材料和试剂

1. 2 mL 安全锁微量离心管（ Axygen ，目录号：MCT-200-C）
2. PCR 板热封，箔，可刺穿（Bio-Rad，目录号：1814040）
3. ddPCR板，96 孔，半裙边（Bio-Rad，目录号：12001925）
4. 用于 QX200 TM /QX100 TM液滴发生器的DG8 TM墨盒（Bio-Rad，目录号：1864008）
5. 液滴发生器 DG8 TM垫圈（Bio-Rad，目录号：1863009）
6. 限制酶EcoRI （ ThermoFisher ，目录号：FD0274）
7. 核糖核酸酶 A（Sigma，CAS：9001-99-4）
8. 无核酸酶水（ ThermoFisher ，目录号：10977015）
9. Qubit TM dsDNA HS 测定试剂盒（ ThermoFisher Scientific，目录号：Q32851）
10. QX200TM _ ddPCR TM 伊娃格林 supermix （Bio-Rad，目录号：1864033）
11. EvaGreen ®的 QX200 液滴生成油（Bio-Rad，目录号：1864005）
12. 5' FAM TM （6-羧基荧光素）（ ThermoFisher Scientific，目录号：C1360）
13. 5' VIC TM (6-VIC)（AAT Bioquest ，目录号：212）

设备

1. Qubit TM 4 荧光计（ ThermoFisher Scientific，目录号：Q33238）
2. QX200 TM液滴发生器（Bio-Rad，目录号：1864002）
3. 热循环仪（例如，Bio-Rad C1000 Touch 热循环仪，目录号：1851148）
4. 移液器（10 µL、20 µL、100 µL）
5. 热封机（例如，Eppendorf S100，目录号：5391000036）
6. DG8 墨盒架（Bio-Rad，目录号：1863051）
7. QX200 液滴读取器（Bio-Rad，目录号：1864003）
8. 液滴读取器板架（Bio-Rad，目录号：12006834）

软件

1. 引物设计软件：Primer5
2. 序列分析软件： DNAstar ( https://www.dnastar.com/ )
3. QuantaSoft TM软件（Bio-Rad，目录号：1863007）（ https://www.bio-rad.com/ ）
4. 能够读取逗号分隔值 (.csv) 文件的软件：Microsoft Excel
5. Droplet Digital TM PCR 应用指南： http: //www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf

程序

A. 小麦原料的制备

1. 在具有相应条件的室内/温室中种植植物。
注：这里，小麦植物生长在保持在16的生长室中摄氏度 ± 2 °C ，光照时间为 16 小时，黑暗时间为 8 小时，相对湿度为 70%。
2. 在 2 mL 安全锁微离心管中从两周大的小麦植物中收集大约 100 mg 的叶样本，用于基因组 DNA提取。
3. 使用 CTAB 方法从小麦植物叶片中分离总基因组 DNA（Chen 等人，2014）。
4. EcoRI消化每个基因组 DNA 样本，然后进行 RNase A 处理。表 1 显示了一个示例性限制性消化反应。

基因组 DNA的限制性核酸内切酶消化反应示例
成分体积
10×限制酶缓冲液 5微升
EcoR I （10 – 20 U/ μL ） 2微升
基因组DNA 1微克
无核酸酶水高达 50 μL
全部的 50微升

5. 在 37°C 下孵育限制性反应混合物 1 小时，然后加入 1 μL的 RNase A。在 37°C 下孵育 30 分钟后，在 95°C 下加热 10 分钟使混合物失活。灭活后，消化的基因组 DNA 可直接用于下一步，无需进一步清理。

B. 引物选择

1. 小麦嘌呤吲哚-b ( PINb ) 单拷贝基因被用作参考基因来估计转基因拷贝数 (Collier et al., 2017)。目标基因的引物是使用引物设计软件（例如 Primer 5）设计的，该软件可扩增两个转基因目标的 100-120 碱基对区域。目标基因引物和小麦PINb基因引物的例子如表2所示。

表 2. ddPCR中使用的引物
姓名序列长度目标
TaPINb- F AGTTGGCGGCTGGTACAATG 20 小麦PINb基因
TaPINb- R ACATCGCTCCATCACGTAATCC公司 23
TaPINb- proof FAM-TCAACAATGTCCGCAGGAGCG-VIC 23
pubi- F GTAGATAATGCCAGCCTGTTAAC 24 育碧发起人
pubi- R 广汽集团GACGCTGCTGGTT 18
公开证明 FAM-CGTCGACGAGTCTAACGGACACCAAC-维多利亚州 29

2. PCR反应中，首先需要检查每个引物对。使用与来自非转基因小麦植物的基因组 DNA 或 H 2 O 的反应作为阴性对照。如表 3 所示组装反应。

ddPCR引物对的 PCR 反应
成分库存集中度终浓度体积
× QX200TM ddPCR TM 伊娃格林® 超级混音 2× 1× 5微升
正向引物 2微米 250纳米 1.25微升
反向引物 2微米 250纳米 1.25微升
基因组DNA 50纳克
无核酸酶水高达 10 μL
全部的 10微升
3. 用5' FAM TM （6-羧基荧光素）标记参考基因探针，用5 ' VIC TM （6-VIC）标记转基因探针。
4. PCR反应的循环条件如表4所示。

ddPCR引物对的 PCR 循环条件
步温度 ( °C) 时间循环次数
酵素活化 95 5分钟 1个
变性 95 30 秒 40
退火 60 30 秒
扩大 72 30 秒
信号稳定 72 5分钟 1个
抓住 10 ∞ 1个

5. 用琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物。获得具有预期大小的单个清晰条带，用于参考和目标引物（图1）。

图 1. 显示参考和目标引物预期大小的 PCR 产物示例

C. ddPCR设置

1. 如表 5 所示组装 PCR 反应。来自非转基因小麦植物的基因组DNA或H 2 O用作模板作为阴性对照并加入到反应中。参考基因和转基因基因的引物在每个样品的一次反应中混合。在进行液滴生成之前，将测定的ddPCR反应充分混合至关重要。每个液滴中每种成分的浓度必须相同。

表 5. ddPCR反应示例
成分库存集中度终浓度体积
× QX200TM ddPCR TM 伊娃格林® 超级混音 2× 1× 10微升
参考基因正向引物 2微米 250纳米 2.5微升
内参基因反向引物 2微米 250纳米 2.5微升
参考基因正向引物 2微米 250纳米 2.5微升
内参基因反向引物 2微米 250纳米 2.5微升
基因组DNA 50纳克
无核酸酶水高达 20 μL
全部的 20微升

D. 液滴产生

1. 将墨盒装入 QX200液滴发生器。
2. 20 μL的ddPCR反应加载到 DG8 TM液滴发生器盒的各个样品孔中。
3. 将 70 μL用于EvaGreen ®的 QX200 液滴生成油添加到油井中。
4. 用 DG8 TM垫圈盖住墨盒（图 2）。

图 2. 液滴生成的工作流程

5. ddPCR分析所需的纳升大小的液滴。它在大约 2 分钟内一次处理多达 8 个样本。
6. 将液滴乳液的整个体积（通常为 70 μL ）转移到半裙边 96 孔ddPCR板的所需孔中。
7. 根据制造商的说明，使用热封机将 96 孔ddPCR板与可穿透的箔板热封盖在一起。
注意：小心吸取非常缓慢以避免破坏乳化液滴。
8. 将含有 PCR 产物的 96 孔ddPCR板放入热循环仪中，并使用如表 6 所示的循环条件。退火温度由引物的 Tm 值决定（通常比 Tm 值< 5 °C）。

表 6 。 ddPCR的 PCR 循环条件。对所有步骤使用 2 °C/s 的升温速率。
步温度 (°C) 时间循环次数
酵素活化 95 10分钟 1个
变性 94 30 秒 40
退火 58 1分钟
信号稳定 98 10分钟 1个
抓住 10 ∞ 1个

E. 液滴计数

1. PCR 循环完成后，打开QX200 TM液滴读取器并打开QuantaSoft TM软件。
2. QuantaSoft TM软件中打开新实验。
3. 选择需要检测的孔，输入样品名称，并记录每个样品的目标基因和参考基因的孔位。
4. 需要检测的孔中的关键参数如下：
a. 实验：ABS（绝对定量）。
b. Supermix : QX200 TM ddPCR 伊娃格林超级混音。
c. 目标 1 类型：Ch1 未知。
d. 目标 2 类型：Ch2 未知。
e. 输入样本名称以区分转基因和参考基因。
5. 通过单击“确定”将所选参数应用于所选井。
6. 将 96 孔 PCR 板放入板架中，如下所示（图 3）：
a. 将含有放大液滴的 96 孔 PCR 板放入板架底部。 PCR 板的 A1 井必须位于左上角。
b. 将板架顶部的释放卡舌移动到“向上”位置，并将顶部放在 PCR 板上。用力按下两个释放卡舌以将 PCR 板固定在支架中。

图 3. 将 96 孔板放入板架

7. 盖上盖子后，检查“电源”、“瓶位”和“板到位”指示灯是否为绿色。
8. 单击左侧导航栏中的运行以开始运行。
9. 在“运行选项”窗口中，选择检测化学。
注意：如果在孔编辑器中选择了探针超混合液，则会出现探针染料设置；选择 FAM/HEX 或 FAM/VIC。如果EvaGreen 选择 supermix，出现EvaGreen染料设置，屏幕确认板上配置的EvaGreen孔数。

数据分析

1. 读取完成后，单击“分析”按钮对数据进行分析。
2. 单击 1D 振幅按钮以分析从所选井的每个通道收集的数据。单选按钮用于选择通道，并提供用于调整阈值的选项，这些阈值用于为每个通道分配正负值。图 4 显示了一个示例分布。
注意：一次反应应产生 12,000 – 20,000 个液滴。拷贝数的计算依赖于阳性液滴与阴性液滴的比率。

图 4. 示例图显示了六个样品的阳性液滴。绿色和蓝色液滴表示 VIC 和 FAM 探针。 x 轴（事件编号）表示整个实验中测得的液滴数量，y 轴表示荧光的振幅。这些样本的图像发表在之前的一项研究中（P. Liu 等人，2021 年）。

3. 单击“二维振幅”按钮查看通道 1 与通道 2 散点图，并启用选项以手动或自动调整用于为每个通道分配正负的阈值（图 5）。

图 5. 六个示例的液滴在二维中可视化。这个的形象样本发表在之前的一项研究中（P. Liu et al., 2021）。

4. 单击浓度按钮以可视化浓度图中的数据。将浓度数据导出为逗号分隔值 (.csv) 文件。
注意：“拷贝/ μL孔”列显示ddPCR样本中起始材料的总量。
5. 单击复制编号以查看所选孔/样本的复制编号（图 6）。

图 6. 显示计算出的六个示例的转基因拷贝数值。这些样本的图像发表在之前的一项研究中（P. Liu 等人，2021 年）。

6. 单击 Ratio 按钮查看所选孔/样本的比率数据。使用比率按钮选择比率图（未知：参考）或分数丰度（样本百分比）。
7. 单击事件以查看为选定的井/样本计算的液滴事件数。

致谢

我们感谢中华人民共和国农业部 (CARS-03)、中国国家自然科学基金 (32100126、31901954)、中国宁波科技创新 2025 重大项目 (Q21C140013) 对中国农业研究系统的资金支持，中国浙江省自然科学基金 (LQ20C140002) 和 KC Wong Magna 资助宁波大学。开发该协议是为了在先前的研究中生成转基因拷贝数（P. Liu 等人，2021）。

利益争夺

没有要申报的竞争利益。

参考

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