材料和试剂

适当的生长培养基[例如， MOPS 基本培养基（ Neidhardt 等人，1974）]
50 mM NaHPO 4 ，pH 6.7
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)
Talon Superflow金属亲和树脂（Takara 635670；用于可溶性蛋白质的纯化）
~1 mM 荧光素 5' 马来酰亚胺 (FM; AnaSpec AS-81405) 在无水二甲基甲酰胺 (DMF) 或二甲基亚砜 (DMSO) 中的储备溶液
10 mM Tris-Cl，pH 8
β-巯基乙醇
传感器存储：含有 10% 甘油的溶液，分别是培养基中标记的细菌细胞，或纯化的蛋白质缓冲液。将样品冷冻在-70°C。
缺铁 MOPS 最低培养基（ Neidhardt等人，1974）（见食谱）
无铁玻璃器皿（见食谱）
50 mM 磷酸钠，pH 6.7（见配方）
磷酸盐缓冲盐水（见食谱）

设备

高速离心机（Beckman-Coulter，型号：Avanti J25）
分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU800）
荧光计（OLIS Clarity；型号：OLIS-SLM- Aminco 8100）
台风生物分子成像仪（GE/ Amersham ，型号：8600）

程序

定点荧光传感器的总体设计与工程
该方法基于在 OM 或可溶性结合蛋白的一级结构中定位位点，这些位点耐受Cys取代和外在荧光团的化学修饰。使用晶体学数据或结构模型[例如，来自CHIMERA的MODELLER算法（Pettersen 等。 , 2004) ]，我们预测可访问位点，在这些位置对单个Cys残基进行基因工程改造，并用荧光团标记所得的Cys突变蛋白。无论这种预测的基础如何，每个构建体的标记程度和生化功能都必须通过实验验证。因此，对于每个感兴趣的蛋白质，我们选择 4 – 6 个候选目标残基，诱变它们以替代Cys ，评估它们的表达、它们对不同马来酰亚胺荧光团烷基化的敏感性以及它们对与配体相互作用的总体敏感性。

Cys目标残基的选择替代诱变
对于完全描绘出三级或四级结构的蛋白质，我们选择具有突出其配体结合位点附近的侧链的候选残基，这样配体的吸附可能会导致连接的荧光团猝灭。例如，大肠杆菌FepA ( EcoFepA ) 在其表面前庭的环中结合铁载体肠杆菌素 (FeEnt) (Smallwood et al . , 2014 )。其晶体结构 (Buchanan et al ., 1999) 正确预测了Cys突变蛋白EcoFepA_S271C和EcoFepA_A698C易于荧光化，然后对FeEnt结合敏感 (Smallwood et al ., 2014)。对于肺炎克雷伯菌 Iron ( KpnIroN ) 尚未在结构上解决，但与EcoFepA具有 82% 的同一性，我们依赖于 >25% 的序列同一性预测相同的整体蛋白质折叠的指导原则 ( Ginalski , 2006; Stokes-Rees 和Sliz , 2010)。为了确定KpnIroN中的标记目标，我们使用 CLUSTALW 将其与EcoFepA [PDB 序列 1FEP (Buchanan et al ., 1999)] 对齐，然后使用 CHIMERA (UCSF) 的建模器来预测KpnIroN三级结构，包括表面环。这导致了位于 L2 的突变体 KpnIroN_T210C 的选择和工程化，通过 FM（ Chakravorty 等人，2019）。

Cys突变蛋白
作为一般方法，我们使用 PCR 从特定细菌物种的染色体中克隆感兴趣的结合蛋白。当传感器源自大肠杆菌OMP 时，我们克隆编码其成熟蛋白的核苷酸序列，并将它们插入到pITS23中 EcofepA 的天然启动子下游（Scott等人，2001），它是低拷贝pHSG575的衍生物（竹下等人，1987）。可以通过多种方法在蛋白质中产生半胱氨酸置换突变体；我们按照制造商的说明使用 pITS23 上野生型基因的QuikChange诱变 (Agilent) (Ma et al ., 2007)，突变侧翼有互补寡核苷酸。通过纯化质粒的测序 ( Gene wiz ) 确认突变后，表达并荧光标记完整细胞中的传感器蛋白，这些蛋白可在 -70 °C 下冷冻保存。如果所需的传感器来自可溶性结合蛋白，则在质粒 pET28a 中克隆相关结构基因，在成熟蛋白的 N 端或 C 端添加 6-组氨酸 (6H)- 标签，并通过以下方法纯化金属离子亲和层析（Talon Superflow ，Takara Bio Inc.）。

Cys突变蛋白表达及荧光标记分析
在其天然的毛皮调节启动子的控制下携带野生型EcofepA 。对于其他大肠杆菌OMP 传感器的表达，我们将pITS23中的 EcofepA 精确地替换为备用 OMP 结构基因（具有自己的信号序列），这样铁调节的 EcofepA启动子控制 OM 蛋白的生物合成。对于其他细菌物种的 OM 蛋白，我们将编码成熟EcoFepA的序列替换为编码外源成熟 OM 蛋白的序列，该序列位于EcoFepA信号序列的下游，并受EcofepA启动子的调节。这种方法允许EcoFepA信号序列指导大肠杆菌OM中外源 OMP 的分泌和组装。接下来，为感兴趣的 OM 传感器蛋白的高水平表达选择适当的条件。我们利用大肠杆菌宿主 OKN1359，因为它无法制造肠杆菌素( entA ) 或运输铁 ( ΔtonB )导致在缺铁 MOPS 培养基 ( Chakravorty ) 中生长期间铁调节的传感器蛋白过度表达等人，2019；库马尔等人，2022）。此外，OKN1359 不含几种 OM 蛋白（ Δfiu 、 ΔfepA 、 Δcir ），这有助于外源 OM 蛋白的表达。将Cys突变体构建体在活细胞中原位暴露于 FM 或其他荧光团马来酰亚胺（例如，香豆素马来酰亚胺和 Alexa Fluor 马来酰亚胺；见下文）。通过在 MOPS 培养基到对数后期（A 600nm = 2.5 – 3.5)，并分析 SDS-PAGE 解析样品，或对细菌 OM 或可溶性纯化蛋白组分进行免疫印迹，以可视化传感器蛋白的生产和修饰程度。对于可溶性结合蛋白，通过金属亲和层析（例如 Talon Superflow 、Takara Bio Inc）从细胞裂解物中纯化 6H 标记的Cys突变蛋白，用 FM 或其他荧光团马来酰亚胺对其进行修饰，然后用丙酮重新纯化荧光标记的传感器沉淀或凝胶过滤色谱。

荧光标记
对于荧光团马来酰亚胺的修饰，将含有质粒的细菌接种到 LB 中，该质粒从冷冻库存中编码Cys突变体 OMP，在 37 °C下通过摇动（200 rpm）过夜培养菌株，并在 1% 下通过摇动将亚培养到 MOPS 基本培养基中(200 rpm) 在 37 °C下 10 – 12 小时，直到指数期后期。以 7,500 × g离心15 分钟收集细胞；用 50 mM NaHPO 4 ，pH 6.7洗涤并重悬。使用微量移液器吸头将少量马来酰亚胺荧光团（例如 FM）粉末转移到 0.5 mL 无水 DMF 或DMSO中，并根据其在 10 mM Tris-Cl，pH 8 中 488 nm 处的吸光度确定该储备溶液的浓度( ε mM = 80)。储备溶液可储存在 -20 °C 。计算库存的适当稀释系数，然后在 50 mM NaHPO 4、pH 6.7 中标记细菌细胞或纯化蛋白质，方法是在 37°C 下添加 FM 至 5 μM的最终浓度15分钟。通过添加 β-巯基乙醇至 140 μM终止标记反应，该反应会立即与过量的荧光团马来酰亚胺发生反应。通过在 7,500 × g下离心 15 分钟收集荧光细胞后，用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤，并将标记的细菌重新悬浮在 PBS 中。立即在光谱实验中使用标记的细胞或将它们放在冰上（最多 24 小时），或将甘油添加到 15% 并将它们（无限期地）作为 1-mL 等分试样储存在 -70 °C 。在后一种情况下，将标记的细胞解冻后，在微量离心机中离心沉淀，清洗一次，然后将其重新悬浮在 PBS 中。为了评估蛋白质表达或 FM 标记的程度，用样品缓冲液溶解细胞悬浮液的等分试样，并将它们进行 SDS-PAGE。电泳后，首先用荧光成像仪 (Typhoon 8600GE/ Amersham ) 观察标记的程度，然后用考马斯蓝 R 对凝胶进行染色 (Ames, 1974)。

荧光光谱结合测定
我们在 OLIS-SLM AMINCO 8100 荧光光谱仪中观察荧光团标记的细胞，升级了 OLIS 操作系统和软件（OLIS SpectralWorks ，OLIS Inc.，Bogart，GA），以控制其快门、偏振器和数据收集。我们还使用具有相同操作软件的 OLIS Clarity 荧光光谱仪进行荧光检测。对于结合测定，将 2.5 × 10 7标记的细胞沉积在石英比色皿（最终体积：2 mL）中，并在 37 °C 下搅拌，测量初始荧光（F 0 ），然后添加增加浓度的配体，同时监测在 520 nm 处猝灭荧光发射 (F)。

分步协议
传感器菌株以最大化Cys突变体 OMP表达，或纯化可溶性Cys突变体结合蛋白。
对于细菌，根据 600 nm 处的吸光度确定细胞密度；对于纯化的蛋白质，从 280 nm 处的吸光度确定浓度。
通过离心沉淀细菌细胞 7,500 × g 15 分钟，然后重悬于相同体积的 50 mM NaHPO 4 ，pH 6.7。重复。对于可溶性结合蛋白，使用适当的分子量截止管或膜，在 50 mM NaHPO 4 ，pH 6.7中透析纯化蛋白溶液 (1 – 5 mg/mL) 过夜。
DMF 或 DMSO中溶解约 1 mg 的 FM ；通过在 10 mM Tris-Cl、pH 8 ( ε mM = 8.1)。
将细菌细胞或纯化的蛋白质暴露于 50 mM NaHPO 4 ，pH 6.7 中的 5 μ M FM（或其他马来酰亚胺荧光团），在 37 °C下 15 分钟，然后用 140 μ M β-巯基乙醇淬灭反应。
以 7,500 × g离心15 分钟沉淀细菌细胞，然后重悬于相同体积的 PBS 中。重复离心并以~10 9 /mL重悬 PBS 中的细胞；用 PBS透析荧光可溶性结合蛋白过夜，以去除多余的荧光团。
荧光细胞或蛋白质的等分试样来评估共价修饰的功效；在 488 nm 激发和 520 nm 发射进行分析。计算样品的特定荧光（荧光强度/10 9 个细胞或/mg 蛋白质）。
测量天然配体的荧光猝灭程度。
使用、储存在冰上（最多 24 小时），或保存在 -70 °C的 10% 甘油中。

数据分析

对于传感器-配体淬灭的荧光光谱测量，每次测量一式三份，并计算每个配体浓度下 F/F 0的平均值。对于荧光猝灭数据的分析和曲线拟合，绘制 1-F/F 0 vs 。 [配体] 并通过 1 位点结合模型分析数据，使用Grafit 6.0.12 ( Erithacus Ltd. West Sussex, UK)或Enzfitter ( Biosoft , Cambridge, UK)，将数据拟合到单位点饱和曲线，其中结合的配体量绘制为游离量的函数：
这些图产生 K D [Bound]=(Capacity [Free])/(K_D+[Free]) 每个受体 - 配体相互作用的值，以及相关的标准误差。

笔记

宿主细菌
来自许多革兰氏阴性菌的 OM 蛋白，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Kumar et al . , 2022)、鲍曼不动杆菌( Nairn et al ., 2017), Caulobacteri 新月形( Balhesteros et al ., 2017) 等，易受 FM 标签的影响原位，在那些活细胞的细胞包膜中。然而，实验室大肠杆菌的细胞表面是表达和标记天然和外源 OM 蛋白的首选环境，因为它不受 LPS O 抗原或荚膜多糖的影响。因此，我们在实验室大肠杆菌宿主菌株中进行大多数标记反应。
蛋白质表达
建议采用最大化目标 OM 蛋白产量的克隆/表达策略。我们将铁调节的毛皮启动子与缺铁 MOPS 培养基结合使用，以最大限度地提高大肠杆菌中外源蛋白的表达。然而，其他启动子（例如lac或tac ）同样有效。
用于细菌生长和靶蛋白表达的培养基
由于我们实验中铁调节的启动子，我们使用 MOPS 基本培养基，它是肠杆菌科的完整基本培养基（Neidhardt et al., 1 974) ，并且通过在其配方中排除 FeSO 4和 tricine很容易导致缺铁。我们没有对在其他特定培养基或肉汤中生长的细胞进行化学修饰的经验，但我们预计，无论生长培养基如何，用 50 mM NaHPO 4 （pH 6.7）进行初步洗涤都会导致有效的马来酰亚胺标记反应。

图 1 。代表性数据。
A.大肠杆菌FepA中Cys取代的荧光标记。野生型 (++) EcoFepA及其七个Cys突变体在 MOPS 培养基中生长，并在 50 mM NaHPO 4 (pH 6.7) 中用 5 µM FM 在 37 °C 下标记15 分钟。细胞裂解物通过 SDS-PAGE (Ames, 1974) 进行解析，并在台风成像仪上扫描凝胶的 520 nm 荧光。 FM 不与野生型FepA发生反应，但它在不同程度上标记了Cys突变体。将凝胶蛋白转移到硝酸纤维素上并用 α -FepA进行探测 mAb 45 (Murphy et al ., 1990)/[ 125 I]-蛋白 A 以监测表达。某些突变体（T216C、S271C、A698C）被 FM 化学计量标记。 B. FeEnt 与 EcoFepA-A698C-FM 结合期间的荧光猝灭分析。将产生EcoFepA或其突变体 A698C 的细胞 (OKN3 ( ΔfepA (Ma et al ., 2007))暴露于 FM、洗涤并在 OLIS/SLM- Aminco 8100 荧光计中进行分析，在 488 nm 处激发并在 520 nm 处发射. EcoFepA_A698C-FM 显示出强烈的荧光，在 10 nM时被淬灭 FeEnt在 100 秒时加入。数据点是三次测量的手段；灰色误差条表示相关的均值标准差。

食谱

缺铁 MOPS 最低培养基（ Neidhardt 等人，1974）
10 × MOPS 浓缩液
以下配方适用于 1 L 10 ×浓缩液：
拖把 83.7 克
NH 4 Cl 5.1 克
K 2 SO 4 0.48 克
氯化钙2 0.56 毫克
MgCl 2 · 6H 2 O 1.07克
氯化钠 29.25 克
将 MOPS 添加到约 800 mL 的双蒸 H 2 O。用 KOH 颗粒（~14 g）将 pH 值调节至 7.4，添加其他组分，使体积达到 1 L，并通过 0.2 μm过滤器。
不要高压灭菌。
1,000 ×微量营养素溶液
这些量适用于 100 mL 的 1,000 ×微量营养素溶液。
(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O 37 毫克
CoCl 2 · 6H 2 O 71毫克
高压氧3 250 毫克
CuSO 4 · 5H 2 O 25毫克
氯化锰2 160 毫克
氯化锌2 13.6 毫克
通过 0.2 μm过滤器。不要高压灭菌。将 1:1,000 稀释到最终培养基中。
1,000 × KH 2 PO 4溶液
100毫升中 30 克。将 1:1,000 稀释到最终介质中。
准备最终媒体
在无铁烧瓶中加入 1 mL 的 KH 2 PO 4溶液到 900 mL 的双蒸 H 2 O 中，然后高压灭菌。加入 100 mL 过滤灭菌的 10 × MOPS 浓缩液和 1 mL 过滤灭菌的 1,000 ×微量营养素溶液。接种前，添加碳源（例如， 0.4% 葡萄糖）、氨基酸和营养缺陷型维生素，以及适当的抗生素。

无铁玻璃器皿
要去除玻璃器皿中的外来铁，请在烧瓶或瓶子中加入0.1N 1 N HCl ，在室温下浸泡过夜，然后用蒸馏水彻底冲洗。
50 mM 磷酸钠，pH 6.7
6.9 g 一水合磷酸二氢钠 (NaH 2 PO 4 · H 2 O) 在 1 L 蒸馏水中。
用 1 M NaOH 将 pH 值调节至 6.7。
磷酸盐缓冲溶液
将以下物质溶解在 1 L 蒸馏水中：
氯化钠 8 克
氯化钾 0.2克
Na 2 HPO 4 1.44 克
KH 2 PO 4 0.24 克

致谢

这项研究得到了美国国立卫生研究院赠款 GM53836 和 R21AI115187 以及美国国家科学基金会向 PE Klebba和 SMC Newton 赠款 MCB0952299 的支持。作者感谢在实验中成功应用这些程序的许多本科生、研究生和博士后研究人员。这些方法派生的原始研究文章是：曹等人。（ 2003 年）， Chakravorty等人。（ 2019 年），汉森等人。（ 2016 年），库马尔等人。（ 2022 年），马等。（ 2007 年），奈恩等人。（ 2017 年），佩恩等人。（ 1997 年）和Smallwood 等人。（2009 年、 2014 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。这些程序部分或全部包含在美国专利号：US 10,604,782 B2 和美国专利申请号：US 2021/0263014 A1 中。

伦理

本文报道的程序不涉及人类或动物受试者。

参考

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