材料和试剂

1. “拉链”密封样品袋；厚度，2 密耳，尺寸，6 × 9 英寸。
2. 10 mL无菌聚苯乙烯一次性血清移液管（Genesee Scientific，目录号：12-104）
3. 15 mL锥形离心管，架子（聚丙烯，Olympus Plastics，目录号：28-101）
4. 2.5 英寸牙签，针尖，可高压灭菌（无菌）（ LevGo ，目录号：18250-NP）
5. 200 µL XTIP4 屏障吸头，低结合，架装，预灭菌（不含 RNase 和 DNase）（Genesee Scientific，目录号：24-712）
6. 250 mL Erlenmeyer 烧瓶（Pyrex，制造商编号：4980250/EMD）（Fisher Scientific，目录号：S63271）
7. 500 mL Erlenmeyer 烧瓶（Pyrex，制造商编号：4980500/EMD）（Fisher Scientific，目录号：S63273）
8. 一次性培养管，硼硅酸盐玻璃 13 × 100 mm（Fisher Scientific，目录号：14-961-27）
9. 一次性塑料比色皿半微量，1.5 mL（Fisher Scientific，目录号：14955127）
10. 一次性培养皿，聚苯乙烯，无菌，半堆叠（100 × 15 mm）（VWR，目录号：25384-088）
11. 普通 PTFE 搅拌棒，长度：70 mm；直径：10 mm（Fisher Scientific，目录号：16255801）
12. 塑料盖（盖住培养管）（DWK Life Sciences，制造商编号：7366013）（Fisher Scientific，目录号：14-957-91）
13. Poxygrid 96 位试管架；用于 13-16 mm 管（Bel-Art，目录号：F18765-0001）
14. PYREX 格里芬低型 1 L 烧杯，双刻度，刻度（Pyrex，制造商编号：10001L/EMD）（Fisher Scientific，目录号：S14276）
15. 琼脂灰 2.0%–4.5%（Sigma-Aldrich，目录号：A7002-250G）
16. 铝箔卷（用于覆盖锥形瓶的开口以用于灭菌和培养菌株）（Fisher Scientific，目录号：01-213-105）
17. 氯化铵（NH 4 Cl）（Fisher Scientific，目录号：A661-500）
18. 氯化钙二水合物（CaCl 2 ·2H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：C79-500）
19. 五水硫酸铜（CuSO 4 ·5H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3036）
20. D-生物素（Fisher Bioreagents，目录号：58-85-5）
21. 用于分子生物学的甘油（Fisher Bioreagents，目录号：BP229-4）
22. 卤虫使用的volcanii菌株包括先前描述的 H26 亲本和 SH125 突变体 ( ΔoxsR ) (Mondragon 等。 , 2022)
23. 七水硫酸铁（FeSO 4 ·7H 2 O）（Alfa Aesar ，目录号：7782-63-0）
24. L 形细胞扩散器（Fisher Scientific，目录号：14-665-230）
25. 六水氯化镁（MgCl 2 · 6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M0250-KG）
26. 七水硫酸镁（MgSO 4 ·7H 2 O）（Fisher Science Education，目录号：S25414A）
27. 四水合氯化锰（MnCl 2 ·4H 2 O）（Fisher Chemical，目录号：M87-100）
28. Nanopure水（从 Barnstead/Sybron Nanopure II 4-Module Water Purification System 纯化）
29. Novobiocin钠盐（ ≥93 ％HPLC）（Sigma-Aldrich，目录号：74675-1G）
30. 氯化钾（ KCl ）（Fisher Chemical，目录号：P217-3）
31. 无水磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Fisher Chemical，目录号：P288-500）
32. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Fisher Chemical，目录号：P285-500）
33. 硫酸钾（K 2 SO 4 ）（Fisher Chemical，目录号：P304-500）
34. 氯化钠 (NaCl) 认证的 ACS 结晶（Fisher Scientific，目录号：S271-10）
35. 次氯酸钠 ( NaOCl ) 试剂级，有效氯 10% – 15%（Sigma-Aldrich，目录号： 425044-250mL）
36. 硫胺素（Sigma 细胞培养物，目录号：T3902）
37. Tris-碱（Fisher Bioreagents，目录号：BP152-500）
38. 胰蛋白胨（Fisher Bioreagents，目录号：BP1421-500）
39. 尿嘧啶，99+%（ Acros有机物，目录号：66-22-8）
40. 酵母提取物分子遗传学粉末（Fisher Bioreagents，目录号：BP1422-500）
41. 七水硫酸锌（ZnSO 4 ·7H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：7446-20-0）
42. 浓度为 30% (w/v) 的浓缩盐水 (SW) 储备溶液（参见配方）
43. GMM 基地（见食谱）
44. 补充剂（见食谱）
0.5 M 磷酸钾缓冲液 (KPB)，pH 7.5，共 100 mL
1.5 毫克/毫升尿嘧啶
硫胺素和生物素溶液共 10.8 mL
总共 12 mL 的 Hv-最低盐
总共 100 mL 的微量元素
45. 添加到 GMM 基础的补充剂量总计 1 L GMM + 尿嘧啶（参见食谱）
46. 对于 GMM + 尿嘧啶琼脂板，总共 500 mL （参见食谱）
47. 对于 ATCC 974 培养基板，总共 500 mL（参见食谱）

设备

1. Cimarec基本搅拌加热板（ ThermoFisher Scientific，目录号：SP194715）
2. Genesys 40 可见分光光度计（ ThermoFisher Scientific，目录号：SP194715）
3. Genie 2涡流混合器（Fisher Scientific，目录号：12-812）
4. Heratherm培养箱（ Thermo Scientific）
5. I24 培养摇床系列（New Brunswick Scientific）
6. 迷你旋转器（20 °角，2–80 rpm，带圆盘和夹具，120 V， Glas -Col Terre Haute，美国）
7. 移液器（10 –100 µL， Rainin ，pipet-lite）
8. Spectronic 20+ 分光光度计（ ThermoSpectronic ，滤光片：600–950 nm）

软件

1. Microsoft Excel（版本 16.16.27）

程序

A. 菌株的制备
1. 使用无菌牙签，从 -80 °C 甘油库存中挑选一小部分冷冻的H. volcanii菌株，然后将其划线到甘油最小培养基（GMM）板上。对每个菌株重复此操作，包括亲本、突变体和补体菌株。储备液由冷冻在含有 20% (v/v) 甘油的 GMM 中的固定相细胞组成。
2. 在 42°C 的封闭塑料拉链袋中孵育板 5 天，直到出现菌落。
3. 使用经过消毒的牙签，收集五个孤立的菌落，并将它们放入 250 mL Erlenmeyer 烧瓶中的 20 mL GMM 中。这种方法避免了稀释压力。
4. 使用 I24 孵化器摇床在 42°C（200 rpm，旋转摇动）下培养细胞。
5. 孵育 48 小时后，通过在一次性塑料比色皿中无菌转移 0.2 mL 培养物和 0.8 mL 新鲜 GMM，制备每个菌株的 1:5 稀释。使用Genesys 40 可见分光光度计测量 600 nm (OD 600 )处的光密度，使用未接种的 GMM 空白仪器。将在仪器上获得的值乘以 5 以确定原始 OD 600 。细胞的 OD 600应为 0.8 到 1.0，相当于对数后期。
6. ，用新鲜 GMM 将细胞稀释至 65 mL 最终体积中 OD 600为 0.1。例如，对于 OD 600为 0.89 的细胞，将 7.3 mL 的细胞培养物与 57.7 mL 的新鲜 GMM 混合。轻轻旋转稀释的细胞进行混合。
7. 使用 10 mL 无菌移液器，将这种细胞悬浮液的等分试样（5 mL）转移到每个菌株类型的 12 个松散封盖的无菌 13 × 100 mm 玻璃培养管中。包括带有 5 mL 新鲜未接种 GMM 的管作为阴性对照。
8. Glas -Col）在 42°C 下曝气孵育细胞培养物 12 小时（详见下文）。使用最大百分比速度设置 50 进行旋转。在Heratherm培养箱中进行培养。
9. 通过将带塑料盖的培养管直接插入Spectronic 20+ 分光光度计来测量培养物的 OD 600 （在测量样品之前，请参阅图 2以使用Spectronic 20+ 分光光度计）。使用未接种的对照来确定背景信号。细胞应达到对数期，估计 OD 600为 0.4–0.6。确保在进行 OD 600测量之前关闭仪器的盖子。

图 2.测量样品前设置 Spectronic 20+ 分光光度计的步骤。
1) 向右转动电源开关/归零控件，打开分光光度计。 2) 确保滤光片杆设置为 600–900 nm 且红灯已打开。 3) 波长应调整为 600 nm。 4) 让分光光度计预热 15 分钟。 5) 调整电源开关/调零控制，将透射率百分比调整为 0。 6) 将 13 × 100 mm 玻璃培养管放入样品室，其中仅含有将用作空白的培养基 (GMM) 到 7) 调整透射率/吸光度控制 (100%T/0A) 至 100/0。
注意：不要取下塑料盖；盖子和管子都应该安装在隔间中。

B. 孵化设置
使用以下设置在Heratherm培养箱中培养培养管（图 3 ）：
1. 将培养管放在连接到迷你旋转器的 96 位试管架上。
2. 将带有培养管的迷你旋转器放在培养箱的顶架上。
3. 在孵化器的底部架子上，用蒸馏水填充 1 L 烧杯，直至达到 1，000 mL 标记，以保持孵化器中的水分。
4. 打开旋转器并慢慢将最大速度百分比增加到 50。
NaOCl后使用相同的孵育设置。

图 3. 孵化设置工作流程示意图。
带圆圈的数字指的是文中的步骤。

C. 氯化钠的制备
1. 货物到达后，将NaOCl试剂分配到 15 mL 锥形管中的 10 mL 等分试样中，并储存在-80°C（未监测NaOCl储存时间）。
2. 对于每个实验，将 10 mL 的冷冻NaOCl库存解冻至室温。解冻后，短暂涡旋溶液。
3. 然后，将 5 mL 的解冻NaOCl溶液转移到新鲜的 15 mL 锥形管中，用作 16.2 M NaOCl库存。
4. NaOCl库存连续稀释至 2.025 M 的最终浓度，如下所示：将 2.5 mL 的纳米纯水分配到三个 15 mL 锥形管中，通过将 2.5 mL 的 16.2 M 库存转移到三个管中的第一个并混合溶液以产生 8.1 M 原液，重复 1:2 稀释两次，最终浓度为 2.025 M（图 4A ）。

图 4. NaOCl制备和补充工作流程示意图。
NaOCl的制备； B) NaOCl的补充。带圆圈的数字指的是文中的步骤。

D. NaOCl的补充(图 4B )
1. 为每个菌株随机选择 12 个培养管中的一半，以添加或不添加 5 mM NaOCl 。
2. 纳米纯水补充第一组 6 个培养管。
注意：加入水后立即涡旋每个单独的细胞培养管。
3. NaOCl补充第二组 6 个细胞培养物，最终浓度为 5 mM。
NaOCl后立即涡旋每个单独的细胞培养管。

E. 补充NaOCl后监测细胞生长
1. 在补充NaOCl后，每 24 小时在 42°C 下孵育一次，从微型旋转器中取出所有细胞培养管。
2. 检查培养管，看管外是否有可见的标记。如果试管外部有标记，请使用带有乙醇的 Kimwipe 去除标记。此操作将允许使用Spectronic 20+ 分光光度计更准确地测量OD 600 。
3. 将每个培养管分别直接放入分光光度计以确定 OD 600值。
4. 如果使用Spectronic 20+ 分光光度计，请确保在记录 OD 600之前关闭盖子。
5. 重复这些 OD 600测量 10 天。

F. 进一步分析在次氯酸盐胁迫中可能表现出两种不同反应的菌株
1. 将细胞暴露于第二轮次氯酸盐压力（图 5 ）。
为了进一步分析突变的生物学意义，将具有相似生长模式的池管视为独立组。例如，本例的突变菌株在第一次压力测定后被视为三个独立的组。第一组由为模拟控制汇集的培养管组成。第二组是在 5 mM NaOCl下未生长的细胞培养物库。第三组是在 5 mM NaOCl存在下生长的细胞培养物库。
a. 步骤 A5相同的测量方法测量两组的 OD 600 。
b. 重复步骤 A6和A7 。
c. B 节所示，将细胞培养物孵育 10 小时。
d. 重复C – E部分的所有步骤。

图 5. 准备与次氯酸盐二次孵育的菌株的工作流程示意图。
带圆圈的数字指的是文中的步骤。

2. 平板计数测定
在监测每个细胞培养管的生长 10 天后，随机选择每种样品类型的 2 或 3 个技术重复，在 18% 浓缩盐水 (SW) 中进行连续稀释（图 6 ）。
a. 首先将 1 mL 的细胞培养物转移到经过消毒的 1.5 mL 微量离心管中。
b. 然后，将这种细胞培养物的 50 μL 转移到具有 950 μL 18% SW 的 1.5 mL 微离心管中，并通过上下移液混合样品。
c. 再重复步骤 b 三次，生成 1:20、1:400、1:8,000 和 1:16,000 的连续稀释系列。
d. 使用 L 形细胞吊具在 ATCC 974 琼脂培养基板上放置 100 μL 的稀释样品。
e. 让盘子风干约 15 分钟。将风干板放入塑料袋中，在 42°C 下孵育 5 天。
f. 当菌落可见时，选择一个似乎有 30 到 300 个菌落的平板。计算菌落总数。
g. 通过将菌落数乘以计数板的稀释因子来计算样品每毫升的 CFUs (CFUs/mL)。请注意，由于仅镀了 100 μL 的细胞，因此除了原始稀释因子 (*DF) 范围为 400 到 16,000 之外，每毫升 CFU 的计算中还必须包含 10 的倍数。

图 6. 平板计数分析的示意性工作流程。
带圆圈的数字指的是文中的步骤。

G. 数据分析
1. 记录和绘制 OD 600单位随时间（小时）的变化。使用散点图比较不同菌株和培养条件的生长模式，包括模拟 (H 2 O) 和实验组（暴露于 5 mM NaOCl ）。图 7显示了一个示例。

图 7. 比较图 1 的“新设置”的增长曲线的散点图

2. 计算每个菌株的生长速率和倍增时间。
a. 针对 LN（OD 为 600）绘制时间 (h) 以更好地识别指数阶段（直线）。选择给出最佳直线的最佳两个（或三个）点（图 8 ）。

图 8. 针对 LN（OD 为 600）绘制时间 (h) 以更好地识别指数阶段（直线）

b. 图表设计< 按添加图表元素< 转到趋势线< 选择线性< 转到更多趋势线选项< 选择图表上的显示方程来计算增长率（图 9 ）。这将为您提供趋势线的方程式，其中包括线的斜率，即每小时发电量 (gen/h) 的增长率。
注意：每 12 个技术复制的增长率是单独计算的。然后，根据每个重复的所有增长率计算平均增长率 (µ)。

图 9. 寻找增长率。
选择更多趋势线选项后，确保选项设置为线性 (A) 并选择在图表 (B) 上显示方程。趋势线的斜率是每小时发电量 (gen/h) 的增长率。

c. 要计算倍增时间 ( k )，请使用以下公式中的平均增长率：
k = 1/ µ
d. 计算每个平均增长率和倍增时间的标准偏差 (±)。
e. 对于添加了 5 mM NaOCl的菌株，指数期将比模拟对照 (H 2 O) 晚得多。如图 10所示，在添加 5 mM NaOCl后选择了形成一条直线的两个点。

NaOCl后找到为菌株制作趋势线的点。
确保选择构成直线的点。

3. 使用梯形法则计算曲线下面积 (AUC)
a. 对于每个技术复制，通过找到每个梯形的面积来找到曲线下的面积。例如，第一个梯形位于 x = 1 和 x = 2 之间，使用以下公式（图 11A ）：
面积 = (y1 + y2)/2*(x2 - x1)
b. 计算其他梯形的面积（图 11B ）。
c. 然后，将所有梯形的面积相加，求总和即为生长曲线的 AUC（图 11C ）。
d. 对每个菌株的每个技术重复重复上述步骤，然后找到平均误差和标准误差。
e. 有关指导 AUC 计算的有用参考，请参阅Github链接https://rdrr.io/github/leonpheng/lhtool/man/AUC.html 。
f. 在条形图中绘制每个菌株的 AUC 平均值，并分别添加技术重复并将它们转换为散点图（图 11D ）。使用每个实验的平均值通过 F 检验计算它是否具有相等的方差。如果是这样，请使用双尾学生 t 检验分析来确定菌株之间是否存在显着差异。
注意：如果发现方差不相等，可以进行双尾非配对 Welch t 检验，而不是Student t 检验。

图 11. 计算Haloferax的曲线下面积 (AUC) 火山菌株 (H26)。
A) 使用面积 = (y1 + y2)/2*(x2 - x1) 求梯形的面积。 B) 计算其他梯形的面积。 C) 求所有面积之和，求曲线下面积。 D) 条形图示例显示 AUC 和使用学生的菌株之间的显着差异 t检验分析。

食谱

第一组配方适用于甘油微量培养基加尿嘧啶（GMM + 尿嘧啶），并根据Halohandbook进行了修改（戴尔-史密斯，2009 年）。
1. 浓度为 30% (w/v) (1 L) 的浓缩盐水 (SW) 储备溶液
a. 使用纳米纯水作为溶液总体积的大约 70%（约 700 mL），并在热板上加热。
注意：微波炉也可以用来加热水。
b. 当水变暖时，将以下盐一一加入，让每一种盐完全溶解：
氯化钠 240 克
MgCl 2 ·6H 2 O 30克
MgSO 4 ·7H 2 O 35克
氯化钾7 克
1 M Tris 碱（pH 为 7.5，用 HCl 调节 pH） 20 mL
2. GMM 底座（1 升）
纳米纯水 20.4 mL
30% SW 647.2 毫升
1 M Tris 碱（pH 为 7.5，pH 用 HCl 调节）32.4 mL
使用前高压灭菌溶液。
3. 补充剂
0.5 M KPB，pH 7.5，总计 100 mL
1 MK 2 HPO 4 83.4 毫升
1 M KH 2 PO 4 16.6 毫升
pH 值应约为 7.5。
注意：混合化合物时，将少量 1 M KH 2 PO 4添加到 1 MK 2 HPO 4中，同时监测pH 值。当所有 1 M KH 2 PO 4都加入后，pH 值应约为 7.5。请勿添加 HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.5。
使用前过滤溶液并在室温下储存。

1.5 毫克/毫升尿嘧啶
Halohandbook建议通过溶解在 DMSO 中制成 50 mg/mL 的尿嘧啶溶液。然而，DMSO 是一种反应性化合物，可能会使细胞暴露于氧化应激。为了更好地控制次氯酸盐胁迫条件，将尿嘧啶在 42 °C 下以 1.5 mg/mL 的浓度溶解在纳米纯水中过夜，并使用 I24 培养箱摇床以 200 rpm 的速度旋转摇晃。约 16 小时后，过滤溶解的尿嘧啶并在室温下储存。

1 mg/mL 新生霉素
新生霉素用于选择用含有新生霉素抗性标记的质粒转化的细胞。质粒通常用于携带感兴趣的野生型基因并证明可以补充突变。在纳米纯水中溶解 10 毫克/毫升的新生霉素，然后稀释 10 倍至 1 毫克/毫升的工作库存。将多余的试剂分装在-20°C 以备将来使用。

硫胺素和生物素溶液共 10.8 mL
1 毫克/毫升硫胺素 9.6 毫升
1 毫克/毫升 D-生物素 1.2 毫升
使用前过滤溶液并储存在 4 °C。

总共 12 mL 的 Hv-最低盐
1 M NH 4 Cl 5.0 毫升
0.5 M CaCl 2 6.0 毫升
微量元素 1.0 毫升
nanopure水填充高达 12 mL 。
过滤溶液。使用前使 Hv-minimal 盐新鲜。

总共 100 mL 的微量元素
将以下元素溶解在约 70 mL 的纳米纯水中：
MnCl 2 ·4H 2 O 36毫克
ZnSO 4 ·4H 2 O 44毫克
FeSO 4 ·7H 2 O 230毫克
CuSO 4 ·5H 2 O 5 毫克
在 4°C 储存之前，用nanopure水填充高达 100 mL并过滤。

4. 添加到 GMM 基础的补充剂量总计 1 L GMM + 尿嘧啶
将计算出的 GMM 碱基量添加到无菌烧瓶中（总 GMM 减去所有补充剂的总体积）。然后添加每个补充的以下卷：
1 M 甘油 20 毫升
0.5 M KPB，pH 7.5 1.9 毫升
1.5 毫克/毫升尿嘧啶 33.4 毫升
硫胺素和生物素溶液 0.882 mL
Hv-最低盐 11.8 毫升
注意：对于补体和空载体菌株，GMM + 尿嘧啶通过使用 1 mg/mL 新生霉素的储备溶液补充 0.3 μg/mL 新生霉素。
5. 对于 GMM + 尿嘧啶琼脂板，总共 500 mL
a. 用带有搅拌棒的 7.5 克琼脂对 GMM 底座的体积（总 GMM 减去所有补充剂的总体积）进行高压灭菌。将溶液冷却至 60°C 30 分钟。冷却培养基后，加入相同的补充剂，同时在板上搅拌 GMM 培养基和琼脂：
1 M 甘油 10 毫升
0.5 M KPB，pH 7.5 0.950 毫升
1.5 毫克/毫升尿嘧啶 16.7 毫升
硫胺素和生物素溶液 0.441 mL
Hv-最低盐 5.9 毫升
b. 将培养基倒入培养皿中（每个盘子约 20 mL）。使用前让介质凝固并冷却。
注意：对于补体和空载体菌株，GMM + 尿嘧啶板通过将 1 mg/mL 的新生霉素扩散到干燥的 GMM + 尿嘧啶板上，补充 0.3 µg/mL 的新生霉素。在从 -80 °C 甘油库存中接种菌株之前，允许新生霉素溶液在板上干燥。

以下配方适用于经过修改的 1 L ATCC 974 培养基板：
纳米孔水 ~700 mL
氯化钠 125 克
MgCl 2 ·6H 2 O 50克
钾2 SO 4 5 克
CaCl 2 ·2H 2 O 0.134克
胰蛋白胨 5 克
酵母提取物 5 克
用 1 M KOH 调节至 pH 6.8
琼脂 15 克
用纳米孔水和高压灭菌器填充多达 1,000 mL。
将培养基倒入培养皿中（每个盘子约 20 mL）。使用前让介质凝固并冷却。注意：对于含有质粒的菌株，使用与 GMM + 尿嘧啶浓度相同的新生霉素。

致谢

授予 JMF 和 AS 用于开发系统生物学工具的资金来自双边 NSF/BIO-BBSRC 计划 (NSF 1642283)。授予 JMF 以确定古细菌氧化还原调节的资金来自美国能源部、基础能源科学办公室、化学科学、地球科学和生物科学部、物理生物科学计划 (DOE DE-FG02-05ER15650)，并提供生物进化方面的见解系统通过美国国立卫生研究院 (NIH R01 GM57498)。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

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2. 伊姆莱，JA (2003)。氧化损伤的途径。 Annu Rev Microbiol 57：395-418。
3. 伊姆莱，JA (2008)。细胞防御超氧化物和过氧化氢。 Annu Rev Biochem 77：755-776。
4. JA 伊姆莱 (2013)。氧化应激的分子机制和生理后果：来自模型细菌的教训。 Nat Rev 微生物11（7）：443-454。
5. Jones, DL 和 Baxter, BK (2017)。 DNA 修复和光保护：克服嗜盐古生菌环境紫外线辐射暴露的机制。前沿微生物8：1882。
6. Loi, VV, Rossius, M. 和 Antelmann, H. (2015)。细菌中可逆蛋白质 S-硫醇化的氧化还原调节。前微生物6：187。
7. Martinez-Pastor, M., Tonner, PD, Darnell, CL 和 Schmid, AK (2017)。古细菌的转录调控：从个体基因到全球调控网络。 Annu Rev Genet 51：143-170。
8. Mondragon, P.、Hwang, S.、Kasirajan, L.、Oyetoro, R.、Nasthas, A.、Winters, E.、Couto-Rodriguez, RL、Schmid, A. 和 Maupin-Furlow, JA (2022)。 TrmB 家族转录因子作为氧化应激反应的硫醇调节因子。 mBio ：e0063322。
9. Panasenko, OM, Gorudko, IV 和 Sokolov, AV (2013)。次氯酸是生命系统中自由基的前体。生物化学（Mosc） 78（13）：1466-1489。
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