材料与试剂

1. Nunc 96 孔 U 型底（ Thermo Fisher，目录号：268200）
2. 注射器 Plastipak TM 20 mL Luer -Lok TM （BD，目录号：302237）
3. 0.2 µm 过滤器（Sigma-Aldrich，Millipore，目录号：SLGP033RS）
4. 50 mL 离心管（Sigma-Aldrich，Greiner，目录号：T2318-500EA）
5. 1.5 mL Eppendorf Safe-Lock 管（ Eppendorfs ，目录号：0030120086）
6. SnakeSkin TM透析管，10K MWCO，22 mm（ Thermo Fisher，目录号： 68100）
7. SnakeSkin TM透析夹（ Thermo Fisher，目录号： 68011）
8. Protein G Sepharose 4 Fast Flow，5 mL（Sigma-Aldrich，目录号： GE17-0618-01 ）在 4 °C 下储存
9. Econo-pac色谱柱，每包 50 个（Bio-Rad，目录号： 7321010）
10. 2 路旋塞阀（Bio-Rad，目录号：7328102）
11. Viaflo中用于输注的复合乳酸钠溶液 BP（Hartmann 输注溶液），1,000 mL（Baxter，目录号： FKE2324）
12. Bradford 试剂（Sigma -Aldrich，目录号： B6916）
13. 绝对乙醇，分子生物学级，500 mL（ ThermoFisher ，目录号：16606002）
14. 蔗糖，分子生物学级（ Thermo Fisher Scientific 的 AlfaAesar，目录号： J65148.A1 ）
15. Trizima基地（ ThermoFisher ，目录号：BP152-500）
16. 甘氨酸（Sigma -Aldrich ，目录号：50046）
17. HCl（Sigma -Aldrich ，目录号：H1758 ）
18. 中和缓冲液： Trizma base 1 M (pH 8.0)（参见配方）
19. 洗脱缓冲液：甘氨酸 100 mM (pH 2.3)（参见配方）
20. 储存缓冲液：20% 乙醇（见配方）
21. Viaflo中的 Hartmann 输注溶液（复合乳酸钠），1,000 mL （参见配方）
设备

1. pH 计 Mettler Toledo TM FiveEasy TM F20 pH/mV 计（Mettler Toledo，目录号：15543360）
2. 离心机 5810R（Eppendorf，目录号：5811000465）
3. PIPETMAN 经典入门套件，P20、P200、P1000（Gilson，目录号： F167300)
4. 实验室支架型号 SBS-LS-100（ Expondo ，目录号：EX10030473）
5. 硼硅酸盐玻璃高脚杯 2 L（ ThermoFisher ，目录号： 15499083)

程序

A. 蛋白 G 柱的制备

1. 在 50 mL 试管中的 50 mL Hartmann 溶液中重悬两瓶蛋白 G 琼脂糖凝胶（每瓶 5 mL）。
2. 41离心 × g 5 min，轻轻倾析倒掉哈特曼氏液，加入新鲜哈特曼氏液加满50 mL试管；重复两次。
3. 100% 乙醇清洗色谱柱，然后使用Hartmann 的解决方案。
4. 用塑料巴斯德吸管将蛋白 G 溶液添加到柱子中，直到柱子满为止。双向旋塞阀应关闭（水平）以避免蛋白 G 的损失。蛋白 G填充柱的长度应为 6-8 厘米（空柱为12 厘米）。
5. 打开双向旋塞阀（垂直）让所有的溶液慢慢流下来（让蛋白G沉积在柱子的底部）。不要让蛋白质 G 干燥，始终在珠子顶部留下至少 1 mL 的 Hartmann 溶液（图 1A）。

B. 通过蛋白质 G 柱运行样品

1. × g离心15 分钟，以在稀释前去除微粒。可能需要第二次离心来实现这一点。
2. 在 Hartmann 溶液中稀释血清 1:3：20 mL 血清和 40 mL Hartmann 溶液，总共 60 mL 稀释血清。
3. 用塑料巴斯德吸管将稀释的血清 (60 mL) 添加到柱中。使血清缓慢流过柱子，将旋塞阀调整到半关闭状态 1 滴/秒，并在计时器上设置 1 分钟（1 mL IgG 应在 1 分钟内通过柱子）。首先，用血清加满柱子，然后打开旋塞阀开始纯化。继续加满柱子，直到所有血清都转移到柱子中。
4. 将稀释的血清缓慢（1 毫升/分钟）运行通过，并在 50 毫升试管中收集流过的液体。
5. 通过列运行流量，然后丢弃或存储流量以供进一步分析（图 1B）。

C. 用 HS 清洗任何非特异性结合

1. 运行 60 – 100 mL 的 H artmann 溶液，以洗去任何非特异性结合（图 1C）。
2. Bradford试剂检查 IgG 的 Hartmann 流出液：使用 96 孔板的孔，将 20 μL洗脱液重悬于 100 μL Bradford 试剂中。继续添加 Hartmann 溶液，直到检测不到蓝色，然后开始用甘氨酸洗脱（程序 D）。蓝色表示柱中仍有其他未结合的蛋白质（不是 IgG）应在洗脱前去除。

D. 用甘氨酸 pH 2.3 和 Tris pH 8.0 洗脱

1. 将 30 个 Eppendorf 管 (1.5 mL) 放在冰上。将 100 μ L 的 1 M Tris，pH 8.0 添加到每个管中（图 1D）。
2. 将 30 mL 的 100 mM 甘氨酸 pH 2.3 添加到柱中，并将900 μL的流量洗脱到每个准备好的管中。使甘氨酸缓慢通过柱子，将旋塞阀调整到半关闭状态，持续 1 滴/秒，并在计时器上设置 1 分钟（1 mL IgG 应在 1 分钟内通过柱子）。首先，用甘氨酸加满柱子，然后打开旋塞阀，从第一管开始洗脱。当柱子需要加满时，关闭旋塞阀并加入甘氨酸，如上所述。 S hake 每个分数，用 Tris 中和甘氨酸并保护样品。通常，前四管中没有 IgG。
3. 使用 Bradford 测定法检查所有管中是否存在 IgG：使用 96 孔板的 30 孔用 100 μL的 Bradford 试剂从每个管中重新悬浮 20 μL的洗脱溶液。最后一根管子应该没有蓝色。
4. 将高度浓缩的馏分（如深蓝色所示）汇集到一个 50 mL 试管中。对于 20 mL 血清（在 40 mL Harmann's中稀释= 60 mL 整体溶液），产量应约为 20 管。
5. 运行 60 mL 的 Hartmann 溶液（1 mL/min）以从柱中去除任何残留的甘氨酸。
6. 如在步骤 D3 中一样，使用 Bradford 测定法检查流出液中是否没有甘氨酸。
7. 将色谱柱储存在 4°C 的 20% 乙醇中，以防止污染。同一列最多可使用五次。

图1. IgG 纯化步骤。 A. 色谱柱准备。用 20 mL 的 100% 乙醇清洗柱子，然后用 20 mL 的结合缓冲液 (HS) 清洗柱子，然后将小瓶中的蛋白质 G Sepharose 浆料添加到柱子中。 B. 血清运行。将稀释的血清缓慢应用于柱两次 (1 mL/min)。 C.柱洗涤。在 100 mL 的结合缓冲液中清洗蛋白 G 珠。 D. 通过向柱中加入 20 mL 100 mM 甘氨酸 pH 2.3 洗脱结合的 IgG 级分，并收集到 20 个预装有 Tris 缓冲液的试管（1.5-mL Eppendorf 试管）中。 E. IgG透析。使用 10 kDa透析膜在哈特曼溶液中在 4°C 下过夜透析纯化的 IgG 。 F. IgG 浓度。将 IgG 从烧杯中移至托盘中，盖上蔗糖并放置直至达到合适的浓度；大约 20 分钟后，蔗糖开始缓慢液化，样品在 1 小时后浓缩 2 倍。 G. IgG 聚集体。在过夜透析过程中可能会形成 IgG 聚集体（红色圆圈），但可以通过以 657 × g旋转10 分钟来去除这些聚集体。

E. 透析

1. 用 1 L 的 Hartmann 溶液填充烧杯。
2. 切割大约 10 厘米的蛇皮透析管，将一端折叠起来，并用夹子固定。然后，将 IgG 溶液移入其中，留下大约额外的三分之一体积的空气。
3. 折叠顶部并用夹子固定。
4. 将透析袋放入烧杯中，并将其放在 4°C 的搅拌器上，让样品透析过夜（图 1E）。

F. 蔗糖浓度

1. 将透析制剂从烧杯中移至托盘中，盖上蔗糖，然后静置直至样品达到正确的浓度——确切时间将取决于透析样品的起始浓度，因为这可能需要几个小时，而且1 小时后可能需要更换蔗糖（图 1E）。
2. 将样品转移到 50 mL 试管中。
3. 657离心样品 ×克 10 分钟并将 IgG 溶液转移到新管中以去除聚集体。聚集体可能稍后仍会形成，但可以在657处通过另一次旋转将其移除 × g 10 分钟（图 1G）。
4. 通过 0.2 过滤样品 μm过滤器。
5. 将 IgG 样品储存在 4 °C 。

数据分析

在纯化、透析和蔗糖浓缩后使用 Nanodrop 2000 测量 IgG 浓度。
1. 打开 Nanodrop 2000 软件并选择蛋白质 280。然后选择“IgG”作为样本类型。
2. 1.5 μ L 的 Hartmann 溶液吸移到下部测量基座上，然后单击“空白”以测量空白。
3. 用纸巾清洁残留的 Hartmann 溶液。将1.5 μ L 的 IgG 溶液移至较低的测量基座上，然后单击“测量”以测量样品。
4. OD 280图以及 IgG 浓度（图 2）。
5. 从血清中纯化的人 IgG 浓度为 7 mg/mL 至 10 mg/mL，而从血浆中纯化的人 IgG 浓度为 5 mg/mL 至 7 mg/ mL。
6. OD 280图用于评估纯化程序的特异性和定量产量。特别是，OD 260/280比率用于检查样品纯度和可能被核酸污染（260 处的吸光度）。 OD 260/280小于 0.60 表示纯蛋白质产量。 Hartmann 溶液（盐缓冲液）用作 IgG 缓冲液，有助于最大程度地减少核酸的存在。

图 2.纯化的 IgG OD 280图。红色箭头表示盐（230 处的吸光度）、DNA 和 RNA（260 处的吸光度）和 IgG（280 处的吸光度）。高盐峰是由哈特曼溶液（IgG 缓冲液）中的盐引起的。 OD 260/280比率为 0.51，IgG 浓度为 10.10 mg/ mL。

笔记

影响 IgG 结合和稳定性的因素
由于夏季实验室温度波动相关的问题（空调故障），最初偶然在高室温（30 °C ）或标准室温（20°C）下纯化了 IgG。随后，合作小组发现在 30 °C 下纯化的 IgG 溶液在体内实验中没有活性，这表明非常高的室温可能对 IgG 与蛋白 G 的结合或 IgG 稳定性产生负面影响，因为制造商建议室温 (20 °C) 为最佳。
影响 IgG 结合和稳定性的另一个因素是pH 值。蛋白 G 洗脱过程中通常使用低 pH (2.5 – 3.0)来破坏抗原和抗体之间的离子键和氢键。用于该项目的IgG在较低的 pH 值 2.3 下洗脱，以实现更完整的洗脱产量。
其他可能对 IgG 与蛋白 G 结合产生负面影响的因素包括蛋白 G 珠子冷冻（冷冻可能导致蛋白 G 从琼脂糖珠子上分离）和柱流速（高流速导致 IgG 损失，因为 IgG 没有足够的时间结合蛋白 G 上的 Fc 受体）。最后，根据制造商的说明，G 蛋白树脂的任何干燥因素都会导致 G 蛋白与琼脂糖珠分离，从而显着降低 IgG 产量。

食谱

1. 和缓冲液： Trizma base 1 M (pH 8.0)
溶解 60.57 g 400 mL ddH 2 O中的Trizma碱置于带有磁力搅拌器的烧杯中。
通过添加 HCl 将 pH 值调整到 8.0。
使用 ddH 2 O将音量调整为 500 mL。
在室温下储存长达 1 年。

2. 洗脱缓冲液：甘氨酸 100 mM (pH 2.3)
3.785克甘氨酸溶解在 400 mL 的 ddH 2 O 中，并将其置于带有磁力搅拌器的烧杯中。
通过添加 HCl 将 pH 值调整到 2.3。
使用 ddH 2 O将音量调整为 500 mL。
存储在 4 °C 长达 3 个月。

3. 储存缓冲液：20% 乙醇
将 20 mL 的 100% 乙醇与 80 mL 的 ddH 2 O混合。
储存在 4°C。

4. 洗涤缓冲液
Viaflo中的 Hartmann 输液（复合乳酸钠）溶液，1,000 mL

致谢

这项工作得到了英国利物浦止痛基金会的资助。

利益争夺

作者声明，他们没有已知的可能影响本文报告的工作的竞争经济利益或个人关系。

伦理

用于 IgG 纯化的血浆样品是在血浆交换疗法 (PTE) 后获得的，使用废血浆不需要伦理批准（15/NW/0467，西北- 海多克研究伦理委员会）。
用于 IgG 纯化的血清样本是在伦理许可和个人同意下获得的，用于自身抗体研究（12/EE/0164，英格兰东部）。

参考

Cuhadar , U.、Gentry, C.、 Vastani , N.、Sensi, S.、Bevan, S.、Goebel, A. 和 Andersson, DA (2019)。自身抗体通过使伤害感受器敏感在复杂的局部疼痛综合征中产生疼痛。疼痛160(12)：2855-2865。
Goebel, A., Krock , E., Gentry, C., Israel, MR, Jurczak , A., Urbina, CM, Sandor, K., Vastani , N., Maurer, M., Cuhadar , U., et al . (2021)。纤维肌痛症状从患者到小鼠的被动转移。 J 临床投资131(13)。
Helyes , Z., Tekus , V., Szentes , N., Pohoczky , K., Botz , B., Kiss, T., Kemeny , A., Kornyei , Z., Toth, K., Lenart , N.,等。（2019）。通过人类自身抗体将复杂的局部疼痛综合征转移给小鼠是由白细胞介素 1 诱导的机制介导的。 Proc Natl Acad Sci USA 116(26)：13067-13076。
Pohoczky , K., Kun , J., Szentes , N., Aczel , T., Urban, P., Gyenesei , A., Bolcskei , K., Szoke , E., Sensi, S., Denes, A.,等。 (2022)。通过转录组学发现复杂区域疼痛综合征小鼠模型中的新靶点：TNF 和 JAK-STAT 通路。药效学研究182：106347 。