材料和试剂
1.6孔板（ J etBioFil ，目录号：TCP011006）
2.0.45μm过滤器（ Jet BioFil ，目录号：FPV403013 ）
3.微量移液器吸头 [ Crystalgen ，目录号：23-5104（10 μL ）； 23-3346 (200 μL ); 23-3150 (1,000 μL )]
4.1.5 mL管（ Crystalgen ，目录号：23-2052）
5.1.5 mL低表面张力管（ Simport ，目录号：T330-7LST）
6.15 mL管（ Crystalgen ，目录号：232266）
7.50 mL管（ Crystalgen ，目录号：203102）
8.0.5μm毛细管玻璃管（华西医科大学仪器厂，目录号： 10032512166199 ）
9.22×40 mm显微镜盖玻片（ Fisherbrand ，目录号：12-545C）
10.微型注射器（World Precision Instruments，目录号：MF28G67-5）
11.玻璃小瓶（ Hamag Technology Co.，Ltd.，目录号：HM-4455A）
12.10厘米培养皿（ JetBioFil ，目录号：MCD110090）
13.扭曲柳叶刀（ HURHONG，目录号：IR28100200）
14.3-巯基-丙基-三甲氧基硅烷（MPTMS）（United Chemical Technologies, Inc.，目录号：M8500）
15.生物素-PEG 3500-SGA（ JenKem ，目录号：62717）
16.链霉亲和素-马来酰亚胺（SA-MAL）（Sigma，目录号：S9415）
17.30％牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A0336）
18.制霉菌素（Sigma，目录号：N4014）
19.硼硅酸盐玻璃珠（Duke Scientific，目录号：9002）
20.链霉亲和素（ Sangon Biotech，目录号：A1004970-0001）
21.PBS（基因组，目录号： GNM20012-2 ）
22.矿物油（Fisher Scientific，目录号：BP2629-1）
23.pMD2.G质粒（ Addgene ，目录号：12259）
24.psPAX2质粒（ Addgene ，目录号：12260）
25.聚乙烯亚胺线性（PEI）（ Yeasen ，目录号：40816ES02）
26.胰蛋白酶（ Yeasen ，目录号： 40127ES60 ）
27.RPMI 1640培养基（ BasalMedia ，目录号：L220KJ ）
28.DMEM培养基（ BasalMedia ，目录号：L110KJ）
29.293T（来自孙启明实验室）
30.FBS（ Yeasen ，目录号：40130ES76）
31.慢病毒质粒（来自孙启明实验室）
32.氩气（上海舞钢气体有限公司）
33.磷酸盐缓冲液（见配方）
34.C 缓冲区（见配方）
35.N2 缓冲液（见配方）
36.CR 缓冲液（见配方）
37.清洁缓冲液 I（参见配方）
38.SA-MAL 原液（见配方）
39.PEI溶液（见配方）
40.制霉菌素原液（见配方）

设备

1.50 毫升烧杯
2.微量移液器 20、200、1000 (Eppendorf)
3.离心机（Eppendorf，目录号：5424R）
4.4 °C冰箱（ Melng ，目录号：YC-300L）
5.Z2细胞计数器（Beckman，目录号：AY52487）
6.微量移液器支架（ Narishige ，目录号：HI-7）
7.微锻（ Narishige ，目录号：MF-900）
8.转子（麒麟贝尔，目录号：BE-1100）
9.微量移液器拉拔器（Sutter Instrument，目录号：P-1000）
10.生物膜力探针（BFP ，本实验室制造）
11.干燥器（Yue Cheng Trading，目录号：PC-150mm PC-150 ）
12.采血设备（ HURHONG ，目录号： 116B015002 ）
13.真空泵（JINTENG，目录号：GM-0.33A ）
14.细胞培养箱（Heal Force，目录号：HF90）
15.流式细胞仪（Beckman，目录号： CytoFLEX S ）
16.盖玻璃（ Fisherbrand ，目录号：12545C）
17.光源显微镜（尼康，目录号：Eclipse Ti ）
18.电恒温水浴（Shang Hai Jing Hong，目录号：XMTD 8222）

软件

1.LabVIEW 14.0 开发系统
2.棱镜 8
3.微软 Excel 2019
4.BFP程序（由我们实验室编写）

程序

图 2. 珠子和 RBC 的功能化方案

A.SH-组修饰硼硅酸盐玻璃珠
1.在 1.5 mL 管中称重并将 50 mg 玻璃珠悬浮到 500 μL的 dH 2 O中。
2.将玻璃珠加入5 mL 的煮沸清洁缓冲液I 在 50 mL 烧杯中煮沸 5 min；每分钟混合溶液（图 2A）。
警告：在化学罩中戴手套处理该化合物。
3.煮沸后，在室温 (RT) 下冷却 15 分钟，将溶液转移到15 mL 管中，然后以 17,000 × g离心5 分钟。
4.除去上清液，用15 mL 新鲜dH 2 O在干净的 50 mL 烧杯中重悬玻璃珠，然后继续煮沸 5 分钟。
5.煮沸后，将珠子悬浮液转移到 15 mL 管中，并以 17,000 × g离心5 分钟。重复步骤A 2 – A 5三次。
6.CR 缓冲液重新悬浮玻璃珠并在室温下旋转3 小时（图 2A）。
7.17,000 × g离心5 分钟，弃去上清液。用新鲜甲醇清洗玻璃珠一次并弃去上清液。用 500 μL甲醇重新悬浮玻璃珠。
8.将玻璃珠分成一组 20 个干洗玻璃小瓶。通过喷射干燥的氩气（约 0.05 MPa，由压力阀）在小瓶内以 45° 角轻轻水平旋转5分钟。
9.将小瓶放入 120 度预热的干燥箱中 °C 5 分钟。
10.加热后，将小瓶从干燥箱中取出，快速放入充满干燥氩气的真空干燥器中，直至完全冷却 15 分钟。
注意：干燥器用真空泵抽真空，然后用干氩气冲洗。
11.的MPTMS玻璃珠可以在干燥和黑暗的储存箱中在室温下储存长达三个月。

B.重组配体包被的珠子的制备
1.取出一瓶含有磷酸盐缓冲液 (pH = 6.8) 的 MPTMS 玻璃珠并将其重新悬浮到 1.5 mL 管中，以 17,000 × g离心5 分钟，弃去上清液，再用磷酸盐缓冲液洗涤两次。
2.用 200 μL的磷酸盐缓冲液重新悬浮 MPTMS 珠子，并用 Z2 细胞计数器（例如，3 × 10 8珠子/mL）计算MPTMS珠子的浓度。
3.将 200 μL的MPTMS 珠子与 20 μL的 4 mg/mL SA-MAL 库存溶液混合（图 2A）。
4.在 RT 下用旋转过夜孵育混合物。然后，用含 0.5% BSA 的磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，以 17,000 × g离心5 min，重悬于 200 μL含 0.5% BSA 的磷酸盐缓冲液中，用 Z2 细胞计数器计数后于4 °C保存。
5.含有 0.5% BSA的 200 μL PBS 中混合所需的生物素化重组配体（在不同的试管中添加一系列滴定，例如 1、0.1、0.01、0.001 和 0.0001 μg ）与 2 × 10 5链霉亲和素 (SA) 珠子在1.5 mL 低表面张力管中（图 2A）。
注意：对于BFP 测定，通过调整表面密度，粘附频率应<20% 在微球上添加所需的生物素化重组配体，以确保大约90 %的单键事件。
6.在 RT 下旋转孵育混合物 30 分钟；然后，用含有 0.5% BSA 的 PBS 洗涤 3 次，重悬于 100 μL含有 0.5% BSA 的 PBS 中，并储存在 4 °C用于 BFP 测定。

C.生物素化红细胞的制备
1.将生物素-PEG 3500-SGA 从 -20 °C冰箱中取出，并在 RT 中放置 30 分钟。然后，从 4 °C冰箱中取出一瓶（约 10 mL）C 缓冲液和一瓶（约 15 mL）N2 缓冲液。预热 (37 °C) 用于后续实验的电恒温水浴。
2.准备一个含有 1 mL C 缓冲液的 1.5 mL 管。使用手指刺、刺血装置和扭转柳叶刀从志愿者的小瓶中加入一大滴血（约 100 μL）（图2B ）。
3.× g洗涤和离心血液两次 2.5 分钟，然后用 500 μL C 缓冲液重悬。
4.用 Z2 细胞计数器计算 RBC 的浓度，并通过将 3 mg 生物素-PEG 3500-SGA 溶解到 1 mL 的 C 缓冲液中来制备 3 mg/mL 的生物素-PEG 3500-SGA（图 2B）。
5.将 500 μL 7.5 × 10 7 /mL RBC 悬浮液与 117 μL 3 mg/mL 生物素-PEG 3500-SGA 混合在 1.5 mL 管中，加入 383 μL C缓冲液以获得 1 mL 孵育体积，然后用在 RT 的 50 mL 管中旋转 30 分钟。
6.孵育后，将 RBC 悬浮液以 2,500 × g 离心 2.5 分钟，再用 1 mL 的 N2 缓冲液在 2,500 × g下洗涤和离心 2.5 分钟，然后用 200 μL的 N2 缓冲液重悬 RBC。
7.μL的 N2 缓冲液中加入 5 μL制霉菌素原液，从步骤C6中加入 20 μL的 RBC 悬浮液，彻底混合，并在 1.5 mL 管中在 4 °C下旋转孵育 1 小时（图 2B）。
8.× g下将 RBC 悬浮液离心 2.5 分钟，用 1 mL 含有 0.5% BSA（37 °C预热）的 N2 缓冲液洗涤两次，并用 200 μL含有 0.5% BSA 的 N2 缓冲液重新悬浮 RBC。
9.将 5 μL RBC 溶液加入约 500 μL受体-配体相互作用缓冲液（如 RPMI-1640）中，观察 RBC 形状（图 3）。
注：红细胞呈椭圆形为宜，可通过步骤C7中制霉菌素的浓度进行调整。

图 3. 非理想和理想 RBC形状示例。比例尺 = 2 μ m 。

D.跨膜受体表达细胞系的建立
1.在 10 cm 培养皿中培养 293T 细胞至 80%–90% 汇合，用 2 mL PBS 洗涤细胞，加入 1 mL 胰蛋白酶对细胞进行胰蛋白酶消化1 分钟，用 5 mL 含10% FBS的 DMEM 停止胰蛋白酶消化，并通过在 300 下离心收集细胞 × g 3 分钟。
2.去除上清液，用 2 mL 的 PBS 重新悬浮，并洗涤一次。用 5 mL 的 DMEM 培养基重悬并计数，将 293T 细胞的浓度调整为2.5 × 10 6 / mL。
3.将 2 mL 的 DMEM 培养基添加到 6 孔板的每个孔中，将0.2 mL的293T 细胞从步骤D2到板上，摇匀。
4.将板放入细胞培养箱中，在 37 °C 下用 5% CO 2孵育过夜。细胞完全贴壁后，准备转染。
5.中加入 1 μg慢病毒质粒、1 μg psPAX2 质粒和 1 μg pMD2.G 质粒到 250 μL无 FBS 的 DMEM 培养基中。孵育 5 分钟。
6.同时，将 6 μL的 PEI (1 mg/mL) 添加到另一个 1.5 mL 的 250 μL无 FBS 的 DMEM 培养基管中，并孵育 5 分钟。
7.将 PEI 溶液缓慢添加到混合质粒溶液中并孵育 15 分钟。
8.将步骤 D7 中的混合溶液添加到具有 293T 细胞的 6 孔板中，并在 37 °C 下用 5% CO 2孵育。 48 小时后，收集培养基中的慢病毒，用 0.45 μm过滤器过滤，并储存在 -20 °C冰箱中。
9.准备要感染的靶细胞（如293T或U937；细胞类型可根据每个实验确定），在6孔板中加入2 mL细胞（2.5×10 6 /mL）。
10.等待细胞完全贴壁约 24 小时，加入 500 μL制备的慢病毒（对于悬浮细胞，直接加入 500 μL制备的慢病毒）。
11.37 °C 5% CO 2孵育48小时，流式细胞仪检测跨膜受体的表达水平。
12.对受体表达细胞进行排序以获得细胞系并为 BFP 实验做准备。

E.BFP检测的操作
1.将 0.5 mm 玻璃毛细管放在玻璃切割机上，选择程序，然后单击“开始”按钮。玻璃毛细管可以加热成两个尖尖的毛细管。通过选择程序，获得合适的毛细管尖端：6-8 mm 锥度和 0.1-0.5 μm尖端。
2.使用微量移液器锻造熔化毛细管尖端并将尖端插入已加热的玻璃球中。冷却玻璃球。毛细管可以从玻璃球的表面破裂。重复此过程，直到毛细管尖端孔口合适（RBC 为 2.0–2.2 μm ，珠子约为 1.5 μm ；毛细管尖端孔口取决于细胞直径的大小）。
3.使用玻璃切割机将盖玻片切割成所需的宽度（通常为玻璃宽度的三分之一），并将切割的玻璃粘在腔室支架的顶部和底部，形成平行盖玻片细胞室（图 4A ）。
4.使用 200 μL移液器在细胞室中注入缓冲液（如 DMEM 或 PBS；可根据实验更改）。
5.将5 μL准备好的靶细胞（约 10 4 个细胞）、 5 μL准备好的珠子和 5 μL准备好的 RBC 注入细胞室。将矿物油注入细胞室的两侧，以防止长时间实验过程中缓冲液的挥发影响实验结果（图4B）。

图 4. BFP 实验的细胞室。
(A) 盖板玻璃被切割并粘在腔室支架的顶部和底部。 (B) 注入缓冲液以填充腔室，然后依次注入目标细胞、珠子和 RBC；最后，用矿物油密封电池室的两侧。

6.打开光源显微镜并将细胞室放在显微镜台上。
7.回填处理过的毛细血管 dH 2 O，并将毛细血管放入移液器支架中。此过程应快速完成，确保在注射过程中没有气泡进入移液器支架。
8.将移液器支架放在微机械手上（图 5B）。将微量移液器推向细胞室，将毛细管尖端带入腔室，并调整微量移液器位置以在显微镜视野下找到毛细管尖端。
9.控制RBC微量移液器的水塔高度，改变微量移液器内部的压力，调整微量移液器的零位（对RBC无吸力或吹气力），并进行校正。
10.移动腔室支架并调整微移液器的位置以找到目标细胞、珠子和 RBC。通过改变微量移液器内的压力来吸入它们，并将显微镜场切换到程序的视野（图 5C 和视频 1）。
11.调整红细胞和珠子的高度，确保它们在一个统一的平面上，然后慢慢移动珠子以粘附在红细胞上。调整压力和位置以将珠微移液器移开（图 5D 和视频 1）。
12.将目标单元格与 RBC 和珠子对齐在同一平面上（图 5E 和视频 1）。

图 5. BFP 的实验设置。
(A) BFP 系统的设置。 (B) 将三个微移液器移入腔室。 (C) 吸出 RBC、珠子和靶细胞。 (D) 通过将珠子连接到 RBC 来建立力探头。 (E) 调整目标单元的位置以与力探头对齐。

13.选择 BFP 程序来测量微量移液器、RBC 和珠子的各自直径，以及 RBC 和珠子之间的接触面积（图 6 A和视频 2）。
14.在红细胞和珠子之间的接触区域画一条水平线，这将在相邻窗口中产生一条曲线，以在实验过程中调整信号。如果曲线不尖锐——意味着RBC和珠子没有对齐（图 7） ——重新开始。
15.选择力钳测定实验模式，根据需要设置参数（如夹紧力和接触时间，图 6B），然后单击“开始”。然后，该程序将通过移液与珠子接触 0.1 秒并收回来循环驱动目标细胞的运动。同时，实时记录珠子的位置（视频2 ）。在 500–1000 个事件后，单击“停止”以停止 BFP 实验并保存记录的数据。
注意：生成了大约 100 条键寿命曲线。

图 6. BFP 实验的测量和参数设置。
(A) 测量力探头的参数以校准系统中的力，顺序如下： 1：微量移液器； 2：红细胞； 3：红细胞与珠子的接触面积； 4：珠子。 (B) BFP 系统中的程序接口。

图 7. BFP 系统中的珠子跟踪。
绘制一条水平线（红色）以跟踪珠子的边界并获得跟踪曲线（右）。陡峭的曲线确保了 BFP 周期期间的稳定信号。

数据分析

1.打开 BFP 数据分析程序并选择键寿命模式打开数据（图 8）。
2.检查每个循环的力和粘合寿命，记录哪些循环包含粘附事件，哪些不包含（图 9A 和 9B），并计算粘附频率。
3.在上述检查的每个循环中，记录键寿命参数（键寿命和平均力）。
4.在一定范围的力量下收集所有的一生事件。使用 BFP 数据autobin程序，将所有事件分组以制作“生命周期力”曲线（图 9）。

图 8. BFP 数据分析程序的图形用户界面

图 9. BFP数据示例（来自 Hu 等。 , 2021)。
(A) 附着力的原始数据曲线 (记录和收集粘合寿命)。 (B) 没有粘附事件。 (C) 从上述数据收集中获得的寿命力曲线。

笔记

1.当微量移液器吸出红细胞时，微量移液器中的红细胞尾部不能超过微量移液器的半径，以保证实验过程中检测力的准确性。
2.无法将粘附频率超过 20% 的数据收集到最终数据中。
3.当磁珠跟踪不稳定时，应立即停止实验并开始新的一组。
4.同一目标细胞和珠子的连续碰撞事件不应超过 1000 次。键寿命通常来自单个寿命力曲线中 > 20 个靶细胞-珠对。
5.确保靶细胞健康，避免非特异性粘附，影响实验结果。

食谱

1.磷酸盐缓冲液（pH = 6.8）
200 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O
200 mM Na 2 HPO 4调节至 pH = 6.8
2.C 缓冲液 (pH = 8.5)
100 毫米碳酸氢钠3
2 CO 3调节至 pH = 8.5
3.N2 缓冲液 (pH = 7.2)
280 毫米氯化钾
40 毫米氯化钠
1 μM KH 2 PO 4
8 毫米钠2 HPO 4
28 毫米蔗糖
用 HCl 调节至 pH = 7.2
4.CR 缓冲器
46.6 毫升甲醇
0.4 mL 乙酸（冰醋酸 17.5 M）
1.85 毫升 dH 2 O
1.15 毫升 MPTMS
5.清洗缓冲液 I (pH = 10.9)
10% H 2 O 2
用 NH 3 ·H 2 O调节到 pH = 10.9
6.4 mg/mL SA-MAL 原液
在 500 μL的磷酸盐缓冲液（pH = 6.8）中溶解 2 mg SA-MAL 。每管加入 10 μL ，并储存在 -80 °C。避免反复冻融。
7.1 毫克/毫升 PEI溶液
将 1 mg PEI 直接溶解在 1 mL 的 dH 2 O 中。用 NaOH 调节至 pH = 7.4。
8.制霉菌素原液
溶解在 DMSO 中，浓度为 5 mg/ mL。

致谢

我们感谢波士顿大学的 Evan Evans、佐治亚理工学院的朱成、生物物理研究所的楼继中和中国科学院在 BFP 系统设置方面的帮助。我们也感谢浙江大学医学院提供的资源和技术支持。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

伦理

本研究使用人红细胞经浙江大学伦理委员会授权。

参考

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