材料和试剂

1. PE-160医用聚乙烯管（Becton Dickinson，MD，USA，目录号： 427431 ）连接到输液泵，用于口内输液
2. 15号不锈钢针（Kruuse，丹麦，目录号：120753），用于植入口内插管
3. Microlance 3 25 g × 5/8" 皮下注射针头（Becton Dickinson，MD，USA，目录号：300600），用于注射程序
4. 动物：Wistar 大鼠（280 – 393 g，雄性，9 周龄；西班牙奥维耶多大学动物饲养室）
5. 用于腹膜内注射的液体：LiCl（0.15 M，10 mL/kg）（VWR Chemicals，目录号：25007-230）、NaCl（1.5 M，10 mL/kg）和等渗盐水（0.9%，10 mL/kg） )（VWR Chemicals，目录号 27810-262）
6. 用于口内输注的香料：0.1％（w / w）糖精钠（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：47839）
7. 盐酸氯胺酮（50 mg/kg）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：1356009）
8. 盐酸美托咪定（0.15 mg/kg）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：1179333）
9. 酮洛芬（1.5 mg/kg）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：1356632）
10. 恩诺沙星（0.3 mg/kg）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：17849）
11. 氯己定（0.3 mg/kg）（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：282227）
12. 的 PE-90医用聚乙烯管（Becton Dickinson，MD，USA，目录号：427519 ）
13. O 形圈 Mini Stix 结扎带（TP Orthodontics Inc.，IN，USA，目录号：383-927），用于将 PE-90 管牢固地固定在口腔中
14. 注射器 1 mL（Becton Dickinson，目录号：309628）和 5 mL（BD，目录号：309646）

设备

1. 定制的TR装置（见图1）
2. 输液泵（KD Scientific Inc，MA）
3. 连接到台式计算机的摄像机（Sony Optical 20 × ）

图 1. 味觉反应装置。
具有不同组件的 TR 装置的前视图。 (A) 输液室。 (B) 输液泵。 (C) 45 °角的镜子。 (D) 摄像机。 (E) 计算机。有关该装置的更详细说明，请参见注 2。

软件

1. Observer XT 9.0 (Noldus Information Technology, Sterling, VA) 事件记录程序，用于对视频进行评分。该计算机软件是一个自动化系统，可以直接在 TR 室中记录动物的行为，并以定量的方式对表现出的行为的顺序和持续时间进行编码。

程序

有关描述协议不同步骤的架构，请参见图 2 。

图 2. 使用 TR 测试调查享乐反应的行为协议。

1. 受控的标准条件下（从上午8点开始的 12 小时光照/黑暗循环；环境温度为 21 ℃ ）。始终在家里的笼子里提供食物。请注意，单独的住房是为了防止老鼠从笼子里拔出插管。
2. 插管手术
使用 Parker (1995) 描述的方法和我们实验室之前使用的方法 (Gasalla et al ., 2016, 2017) 对大鼠进行手术植入口内插管。插管程序（见图 3）在下面的注 4 中有详细描述。
3. 监测和适应
从手术中恢复后，将大鼠置于限水计划中，包括每天 1 小时取水（在任何实验液体暴露后约 2 小时给予）和在家笼中自由取食。可以监测家庭笼子食物和水的摄入量，但这不是必需的。然后，通过在 TR 装置中提供 1 mL 水输液（输液速度 1 mL/min），使大鼠习惯输液过程。
4. 口内调理
接下来的四天构成调节阶段。在这些会议上，将大鼠置于 TR 装置中（将其套管连接到输液泵以进行流体输送）。口内注入糖精溶液 2 分钟（1 毫升/分钟），并在口内输注后立即注射 LiCl（锂组）、高渗 NaCl（高渗组）或等渗盐水（等渗组）。在第二次和第四次调理后，让老鼠在家笼子里恢复水。视频记录大鼠在糖精溶液输注过程中表现出的口面部反应。
5. 口面部反应测试
在最后一次调理会议后的第二天执行 TR 测试。在录制大鼠口面部反应的视频时，提供 2 分钟（1 毫升/分钟）的糖精溶液口内给药。

图 3. 插管程序。
该图显示了插管过程的两个步骤。 (A) 在嘴里插入一根导针。 ( B) 通过针头插入口内套管。有关插管过程的更详细说明，请参见注 4。

评分口面部反应：
1. 食欲反应：舌头突出（舌头伸出嘴巴）、嘴巴运动（下颌骨的运动而不张开嘴巴）和舔爪子（舌头中线延伸到前爪）。使用大鼠显示反应的总秒数作为食欲反应分数。对于具有代表性的食欲 TR 反应，请参阅图 4A 和视频 1，显示在该协议中得分的口面部反应。
2. 厌恶反应：张开嘴（下颌快速大幅度张开，嘴角后缩），下巴摩擦（嘴或下巴与腔室的地板或墙壁直接接触，身体向前突出），脚踩（向前）和前爪同步交替向后运动），前肢连枷（前肢快速水平运动以去除皮毛中的液体）和摇头（快速左右头部运动，张开嘴以去除液体从嘴里出来）。将这些分数相加以提供总的厌恶反应分数（参见图 4B 和视频 1 以了解代表性厌恶反应）。
3. 评估在输液期间不动的时间百分比（得分为抑制大鼠的所有运动，呼吸所需的运动除外）作为条件恐惧的指标。此外，对被动滴水的频率进行评分（每次允许一滴液体从口中泄漏到地板而没有其他口面反应；参见图 4C 和视频 1）。

图 4. 具有代表性的口面部反应。
(A) 食欲反应：舌头突出、爪子舔和侧舌突出。 (B) 厌恶反应：张开嘴、摇头、揉下巴和前肢摆动。 (C) 被动反应：滴水和不动（基于 Inui 和 Shimura，2017 年）。

视频 1。在口内注入风味剂期间录制的口面部反应视频。
完成行为程序后，使用 Observer XT 9.0 事件记录程序对视频进行评分。

数据分析

分别分析在调节过程中得分的反应（食欲、厌恶、被动滴水和不动），并用 3（组） × 5（会话）混合 ANOVA 进行测试。有关数据分析的详细信息出现在原始研究文章中（Dwyer等人，2017 年）。图 5 显示了研究中获得的具有代表性的结果。将味道与 LiCl 引起的恶心或内部疼痛配对会降低食欲反应，但这两种厌恶事件对其他反应有明显的分离影响：只有与恶心配对会导致对味道产生厌恶的口面反应，而与内部疼痛配对导致味道引起不动和被动滴落。此外，恶心和内部疼痛都减少了配对风味的自愿消费（数据未显示）。

图 5.口内调理 (C1-C4) 和测试会话的代表性结果。
(A) 食欲口面部反应的平均持续时间。 (B) 厌恶口面反应的平均数。 (C) 静止不动的平均时间占测试总时间的百分比。 (D) 被动滴水事件的平均数量（改编自Dwyer等人，2017 年）。误差棒代表平均值的标准误差 (SEM)。

笔记

1. 该方案是为作为受试者的大鼠设计的，但适用于其他啮齿动物，包括远交系小鼠（例如，Kiefer 等人，1998）、转基因小鼠（例如，Travers 等人，2007）和鼩鼱（例如，帕克，2006）。
2. TR 设备由透明有机玻璃侧面（26 × 23 × 14 厘米）制成，带有深色盖子，放置在带有透明有机玻璃顶部的桌子上。桌子两侧各有两盏 50 W 白灯提供照明。在腔室下方以 45 °角放置的镜子有助于在口内输注过程中观察/拍摄大鼠的腹面。从这个角度记录对于明确观察口面部反应至关重要，否则如果从侧面或上方进行记录，则可能会模糊不清。如视频 1 所示，录音应尽可能接近动物的头部区域。
3. 为了麻醉，大鼠腹腔注射氯胺酮(50mg/kg)和盐酸美托咪定(0.15mg/kg)。手术后，给大鼠皮下注射抗炎酮洛芬（1.5 mg/kg）和抗生素恩诺沙星（0.3 mg/kg）。
4. 为了植入套管，将一根薄壁 15 号不锈钢针插入颈部后部，直接在耳朵周围皮下，然后从口腔内第一磨牙后面引出。然后将一段内径为 0.86 毫米、外径为 1.27 毫米的 Iintramedic 聚乙烯管穿过针头，然后取出针头。两个方形弹性圆盘放置在管子上并拉到颈部后部暴露的皮肤上，以稳定插管。导管通过 O 形环固定在口腔中，在插管手术之前密封在导管后面。手术后，监测大鼠三天，每天用洗必泰 (0.3 mg/kg) 冲洗其套管以防止感染。
5. 通过连接到植入套管的输液泵向大鼠输液。当老鼠被注入液体时，它们的口面部反应会被连接到计算机的摄像机记录下来。之后，视频由两名对实验视而不见的独立评分者使用事件记录程序手动评分。每个回答至少 75% 的评分者间可靠性得分被认为是可以接受的。
6. 在目前的协议中，食欲和厌恶反应在不同的尺度上进行评分（持续时间与频率），因为它们表现出非常不同的特性：食欲反应通常会在很长一段时间内显示，而厌恶反应则作为孤立的行为发生（参见 Berridge，2000 ）。仅对被动滴水和不动进行评分，因此滴水所花费的时间也不会被记录为不动。对回答进行评分的不同尺度需要分别分析（如上述示例中所示）。 TR 分析通常使用反应的一个子集（特别是张开嘴巴、摩擦下巴和踩爪子的“强烈厌恶”反应）来关注明确的厌恶反应。
7. 用于麻醉和插管手术的药物剂量、输液量或口内调节和测试期间的输液速率等参数是当前实验方案所特有的。这些程序细节可能会因大鼠体重或研究中使用的啮齿动物种类等因素而异。上面，我们在 2 分钟内指定了 1 mL/min 的输注速率。由于非自愿以高于自愿摄入的速率暴露于流体，因此较高的输注速率可能令人厌恶。较低的输注速率是可能的，但低于 0.5 mL/min 的速率可能会导致溶液暴露不足以引发口面部反应。更长的输注时间是可能的；然而，超过 5 分钟的输注时间往往会导致无条件被动和厌恶反应的增加。需要在当前协议中使用多个暴露会话来跟踪条件性恶心和恐惧的获得。当 TR 测试用于探查无条件反应时（例如，对可口的蔗糖与难口的奎宁），每个溶液一次可能就足够了（特别是如果暴露时间延长超过上述指定的 2 分钟）。
8. 如上所述，TR 方法的一些程序细节可以适用于其他种类的啮齿动物，特别是输液速率和输液量等参数。在小鼠和鼩鼱中，输注速度通常为 0.1 mL，持续 1 分钟。较长的输注速度通常会导致这些啮齿动物对甜味和苦味溶液产生更多的厌恶反应（Cagniard 和 Murphy，2009 年）。

致谢

这项工作得到了西班牙科学与创新部 ( MCI20-PID-2019-104177GB-100)对 AB 和 ML 以及阿斯图里亚斯地区政府 (FICYT-PCTI、FC-GRUPIN-IDI/2018/000182) 的资助) 到 ML，并由 Leverhulme Trust 研究资助给 DMD (ID/RPG-2014-342)。我们感谢 Begoña Díaz 的技术支持和对实验动物的照顾。当前协议源自我们之前的工作（Dwyer等人，2017）。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的财务和非财务利益。

伦理

该实验方案遵循欧洲理事会指令 (210/63/UE) 和西班牙法规 RD53/2013 关于实验动物护理和使用的现行指南。

参考

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