材料与试剂

植物材料

塑料培养皿（RPI，目录号：160265）
锋利的刀子
双刃剃须刀刀片（EMS，目录号：72002-01）
载玻片（EMS，目录号：71863-01）
盖玻片（VWR，目录号：48366-067）
当地超市的新鲜白洋葱（见注1）
HEPES 粉末（RPI，目录号：H75030-50.0）
CAPS 粉末（Sigma，目录号：C2632-100G）
KOH 粉末（Sigma，目录号 06103-1KG）
Tween-20（RPI，目录号：P20370-0.5）
去离子 (DI) 水
BAPTA（Sigma-Aldrich，目录号：C2632-100）
曲霉菌的果胶酸裂解酶（Megazyme，目录号：E-PCLYAN2）
NaOH 粉末（Sigma，目录号 RDD007-1KG）
HEPES 20 mM 缓冲溶液（参见配方）
CAPS 50 mM 缓冲液（见配方）
4.7 U/mL (5 mL) 的果胶酸裂合酶（见配方）
BAPTA 2 mM（见配方）

急冻

载玻片（EMS，目录号：71863-01）
网格盒（Thermo Fisher）（见注释 2）
London Finder Quantifoil 网格 NH2 R2/2 铜 200 目 (EMS #LFH2100CR2)（见注释 3）
切碎吸墨垫（Whatman，目录号：1540-055）
液氮
液体乙烷/丙烷（60/40 比例）
乙醇 70%

网格裁剪

FIB 自网格（Thermo Fisher，目录号：1205101）
C 形环（Thermo Fisher）
放大镜 (Intertek LTS-F21-61)
剪笔（Thermo Fisher）
记号笔（红色或黑色）
Autogrid 网格框（Thermo Fisher）
盖笔（Thermo Fisher）

冷冻纤维束铣削

液氮
氩气
航天飞机（Quorum Tech，目录号：12406）

Cryo-ET 筛选和倾斜系列采集

网格盒（Thermo Fisher）
NanoCab（赛默飞世尔）

设备

植物材料

配备相衬的任何光学显微镜

急冻

EMS 镊子（EMS 样式 2、5、3X 和 7）
Vitrobot 镊子 (Inox-Medical LS 11253-27)
柔性LED灯
大镊子和小橡皮筋（EMS 7330 型）
Vitrobot Mark II（赛默飞世尔）
辉光放电器（EMS 100X，不再出售；或者，Pelco easyGlow）
液氮储存系统（Worthington HC35）
LN2 容器 (spearlab.com)

网格裁剪

Autogrid 镊子 (PELCO 5046-SV)
剪切站（Thermo Fisher）

冷冻纤维束铣削

Versa 3D 双光束 FIB-SEM (FEI)
Quorum PP3000T 传输系统（Quorum Tech）

Cryo-ET 筛选和倾斜系列采集

Titan Krios 300 kV 显微镜（Thermo Fisher）
加坦K3直导（加坦）
柱后 GIF 能量过滤器（Thermo Fisher）

软件

SerialEM ( https://bio3d.colorado.edu/ ) (Mastronarde, 2003, 2005) ，控制 TEM
Gatan DM3 ( https://www.gatan.com/products/tem-analysis/gatan-microscopy-suite-software )，用于控制 K3 检测器
Etomo ( https://bio3d.colorado.edu/imod/download.html ) 用于断层扫描重建和 3dmod 用于断层扫描可视化（Kremer 等人，1996 年；Mastronarde，1997 年；Mastronarde 和 Held，2017 年）
用于卷积神经网络 (CNN) 训练和应用的EMAN2 ( https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 ) （Chen 等人，2017 年；Tang 等人，2007 年，第 2 页），Amira 和 Xtracing插件 (Thermo Fisher) ( https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/software-em-3d-vis/amira-software.html ) 用于分割（Rigort 等人， 2012)
用于自动对齐和重建的 ARETOMO ( https://msg.ucsf.edu/software )
源自Dimchev 等人的自定义脚本。 (2021)
R 和 R studio 分析数据（ https://cran.r-project.org/index.html，https://www.rstudio.com/ ）

程序

洋葱细胞壁果皮的制备

注意：此协议涉及使用液氮和其他低温液体，如果处理不当，可能会导致严重燃烧。请参阅您所在机构的有关操作这些液体的安全指南。对于本手稿中描述的所有以下步骤，玻璃化后的样品应始终使用预冷工具进行处理，因此在接触网格或网格框之前始终预冷工具，以避免样品失透。
收集新鲜、坚硬、水合的白洋葱（见注释 1）。
切掉洋葱的尖端，去除干燥的褐色表面层，直到到达第一个新鲜层（视频 1，步骤 1）。这是第一层（图 1A）。

图 1. 洋葱鳞片的解剖结构和表皮细胞壁剥落的产生。 ( A ) 纵向切洋葱的全局视图。 ( B ) 洋葱鳞片的侧视图和俯视图（分别为左视图和中视图）。黑线表示要切掉尖端的第一个切口。红线表示要创建矩形细胞壁果皮的切口。右图是三个独立的矩形鳞片外植体的顶视图，黑线表示要进行的切口以创建手柄，这些手柄将用于在下一步中生成果皮。 ( C )顶行：左图显示了三个矩形鳞片外植体的顶视图。在这里，远轴表皮朝上（发光的蜡质面），是用于产生细胞壁剥离的一面。中间是一片剥皮过程中的洋葱鳞片。透明的膜是细胞壁的剥离。右侧显示了两个细胞壁剥离，其末端的两个手柄在 HEPES 缓冲液中孵育。底行：剥离过程的侧视图。左侧显示刚切开的鳞片，因此未切割远轴表皮层（黑色虚线）。两侧的方块是用来拉动细胞壁剥离的手柄。中间显示了从秤的主体拉开手柄以撕掉远轴表皮层的过程的开始。右侧显示表皮剥离，其中远轴表皮细胞被撕成两半。侧面的两个手柄用于操纵果皮。 ( D ) 成功剥离的远轴表皮细胞壁的对比相位图像。背斜细胞壁呈锯齿状边缘。另见视频 1。

视频 1. 洋葱去皮。描述了从完整洋葱中创建细胞壁果皮的去皮程序；它分为五个步骤：i) 洋葱的准备，ii) 鳞片取样，iii) 准备鳞片，iv) 细胞壁剥落，v) 细胞壁剥落筛选。

创建两个深入的纵向切口，向下延伸到洋葱的核心。这些切口应覆盖大约四分之一的洋葱 (90°)（视频 1，步骤 2）。
从这个切除的部分拆开鳞片。鳞片是凹的（图 1B），远轴侧（将创建果皮的地方）面向外（凸部）。请注意天平的顺序。
切断刻度的尖端（距离尖端几厘米）并保留刻度的中央大部分（图 1B，黑色虚线和视频 1，步骤 3）。
将这个中央部分纵向切割成几个带，每个带大约 3 厘米长和 1 厘米宽（图 1B，红色虚线和视频 1，步骤 3）。现在应该从刻度上切下几个矩形 (3 × 1 cm)。蜡状、疏水的一面是表皮，多孔的一面稍后将被丢弃。
对于每个带，在距近轴多孔侧的四肢 0.5 厘米处创建两个横向切口。这些切口应穿过整个鳞片，除了蜡质背轴薄膜，即表皮细胞壁（图 1B 和 C 以及视频 1，步骤 4）。切除的鳞片现在应该有两个松软的末端，这里称为手柄（视频 1，步骤 4）。
抓住其中一个手柄，向表皮细胞壁折叠并通过短暂有力的拉动将远轴表皮细胞撕成两半。应听到Velcro声音（视频1 ，步骤 4）。
两个厚手柄之间的连续膜表明细胞壁剥离成功（图 1C）。
切断其中一个手柄并将果皮安装在载玻片和盖玻片之间。通过光学显微镜筛选果皮以控制其质量。只有接近 100% 撕裂细胞的果皮才会被冷冻（图 1D，视频 1，步骤 5）。
在 HEPES 20 mM 缓冲液（见配方 1）中孵育果皮 20 分钟，以清除细胞壁果皮上的细胞残留物。

细胞壁果皮的暴跌冷冻

注意：洋葱细胞壁果皮需要与 FIB 光束平行呈现，以实现最佳铣削。因此，尽管无法看到细胞，但在 FIB-SEM 中冷冻、剪裁和安装网格期间，跟踪果皮内细胞的方向非常重要（见注释 4）。
打开 Vitrobot 并准备液氮和乙烷/丙烷杯（视频 2，步骤 1）。

视频 2. 细胞壁剥离的暴跌冷冻。描述了细胞壁剥离玻璃化过程：i）准备冷冻井，ii）对网格进行辉光放电，iii）切割细胞壁剥离以适应 EM 网格，iv）在 EM 网格上设置细胞壁剥离外植体, 和 v) 网格印迹和插入冻结。

图 2. 细胞壁剥离的暴跌冷冻。 ( A ) 冷冻设置的全局视图：1- Vitrobot，2- 冷冻井，3- 各种镊子和镊子，4- 带有 HEPES 缓冲液和细胞壁果皮的培养皿，5-将解剖细胞壁果皮的载玻片, 6- 灯与桌子相切，7- 液氮杜瓦瓶，8- 用于网格盒的液氮容器，9- 丙烷/乙烷加气站，以及 10- 在将玻璃化网格转移到网格框。 ( B ) 细胞壁剥离的顶视图，其中一个手柄（左一个）已被移除。黑色虚线表示要进行的第一个切口。红色虚线表示后面要进行的切口，以生成要定位在 EM 网格上的小矩形。 ( C ) London Finder Quantifoil 网格的顶视图，细胞壁剥离沿网格槽口定位。右侧插图显示洋葱细胞的长轴或多或少平行于主槽口的方向。另见视频 2。

在 20 mA 下对网格进行辉光放电 1 分钟（视频 2，步骤 2）。
收集所有必要的工具和设备来准备插入式冷冻机旁边的细胞壁矩形（图 2A）。
准备带标签的网格盒（见注 2）和末端带有吸水垫的长镊子。
将细胞壁果皮放在装有一滴 HEPES 缓冲液的载玻片上。永远不要让果皮变干。
将与玻璃滑梯相切的明亮光线照向实验者，以便看到薄细胞壁剥离的边缘（视频 2，第 3 步）。
或者，如果果皮的某些末端看起来不太理想，则将其切掉并丢弃，以便现在可以访问要使用的区域。
使用 Vitrobot 镊子在三角形槽口处安全地抓住 Quantifoil EM 网格（图 2C 显示 Quantifoil 槽口，视频 2，步骤 3）。
使用锋利的剃刀刀片，在果皮末端施加恒定压力，以制作干净的切口，平行于果皮的长边，如果可能，大约 1 厘米长。在果皮的整个宽度上重复此过程，以使干净的平行切口长度相等（图 2B 黑色虚线，视频 2，步骤 3）。
从果皮的一侧开始，垂直于步骤 B9 中生成的切口进行干净的切口。这将释放一个大约 3 × 1 毫米的小矩形，可以安装在 EM Quantifoil 网格上（图 2B 红色虚线，视频 2，步骤 3）。
用另一只手和另一把镊子，抓住其中一个矩形果皮短端的尖端并将其拖到网格上，使果皮的长边与网格槽口平行（图 2C，视频 2 ，第4步）。
将 Vitrobot 镊子夹在降低的杆上，将其装入 Vitrobot 腔室中，然后按下踏板以在腔室中抬起镊子（视频 2，第 4 步）。
印迹设置：湿度 50%，20 °C。
网格首先被手动反向印迹大约 6 秒，然后按下小贩以启动前后自动印迹的两次迭代（5 秒，最大印迹力和排水时间 3 秒）（视频 2，步骤 5）。
将网格存储在网格框中（见注释 2）。
重复步骤 B8 到 B15 以制作更多网格。
完成后，将网格盒存储在液氮存储杜瓦瓶中（视频 2，步骤 5）。

网格裁剪

注意：详细裁剪将不再描述，因为这已在其他地方完成（Wagner等人，2020）并且可以在线找到（ https://em-learning.com/totara/dashboard/index.php ）。然而，注释 4 中强调了如何将自动网格的铣槽与洋葱皮的长边对齐。
将 C 形环装入剪笔中。尽可能多地准备。
或者，如果使用Thermo Fisher FIB autogrids，使用 Sharpie 在凹口的另一侧标记网格的两侧（以便在以后的步骤中轻松定位凹口）。
将 FIB 自动网格放在剪切站中。
冷却剪裁站并盖上盖子，以避免冰污染在站内积聚。盖上盖子执行所有后续操作。
夹住每个网格，小心地将自动网格的铣槽与果皮的长边对齐，确保果皮朝下，以便在后面的步骤中将其暴露在 FIB/SEM 光束中（图 3）。

图 3。使用 FIB 自动网格剪切玻璃化网格。裁剪网格的俯视图和侧视图（分别为左视图和右视图）。顶视图强调细胞壁剥离（和网格的缺口）需要如何与自动网格的缺口对齐，以允许平行于细胞壁剥离进行铣削。黑点是肉眼可见的地标，用于定位 FIB 自动网格。侧视图强调的是peel需要暴露在autogrid的圆角部分。在裁剪站中裁剪时，这意味着网格需要朝下。这允许样品暴露于 FIB 光束。

冷冻纤维束铣削

注意：cryo-FIB 铣削过程在其他地方也有详细描述（Schaffer 等人，2015 年；Wagner 等人，2020 年）。如果使用低温传输室 Quorum PP3000T 和 Versa 3D DualBeam FIB-SEM，重点将放在几个相关的关键点上。
或者，如果需要 GIS 涂层，请将 GIS 针的温度调整为 26 °C。
使用垂直插入的穿梭机冷却装载井（图 4A 和 4B）。

图 4。使用 Quorum PP3000T 系统加载 FIB/SEM 中的剪切网格。 ( A ) cryo-FIB/SEM 设置的全局视图。 CHE3010T 是液氮罐，可冷却流动的氮气，使样品保持低温。 ( B ) 在穿梭车中装载网格的井的顶视图。梭子安装在一个铰链系统上，在这个例子中是垂直的。 ( C )上图：可容纳两个格子的梭子图片。底部：装载在穿梭车中的网格的顶视图（左）和夹紧系统的简化图（右）。注意铣槽和果皮朝上。这对于成功铣削至关重要。 ( D ) 斜周细胞壁薄片铣削过程的 FIB 视图。薄片用橙色包装。在薄片上方和下方看到的是背景。 ( E ) (D) 中所示的最终薄片的 SEM 视图。请注意，薄片的上方和下方都被暗孔包围。这确保了 TEM 中的电子束将有一条清晰的路径穿过薄片到达检测器。

将带有裁剪网格的网格框转移到井中。
将网格加载到两个槽中（也可以一个一个地加载网格，以避免在铣削过程中室内冰污染过多）并确保铣削槽口垂直放置（参见注释 5，图 4C）。这将确保剥离与 FIB 光束平行。
泵下井，将穿梭机加载到传输杆上，并将杆连接到低温制备室。
注意：在将棒从井转移到制备室期间的低温仅由真空维持。在此步骤中必须尽快进行以避免脱玻化。
15 mA的铂金溅射涂层60 秒。
将梭子从准备室转移到 SEM 室。
筛选网格并确定感兴趣的区域。
对于每个点，保存 x 和 y 坐标，继续将舞台设置为 eucentric 高度，并更新它们的 z 坐标（见注释 5）。
对于每个点，设置光束重合并更新它们的 z 坐标（见注释 5）。
或者，如果使用 GIS 针添加额外的铂涂层，请执行以下操作：
去一个远离加载网格的地方。为方便起见，将坐标保存为“冲出点”，方便以后调用该位置。
锁定载物台位置。
拍一张缩小的照片，确保舞台不在视野范围内。
作为冲洗步骤，插入 GIS 针并打开阀门约 15 秒。
拍照以确保针已插入。
缩回针头并解锁载物台位置。
拍照以确保针头已缩回。
调用铣削位置。
将 Z 高度设置为 eucentric +2 mm。
锁定载物台位置。
插入 GIS 针并打开阀门约 3–5 秒。
缩回针头并拍照以确保它缩回。
解锁舞台位置。
注意：在每个铣削步骤之间，必须检查散光和焦点远离铣削区域。
在不影响 FIB 光束视野的情况下，将舞台角度设置得尽可能低（见注释 6）。
将 SEM 成像条件设置为 5 kV 和 27 pA，以便准确评估薄片厚度。
将光束强度设置为 1 nA，将铣削模式设置为“清洁横截面”（CCS），并选择“ Si-ccs ”应用程序，驻留时间为 1 μs，Z 尺寸介于 1 和 3 μm 之间（图 4D 和表 1） , 直到初始薄片厚度约为 3 μm。
将光束强度设置为 0.5 nA（图 4D 和表 1）。
注：根据Schaffer 等人的说法。 (2017) ，为了获得厚度均匀的薄片，在分别铣削底面和顶面时，必须前后摇动薄片。
增加角度 +1° 并剃掉薄片顶部约 1 μm（表 1）。
增加角度 -1° 并刮掉薄片底部约 1 μm（表 1）。薄片应约为 1 μm 厚（图 4D）。
将光束强度设置为 100 pA（表 1）。
增加角度 +0.5° 并剃掉薄片顶部约 200 nm（表 1）。
增加角度 -0.5° 并剃掉大约薄片底部 200 nm（表 1）。薄片应约为 600 nm（图 4D）
将光束强度设置为 30 pA（表 1）。
将角度设置为原始铣削角度并削掉薄片的顶部，直到达到其最终厚度约为 200 纳米（图 4D）。
或者，为了达到最终厚度，光束强度可以设置为 10 pA。
注意：重要的是设置光束重合，以便能够监测薄片厚度，特别是在薄片变薄且非常脆弱的铣削最后阶段（更多详细信息，请参见注释 7）。
对网格上的其他铣削目标重复步骤 D12 到 D23。
切换到其他网格时，将舞台角度设置为 0 并平移到其他网格。
注意：为了便于导航，请保存左右网格槽位置，以便轻松调用这些位置。
重复步骤 D8 到 D23 以筛选和铣削另一个网格。
完成两个网格的筛选后，将舞台角度设置为 0°，然后回到加载位置。
注意：为了便于导航，加载位置也应保存以便于调用。
关闭电子束和 FIB 束的阀门。
用传输杆取出穿梭机并将其传输到低温制备室。
将穿梭机转移回预冷的准备井中。
将网格固定回网格盒中。
对于加载和筛选/铣削新网格，重复步骤 D4 到 D31。
Cryo-ET 筛选和倾斜系列采集

注意：只会强调加载网格以观察薄片的关键点。可以在网上找到深入的信息 ( https://em-learning.com/login/index.php )。此演练与使用通过 SerialEM 操作的 Titan Krios cryo-TEM 相关，SerialEM 是一种高度模块化、可编写脚本的软件（马斯特罗纳德，2003 年）。此处详细介绍的获取倾斜系列的步骤适用于Nicolas 等人执行的薄片数据采集。 ( 2022 年) 。要更全面地了解不同使用选项的作用以及它如何集成到可能的断层扫描工作流程中，请参阅https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/hlp/html/main_index.htm和 SerialEM 视频系列https://www.youtube.com/playlist?list=PLGggUwWmzvs-DV4jCapSl5XQ-hpAXtzMb 。
预冷装载站和 NanoCab（图 5A，视频 3，步骤 1 和 2）。

图 5. 在 Krios 中加载 FIB 铣削网格。 ( A ) 装载站的全局视图。 ( B )顶部：装载站井的顶视图，显示自动网格钳（红色）、包含三个网格的开放网格框（蓝色）、前一个用户的网格（黄色）和 Krios 盒（橙色轮廓）。底部：盒子的顶部和侧面图（分别为左侧和右侧），带有一个网格槽的放大视图，以显示盒子中网格的方向。绿色箭头显示自动网格的样品侧应如何朝向 Krios 盒的尖端（与手柄抓住的一侧相反，蓝色箭头）；这两个点是 FIB 自网格上的两个地标，指示缺口的轴。它们应水平放置在盒中。 ( C ) SerialEM 中的低剂量控制面板。打勾的红色方块表示低剂量模式处于活动状态。绿色矩形是用于可视化焦点和试验点的单选按钮。蓝色矩形允许在定义为“查看”、“聚焦”、“试用”、“记录”和“搜索”的不同成像模式之间切换。 ( D ) 整个网格的图集蒙太奇。 ( E ) 查看薄片的图像（ × 2,250 放大倍数）。另见视频 3。

视频 3。在 Krios 中加载铣削网格。加载过程分为五个步骤：i）加载站的冷却，ii）NanoCab 的冷却，iii）加载站中网格盒的传输，iv）Krios 盒中网格的加载，以及 v ) 在 Titan Krios 显微镜中加载 Krios 暗盒。请注意，此视频中的实验者没有佩戴推荐的防护眼镜和绝缘手套。

在传输站中传输带有铣削网格的网格框（视频 3，步骤 3）。
将网格放入盒子的槽中，使薄片的长轴垂直于网格支架的倾斜轴，使槽 #1 空闲（交叉分级网格常用的槽）（参见注释 8，图5B，和视频 3，步骤 4)。
使用加载站中的手柄，夹住盒并将其推入 NanoCab（视频 3，步骤 4）。
将 NanoCab 转移到显微镜的扩展坞并加载盒式磁带（视频 3，步骤 5）。
装入盒式磁带后，让盒式夹持器冷却至 < -165° 并开始盘点盒式磁带。
加载网格。
在低剂量面板中，勾选低剂量模式（图 5C，红色方块）。
生成网格的低倍率（搜索模式，x82）图集以发现薄片（图 5D）： Navigator > Open （将打开一个新的Navigator面板）； Navigator > Montage & Grids > Setup Full Montage （见注释 9）；选择文件的占位符和图集文件的名称。
蒙太奇控制 > 开始。
斑点好看的薄片：由于玻璃化失败没有六角冰，由于失透没有立方冰，电子透明（清晰）。获取薄片的视图图像 ( × 2,250)（图 5E）。确保薄片出现垂直（垂直于倾斜轴）。
拍摄薄片的视图图像并确保它居中。
将舞台设置为 eucentric 高度： Tasks > Eucentric – Rough。在Navigator面板中，选择与 lamella 和Update Z对应的对象。
注意：定期保存导航器面板以防 SerialEM 崩溃：Navigator > Save as...
在继续之前，进入薄片附近的空白区域，导航器面板 >添加舞台位置以记录此空白区域以调整光束。
转到工作放大倍率（记录或预览），居中/调整能量过滤器，并使用Gatan DM3 软件在计数模式下执行增益/暗参考。
Tasks > Setup Autocenter...设置Autocenter beam功能。退出低剂量模式并按照说明进行操作。设置完成后返回低剂量模式。现在， Tasks > Autocenter Beam将通过聚焦光束和进行边缘检测来使光束居中。
导航器面板中的锚图功能定义将获取倾斜系列的感兴趣区域（参见注释 10）。如果正确完成，锚贴图应在薄片的视图图像上显示为蓝色轮廓。
Camera & script panel > view以获得具有采集区域（蓝色矩形）的薄片的全局视图。
导航器面板 > 选择第一个Sec 0 – AnchorHM.mrc项目，勾选倾斜系列> 在弹出面板中设置倾斜系列采集参数，并定义倾斜系列参数（参见注释 11，图 6A，强制参数的绿色矩形和蓝色用于可选控制沿倾斜系列分布的剂量的矩形）。

图 6.设置倾斜系列采集参数。（一）倾斜系列采集窗口。绿色矩形是要设置的最低限度参数。在此示例中，倾斜系列 ±50°，基本增量为 3°，使用剂量对称方案（参见红色剂量对称弹出窗口和下面的描述），目标散焦为 -8 μm。或者，可以将曝光设置为根据倾斜角度变化，以便最佳地分配剂量（蓝色矩形）。在剂量对称面板中，至少需要设置两个参数（绿色矩形）。在此示例中，初始组大小设置为 5，交替设置为以 30° 结束。这意味着从 0 到 ±30°，平台将每五个倾斜图像来回摇摆。 30° 后，平台将从 ±30° 线性移动到 ±50°。 ( B )在项目窗口获取。要激活的典型复选框以红色突出显示。这意味着载物台将调用要获取的区域的位置，使用锚图作为参考对齐它（重新对齐到项目），自动将光束居中，对该位置进行粗略和精细的同心度，进行自动对焦，然后开始倾斜系列。获取所有倾斜系列后，阀门将关闭。 ( C ) 在细胞壁薄片上获得的冷冻断层扫描切片。长棒状密度是纤维素纤维。 ( D ) 由 EMAN2 CNN 生成的概率图切片，经过训练可以识别断层照片上的纤维素纤维，例如 (C)。 ( E ) AMIRA 从 CNN 地图（如 (D)）生成的基于模板匹配的矢量场。这些矢量场用于提取用于分析的每根光纤参数。

勾选编辑焦点并检查焦点/试验点是否与要获取的另一个倾斜系列不重叠，并且它在倾斜轴上。
重复步骤 E19 到 E20 以设置剩余的倾斜系列。
要编辑选择倾斜系列的参数，导航器面板 > TS 参数。
设置所有倾斜系列后， Navigator > Acquire at items并勾选Rough eucentricity 、 Fine eucentricity 、 Autocenter beam 、 Realign to item和Autofocus ；获取倾斜系列并在需要时勾选最后关闭柱阀（图 6B，红色方块）
在随后的薄片上重复步骤 E12 到 E23。

数据分析

注意：断层扫描重建、CNN 训练和纤维追踪的详细描述超出了本协议文件的范围，该协议文件侧重于样本准备和数据采集。相反，我们邀请读者访问以下页面以了解不同的数据分析步骤：

断层重建

ETOMO重建教程请访问（ https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/patchTrackExample.html ）。图 6C 显示了洋葱细胞壁的重建断层扫描图示例。
对于ARETOMO自动对齐和重建教程和手册，请访问https://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3并参考Zheng 等人。 (2022) （见附注 12）。另请参阅以下用于使用 ETOMO 和 ARETOMO 进行批量对比度传递函数校正和重建的脚本：http: //dx.doi.org/10.13140/RG.2.2.31326.31043 。
EMAN2自动对齐重建教程，请访问https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/e2tomo （见注12）。

CNN训练与应用

如需使用 EMAN2 训练和应用 CNN，请访问https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/tomoseg以获取完整教程。洋葱细胞壁的 CNN 分段图示例如图 6D 所示。

使用 Amira – Xtracing 插件追踪纤维

要了解用于追踪纤维的参数的重要性，请参阅（Rigort 等人，2012）。
有关在断层图中检测纤维的完整运行，请参阅 Xtracing 扩展的 Amira 帮助文档。图 6E 显示了洋葱细胞壁的纤维追踪图示例。

笔记

白洋葱、新鲜洋葱和硬洋葱是首选。如果可能的话，选择大洋葱将允许更多的材料。在这项研究中，洋葱通常是在冷冻前一天购买并存放在冰箱中的。由于洋葱之间的有效去皮不一定一致，因此最好每次都买几个洋葱，以防一个洋葱剥得不好。
EM 网格盒有多种形状和形式。传统上，它们容纳四个网格。为避免污染，最好的是带缺口盖子的盖子，一次可以打开一个插槽（ Mitegen #M-CEM-CGBSW1 和/或 M-CEM-71166-10）。 Autogrid 网格框编号 1 到 4 适用于存储裁剪网格 ( Mitegen M-CEM-7AGB)。
使用了不同类型的网格。考虑的目标是避免在果皮下积聚未吸干的水，从而导致要研磨的样品的总厚度增加，进而阻碍薄片的产生。测试了非薄膜网格（仅铜网格）。尽管提供了非常好的印迹结果，但细胞壁不受碳支撑，这在研磨的最后阶段导致不稳定，通过最终薄片的振动转化，不可能减薄到最终厚度。 Quantifoil R17/5（直径为17 μ m 的孔，孔间距约为 5 um）提供了非常好的印迹结果和薄片抛光稳定性。因此，我们建议使用 Quantifoil R 17/5 网格 (EMS # Q210CR175) 或 R 2/2，这也是一个很好的折衷方案 (EMS # Q250CR1)。
洋葱表皮细胞以各向异性方式伸长，形成类似矩形的形状。将果皮呈现给 FIB 枪，使矩形细胞的长边平行于 FIB 光束路径，与垂直于 FIB 光束呈现时相比，可以在 periclinal 细胞壁上铣削更多空间。将细胞壁的小矩形切口（B7 部分）拖到 London Finder Quantifoil 网格上，使网格上的长箭头（槽口）与矩形果皮的长边平行（图 2C）。然后，在裁剪阶段，重要的是将 Quantifoil 网格上的箭头与自动网格的槽口对齐（图 3）。
Eucentric 高度很重要，以便能够在不使铣削目标发生明显的 x 和 y 偏移的情况下倾斜平台。它可以首先通过在工作放大倍率下瞄准污染来设置。从 0° 开始并将扫描时间设置为非常快。以 5° 为增量增加倾斜角度，直到 20°，并使用 Z 滑块使每个增量重新居中目标。重要的是不要在过程中移动 x 和 y，而只是移动 z 中的阶段。
为了进一步调整，建立光束重合以使铣削目标位于 SEM 和 FIB 光束重合的高度。这对于使用 SEM 光束连续监测铣削进度非常有用。为此，请以具有 SEM 光束的特征为中心，以 FIB 光束为图像，并通过更改样品的 Z 高度（偏移量应仅垂直）以同一特征为中心。然后，使用 x 和 y 移动并重复操作，直到两个图像重合在同一点上，使 SEM 光束重新集中在特征上。请注意，这需要在每个目标上完成。
设置光束重合后，以 1° 增量减小舞台角度并检查 FIB 图像。只要图像清晰且前景中没有扭曲或暗物体，就继续减小角度。一旦图像底部出现扭曲或深色物体遮挡图像底部，则角度太低。具有清晰图像的最后一个角度是可用于铣削的最浅角度。
虽然有些专门使用 FIB 视图来监测薄片厚度，但 SEM 视图可以告知薄片的厚度均匀性以及整体形状和长度。重要的是使用电压和电流的组合来监测薄片的厚度，以产生尽可能小的交互体积。大约 5 kV – 27 pA 是合适的。在此设置下，大约 200 nm 的薄片将呈现均匀的黑色（图 4E）。当达到这种色调时，认为薄片已准备好进行冷冻 ET。
对于完整的 ±60° 范围内的薄片倾斜系列采集，有必要将薄片的短边平行于显微镜中测角器的倾斜轴定位。在装有标准网格盒的 Thermo Fisher 显微镜中，这是通过定位 FIB 铣削槽口或溅射涂层标记（仅当样品在 PP3000T 型梭中溅射涂层时才有可能）或两个黑色连续点来完成的FIB autogrid 侧身在装载盒中（图 5B）。
本研究使用的放大倍率如下： × 82（搜索模式）、 × 2,250（查看模式）和× 26,000（记录、预览、试用和记录模式）。
要管理多个放大倍率，可以使用Navigator > Imaging states来存储成像状态（放大倍率、照明区域、第一聚光镜参数等）。
要即时修改成像模式：
低剂量控制”面板> “转到（选择的查看模式）”中进入此成像模式。
Camera&Script面板 > 单击相应的成像模式以相应地设置显微镜并记录图像 > Low Dose Control面板 > 勾选“连续更新” > 使用Intensity旋钮调制 C2并检查剂量率 > 取消勾选“连续更新。 ”
要设置锚定图像，文件>打开新建并创建两个文件， AnchorHM （用于高倍率地图）和AnchorLM （用于低倍率地图）。
转到第一个感兴趣的区域（导航器面板 >转到 XY ）。
Buffer Control panel > Go through open files with“ To file ”将活动文件设置为AnchorHM （在SerialEM的顶部窗口栏中可见）。
相机和脚本面板 >预览。
缓冲区控制面板>“保存活动”。
导航器面板 >新地图。
Buffer Control面板>“ To file ”将活动文件设置为AnchorLM。
相机和脚本面板 >查看。
缓冲区控制面板>“保存活动”。
导航器面板 >新地图。
Navigator面板 > 勾选“ for anchor state ”。
转到第二个感兴趣区域（导航器面板 >转到 XY ）。
Buffer Control面板>“ To file ”将活动文件设置为AnchorHM。
采集面板 >预览。
缓冲区控制面板>“保存活动”。
导航器面板 >新地图。
导航器面板 >锚点地图。这将自动将AnchorLM设置为活动文件。拍一张View图像，保存它，然后制作一个新的锚点图。
转到第三个感兴趣的区域（导航器面板 >转到 XY ）。
确保活动文件是AnchorHM。
相机和脚本面板 >预览。
导航器面板 >锚点地图。
对所有其他感兴趣的领域重复最后四个要点。
设置倾斜系列采集参数时，主要目标是将感兴趣的区域暴露在尽可能低的总剂量下，这会随着时间的推移损坏样品，但也要处于探测器的最佳剂量范围内，以便对电子进行计数准确（大约 15 e - /px/s 在相关双采样模式，CDS 采样后的剂量率）。对于在大约 200 nm 厚的薄片上采集的倾斜系列，80 e - /A 2总剂量效果很好。为了计算样品将暴露的总剂量，我们使用以下等式：

(Before sample dose rate ((e^-/px)/s)*Exposure time (s)*# of exposures)/(〖pixel size〗^2 (A^2))

通过前往薄片附近的空白区域并获取预览或记录图像以读出 e - /px/s中的剂量率来测量前样本剂量率。
曝光时间通过采集面板 >设置参数>曝光时间设置。可以相应地修改此参数以降低总剂量。
曝光次数 (#)由倾斜范围和倾斜增量定义：
倾斜范围通常设置为±60°或±50°。
增量设置为 3°。
像素大小取决于放大倍数。像素尺寸越小（放大倍数增加），总剂量就越高。
对于倾斜方案，该协议的相关研究使用了从 0° 开始的双向方案。如今，使用剂量对称方案（图 6A，红色插图）获取是标准的，以便在高分辨率细节被电子束破坏之前优先考虑较低的倾斜度。剂量对称方案的以下默认参数运行良好：
初始组大小：5。
停止从初始角度超过 30° 的交替方向。
完成后在后台重新排序文件。

食谱

HEPES 缓冲液（HEPES 20 mM + Tween-20 0.1%，pH 6.8，50 mL）
238 毫克 HEPES 粉末
50 μ L Tween-20 100%
足够 50 mL 的去离子水用量
pH 6.8，KOH 1 M
该缓冲液可以提前制备并在室温下储存。使用前确保没有沉淀物。

CAPS 缓冲液（50 mM，pH 10，50 mL）
553 毫克 CAPS 粉末
足够 50 mL 的去离子水用量
pH 10，NaOH 1 M
该缓冲液可以提前制备并在室温下储存。使用前确保没有沉淀物。

4.7 U/mL (5 mL) 的果胶酸裂解酶
8 μ L 商业溶液（保持在 4 °C ）（参见配方 2）
将果皮孵育三个小时。
酶溶液总是新鲜制备并在使用前保存在冰上。

BAPTA 2 毫米（50 毫升）
48 毫克 BAPTA 粉末
足够 50 mL 的去离子水用量
该溶液始终是新鲜制备的，并且可以在实验期间保持在室温下。

致谢

与该协议相关的工作得到了霍华德休斯医学研究所 (HHMI) 的支持，并向 Grant J Jensen 和奥地利科学基金 (FWF) 授予 R35 GM122588：P33367 给 Florian KM Schur。 Cryo-EM 工作是在加州理工学院贝克曼研究所透射电子显微镜资源中心完成的。
本文受 HHMI 的出版物开放访问政策的约束。 HHMI 实验室负责人此前已向公众授予非排他性 CC BY 4.0 许可，并在其研究文章中向 HHMI 授予可再许可许可。根据这些许可，本文作者接受的手稿可以在 CC BY 4.0 许可下免费提供，一经发布。

利益争夺

不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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