伤动物模型的比较。 Crit Care Med 26（5）：912-916。
35. Stenlo, M., Hyllen, S., Silva, IAN, Bolukbas, DA, Pierre, L., Hallgren, O., Wagner, DE 和 Lindstedt, S. (2020)。在 LPS 诱导的急性肺损伤猪模型中，来自气道的颗粒流速增加先于 ARDS 的临床症状。 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 318(3)：L510-L517。
36. Stenlo ，M.，Silva，IAN， Hyllen ，S.， Bolukbas ，DA， Niroomand ，A.，Grins，E.， Ederoth ，P.， Hallgren ，O.，Pierre，L.，Wagner，DE，等。（2021 年）。在 LPS 和 COVID-19 诱导的 ARDS 中用颗粒流速监测肺损伤。生理代表9（13）：e14802 。
37. Suvarna, KS, Layton, C. 和 Bancroft, JD (2018)。 Bancroft 的组织学技术理论与实践电子书：Elsevier 健康科学。
38. Tiba ，MH，McCracken，BM，Leander，DC， Colmenero ，CI， Nemzek ，JA， Sjoding ，MW，Konopka，KE， Flott ，TL， VanEpps ，JS，Daniels，RC 等。（2021 年）。使用临床相关损伤暴露的急性呼吸窘迫综合征的新型猪模型。生理代表9（9）：e14871 。
39. 联合国。（2015）。改变我们的世界：2030 年可持续发展议程。 A/RES/70/1。纽约，纽约，美国。取自sustainabledevelopment.un.org
40. Wang, HM, Bodenstein , M. 和Markstaller , K. (2008)。三种广泛使用的急性肺损伤动物模型的病理学概述。 Eur Surg Res 40（4）：305-316。